הכנה ואפיון של נוזל HDL מחקה ננו-חלקיקים עבור אנקפסולציה גורם העצב הגדילה

Summary

Homogenization פשוט שימש להכנת רומן, צפיפות גבוהה, lipoprotein- חיקוי חלקיקים כדי לתמצת את גורם הגדילה העצבים. אתגרים, פרוטוקולים מפורטים להכנת nanoparticle, אפיון במבחנה , וכן ב vivo מחקרים מתוארים במאמר זה.

Abstract

מטרתו של מאמר זה היא להציג שיטות הכנה ואפיון עבור ננו-חלקיקים (NP) של גורם הגדילה העצבי (NGF) - נטען, בצפיפות גבוהה, ליפופרוטאין (HDL). HDLs הם NPs אנדוגני ו כבר נבדקו כמו כלי רכב עבור משלוח של סוכני טיפול. שיטות שונות פותחו כדי להכין HDL מחקה NPs. עם זאת, הם בדרך כלל מסובך, זמן רב, וקשה עבור התעשייה בקנה מידה. במחקר זה, צעד אחד homogenization שימש לערבב את excipients וליצור את NPs אב טיפוס. NGF הוא חלבון מסיס במים של 26 kDa. כדי להקל על אנקפסולציה של NGF לתוך הסביבה שומנים של HDL חיקוי NPs, protamine USP שימש ליצירת מורכבות זוג יון עם NGF לנטרל את החיובים על פני NGF. המתחם NGF / protamine הוכנס אז לתוך NPs אב טיפוס. Apolipoprotein AI היה סוף סוף מצופה על פני השטח של NPs. NGF HDL - חיקוי NPs הראה תכונות מועדפות בטווחS של גודל החלקיקים, הפצה גודל, יעילות מלכודת, שחרור במבחנה , bioactivity, ביודיסטריבוציזציה. עם תכנון זהיר של חקר homogenization ב HDL חיקוי NPs, ההליך היה פשוט מאוד, ואת NPs נעשו מדרגי. יתר על כן, אתגרים שונים, כגון הפרדת NGF פריקה מן NPs, ביצוע מחקרים אמינים במבחנה שחרור, ומדידת הפעילות הביולוגית של NPs, היו להתגבר.

Introduction

מקרומולקולות, כגון חלבונים, פפטידים וחומצות גרעין, החלו להופיע כתרופות מבטיחות וזכו לתשומת לב רבה בעשורים האחרונים ^{1 , 2} . בשל היעילות הגבוהה שלהם ואת מצבי פעולה ספציפיים, הם מפגינים פוטנציאל טיפולי נהדר לטיפולים של סרטן, מחלות החיסון, HIV, ותנאים קשורים ^{3 , 4} . עם זאת, תכונות פיזיוכימיות, כגון גודל המולקולרי הגדול שלהם, מבנה תלת מימדי, חיובים משטח, וטבע הידרופילי, להפוך את vivo המסירה של מקרומולקולות אלה מאתגר מאוד. זה פוגע במידה ניכרת בשימוש הקליני שלהם. ההתקדמות האחרונה במערכות מסירת תרופות, כגון מיקרו-חלקיקים, חלקיקים פולימריים (NP), ליפוזומים ושפכי שומנים בדם, התגברה על אתגרים אלו ושיפרה משמעותית את המשלוח ב- vivo של מקרומולקולות. הואנו חושפים כמה חסרונות לגבי המטענים הללו, כולל יכולת טעינה נמוכה של סמים, יעילות מלכודת נמוכה, מחצית חיים קצרה, אובדן ביו-אקטיביות ותופעות לוואי לא רצויות ^{5 , 6 , 7 , 8} . מערכות הספק אפקטיביות נותרו תחום עניין מחקרי. יתר על כן, הפיתוח של שיטות אנליטיות לאפיין NPs נטען סמים הוא מאתגר יותר עבור מקרומולקולות מאשר מולקולות קטנות.

ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה (HDL) הוא NP טבעי המורכב מליבת שומנים המצופה על ידי אפוליפופרוטאינים ו monolayer phospholipid. HDD אנדוגני ממלא תפקיד קריטי בהעברת ליפידים, חלבונים וחומצות גרעין באמצעות האינטראקציה עם קולטני היעד, כגון SR-BI, ABCAI ו- ABCG1. הוא נבדק ככלי להעברת סוכני טיפול שונים ⁹, ^{10 , 11 , 12} . שיטות שונות פותחו כדי להכין HDL מחקה NPs. דיאליזה היא גישה פופולרית. בשיטה זו, NPs נוצרים על ידי לחות סרט השומנים באמצעות פתרון cholate נתרן. מלח מוסר מכן באמצעות דיאליזה של יומיים עם שלושה מאגרים ¹³ . שיטות Sonication לפברק NPs ידי sonicating תערובת השומנים עבור 60 דקות תחת תנאי חימום; NPs הם מטוהרים נוספת באמצעות כרומטוגרפיה ג'ל ¹⁴ . Microfluidics מייצר NPs באמצעות מכשיר microfluidic, אשר מתערבב phospholipids ו apolipoprotein AI (Apo AI) פתרונות על ידי יצירת microvortices בדפוס מיקוד ¹⁵ . ברור, שיטות אלה יכול להיות זמן רב, קשה, וקשה עבור התעשייה בקנה מידה למעלה.

במאמר זה, אנו מציגים את הכנה ואפיון של NPs חדש HDL חיקוי עבור עצבאנקפסולציה של גורם גדילה (NGF). NGF הוא homiodimer polycptide דיסולפיד מקושר המכיל שני מונומרים פוליפפטיד 13.6-kDa. נוהל חדש להכנת NPs על ידי homogenization, ואחריו אנקפסולציה של NGF לתוך NPs, פותחה. NGP HDL - חיקוי NPs אופיינו עבור גודל החלקיקים, התפלגות גודל, פוטנציאל zeta, ו במבחנה לשחרר. ביואקטיביות שלהם הוערך עבור תולדה neurite בתאי PC12. הפצה ביולוגית של NGP-nff HDL מחקה הושווה לזו של NGF חופשי לאחר הזרקה תוך וריידית בעכברים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

הערה: מחקרים בבעלי חיים שנכללו בכל ההליכים אושרו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים ושימוש הוועדה באוניברסיטת צפון טקסס בריאות המרכז למדע.

1. הכנת חלקיקי NGF HDL מחקה

1. ממיסים את ה- excipients, phosphatidylcholine (PC), sphingomyelin (SM), phosphatidylserine (PS), cholesteryl oleate (CO), ו- D-α-tocopheryl פוליאתילן גליקול succinate (TPGS), באתנול להכין פתרונות מלאי ב 1 מ"ג / מ"ל.
   הערה: פתרונות המניות היו aliquoted ומאוחסנים ב -20 מעלות צלזיוס. האוליאט הצ'ולסטרי היה מאוחסן בבקבוקים כהים. ה- PC, SM, PS, ו- CO פתרונות מלאי היו יציבים עד 6, 3, 12, ו 12 חודשים, בהתאמה, ב -20 מעלות צלזיוס. הפתרון TPGS היה יציב לפחות 12 חודשים ב -20 מעלות צלזיוס.
2. מערבבים 10 μL של NGF (1 מ"ג / מ"ל ​​במים) עם 10 μL של פרוטמין USP (1 מ"ג / מ"ל ​​במים) בצינור microcentrifuge 1.5 מ"ל ולתת לו לעמוד במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר כדיטופס מורכב.
   הערה: NGF ופתרונות מניות פרוטמין היו aliquoted ומאוחסנים ב -20 מעלות צלזיוס. הקפאה חוזרת והפשרה לא מומלצות במלאי NGF.
3. הוסף 59 μL של המחשב, μL 11 של SM, 4 μL של PS, 15 μL של CO, ו 45 μL של TPGS בקבוקון זכוכית. מערבבים להתאדות אתנול תחת זרם חנקן עדין במשך כ 5 דקות; כל excipients צריך טופס שמנוני, סרט דק בתחתית בקבוקון זכוכית.
4. מוסיפים 1 מ"ל של ultrapure (סוג 1) מים בקבוקון homogenize ב 9,500 סל"ד (8,600 xg) במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי ליצור את NPs אב טיפוס.
5. מוסיפים את המורכב מוכן בשלב 1.2 כדי NPs אב טיפוס ו דגירה על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות עם ערבוב באמצעות סרגל ערבוב קטן בקבוקון זכוכית.
   1. מגניב את NPs למטה על ידי ערבוב בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות נוספות. לאחר זה מתקרר, להוסיף 106 μL של Apo AI (1.49 מ"ג / מ"ל) ומערבבים בטמפרטורת החדר בן לילה כדי ליצור הסופיNGF HDL מחקה NPs.

2. אפיון של חלקיקי NGF HDL מחקה

1. למדוד את גודל החלקיקים ואת הפוטנציאל zeta באמצעות Analyzer החלקיקים (ראה את לוח החומרים) בהתאם להוראות היצרן.
2. השתמש בטור צולב agarose ג'ל chromatography סינון כדי להפריד בין NGF פריקה מן nps HDF מחקה NPs ולקבוע את יעילות מלכודת של NGF.
   1. להכנת הכנה, להעביר 15 מ"ל של השערת ספרוס 4B-CL על כוס 50 מ"ל. מערבבים את החרוז ההשעיה באמצעות מוט זכוכית לשפוך קצת לתוך עמודה (30 ס"מ אורך × 1 ס"מ קוטר, עם frit זכוכית בתחתית). בעדינות הקש על הטור כדי להיפטר בועות. אפשר ממס לניקוז החרוזים להתיישב במשך כמה דקות.
   2. המשך להוסיף את ההשעיה הנותרת. שוטפים את הקיר הפנימי של העמוד כדי לנקות את החרוזים. מסננים את הממס עד רמת הממס מעטBove בראש השלב נייח. שטפו את העמודה עם 20 מ"ל של 1x פוספט שנאגרו מלוחים (PBS, המכיל 137 מ"מ NaCl, 2.7 מ"מ KCl, 8 מ"מ Na ₂ HPO ₄ , ו 2 mM KH ₂ PO ₄ ).
   3. כדי לקבוע את שברים המכילים NGF פריקה, לטעון 200 μL של פתרון NGF (10 מיקרוגרם / מ"ל) על עמודה סינון ג'ל (25 ס"מ אורך x 1 ס"מ קוטר) ו elute עם 1x PBS.
   4. לאסוף סך של 12 שברים (1 מ"ל עבור כל חלק) ולמדוד את הריכוז של NGF בכל חלק באמצעות ערכת כריך ELISA עבור NGF.
   5. זיהוי NGF מ שברים 6-10 באמצעות ערכת סנדוויץ ELISA. קבל chromatogram של NGF פריקה על העמודה. שטפו את הטור עם 20 מ"ל של PBS.
   6. כדי לקבוע את שברים המכילים NGF HDL מחקה NPs, לטעון 200 μL של NPs על עמודה elute עם 1x PBS. לאסוף סך של 12 שברים (1 מ"ל עבור כל חלק) ולמדוד את עוצמתם של חלקיקים בכל שבר Uלשיר את מנתח גודל החלקיקים. זיהוי NPs NGF מ שברים 2 עד 4.
      הערה: האינטנסיביות היא פרמטר נמדד על ידי מנתח החלקיקים, אשר מספר כיצד חלקיקים רבים עשויים להתקיים פתרון הבדיקה. ככל שיותר NPs קיימים בפתרון, כך העוצמה גבוהה יותר. לפי גישה זו, אנו יכולים לאשר כי הטור יכול להפריד NPs NPs מ NGF פריקה.
   7. כדי למדוד את יעילות מלכודת של NGF, לטעון 200 μL של NGF HDL- מחקה NPs על עמודה elute עם 1x PBS. לאסוף סך של 12 שברים (1 מ"ל עבור כל חלק).
   8. למדוד את ריכוז NGF פריקת מ שברים 6 עד 10 באמצעות ערכת סנדוויץ ELISA.
   9. מוסיפים את כמויות NGF הנמדד מ שברים 6-10 יחד כמו NGF פריקה ולחשב את יעילות מלכודת של NGF באמצעות המשוואה הבאה.
      % EE = (1 - פריקה NGF / NGF הכולל נוספה לתוך NP) x 100% משוואה (1)

3. במהדורה חוץ גופית של NGF HDLמחקה ננו-חלקיקים

1. מחקר חינם NGF (10 מיקרוגרם / מ"ל ​​במים, n = 4) ו NGF HDL מחקה NPs (10 מיקרוגרם / מ"ל, n = 4) במקביל.
2. טרום לטפל 8 צינורות דיאליזה (חתך משקל מולקולרי: 300 kDa) על ידי ביצוע הוראות היצרן.
3. הכן 5% אלבומין בסרום שור (BSA) ב PBS כמו המדיום שחרור. הוסף 30 מ"ל של המדיום שחרור צינור 50-מ"ל צנטריפוגות לחמם אותו עד 37 מעלות צלזיוס שייקר עם מהירות סל"ד 135 רועד. מקום אחר 50 מ"ל של המדיום שחרור שייקר להחלפה.
4. הוסף 400 μL של המדיום שחרור לתוך צינור דיאליזה במהירות להוסיף 200 μL של המדגם נבדק לעשות מספיק נפח עבור דיאליזה.
5. סגור את הצינור במהירות לשים את צינור דיאליזה לתוך המדיום שחרור (צינור צנטריפוגה). מהר לסגת 100 μL של המדיום שחרור מן צינור דיאליזה בחוץ כמו המדגם עבור הזמן 0. מיד לשים את המדגם לתוך -20 מעלות צלזיוס לניתוח מאוחר יותר. הוסף 100 μL של טרי מחדשבינוני השכירות לתוך צינור צנטריפוגה להחליף את המדגם נסוגה. הפעל את הטיימר.
6. ב 1, 2, 4, 6, 8, 24, 48, ו 72 שעות, למשוך 100 μL של המדיום שחרור ולהחליף אותו עם 100 μL של המדיום הטרי. מיד לשים את דגימות נסוג לתוך -20 מעלות צלזיוס לניתוח מאוחר יותר.
7. לאחר 72 שעות, להוציא את כל הדגימות מ -20 ° C ולהפשיר אותם בטמפרטורת החדר. למדוד את ריכוזים NGF של דגימות שחרור באמצעות ערכת סנדוויץ ELISA.

4. Bioactivity של NGF HDL מחקה חלקיקים (מחקר Neurite Outgrowth)

1. התרבות תאים PC12 ב RPMI-1640 בינוני בתוספת 10% החום- inactivated בסרום בסרום, 5% בסרום שור עוברית, 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​סטרפטומיצין, ו 100 יחידות / פניצילין מ"ל. לשמור על תאים חממה humidified ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO ₂ .
2. כאשר התאים מגיעים ~ 70-80% מפגש, להסיר את המדיום תרבות לשטוף את התאים עם 1x PBS (כ 2 מ"ל לכל 10 ס"מ ^{2 משטח משטח התרבות). הסר את הפתרון לשטוף. Trypsinize התאים על ידי הוספת 0.25% פתרון טריפסין-EDTA (0.25% טריפסין ו 1 מ"מ EDTA, 0.5 מ"ל לכל 10 ס"מ 2 שטח פני השטח תרבות) כדי הבקבוק ו דגירה על 37 מעלות צלזיוס עד רוב התאים מנותקים.}
3. הוסף שני כרכים של המדיום תרבות ספין למטה ב XG 180 במשך 5 דקות. הסר את supernatant ו resuspend תא גלולה ב 5 מ"ל של המדיום תרבות. סנן את התאים באמצעות מחט G 22, ½ אינץ 'לשבור אשכולות התא.
4. פיצול התאים ביחס של 1: 3 לתוך בקבוק חדש תרבות התא. לאחר הדגירה בן לילה, להסיר תאים PC12 ללא חיבור. אפשר לתאים המצורפים להישאר לצמיחה נוספת.
5. חזור על הליך זה עבור 3 מעברים כדי לבחור את תת התרבות של PC12 כי יש תכונה הדבקה חזקה. מראש מעיל צלחת 6-היטב עם 800 μL / גם של זנב חולדה זנב קולגן סוג אני (100 מיקרוגרם / מ"ל).
6. Trypsinize PC12 תאים שנבחרו כמתואר בשלב 4.2 ולסנן אותם דרך22 G, חצי אינץ מחט לשבור את אשכולות התא. לספור את התאים עם hemocytometer. זרע את התאים לילה בצפיפות של 10,000 תאים / גם צלחת מראש מצופה היטב 6 בשלב 4.5 כדי לאפשר לתאים לצרף את הצלחת.
7. לדלל חינם NGF (10 מיקרוגרם / מ"ל) ו NGF HDL לחקות NPs (10 מיקרוגרם / מ"ל) עם המדיום התרבות (המתואר בשלב 4.1) להכין 0.5, 1, 5, 10, 50, 100 ng / מ"ל ​​ריכוזים. הסר 2 מ"ל של מדיום מכל היטב ולהחליף עם 2 מ"ל של NGF חינם מדולל או NGF HDL מחקה NPs. תרבות במשך 4 ימים.
8. ביום 4, שנה את המדיום בינוני עד טרי (המתואר בשלב 4.1) המכיל את הטיפול המתאים ולהמשיך את הטיפול במשך 3 ימים נוספים.
9. ביום 7, לדמיין את התאים עם מיקרוסקופ אור הפוכה ואת התמונה כל היטב כתמים אקראיים תחת הגדלה 10X.

5. Biodistribution של NGF HDL- מחקה חלקיקים

1. השתמש מבוגר BALB / c עכברים (זכר, 25-30 גרם) כדי tEst את התפלגות רקמות NGPs NGF. באופן אקראי לחלק את העכברים לשלוש קבוצות של 3 עכברים לכל קבוצה. השתמש קונוס פלסטיק בצורת קונוס ( למשל, decapicone) כדי לרסן עכבר ולנגב את הזנב עם אתנול כדי לקדם vasodilation ואת הנראות של הווריד.
2. להזריק 100 μL של מלוחים או NGF חינם, או NGF HDL לחקות NPs לכל קבוצה של עכברים (3 קבוצות) דרך הוורידים הזנב במינון של 40 מיקרוגרם / ק"ג של NGF. השתמש מחט 30½ G המצורפת מזרק 1 מ"ל.
3. ב 30 דקות לאחר ההזרקה, להרדים את העכברים באמצעות isoflurane בשאיפה 3% (בחמצן בקצב הזרימה של 2 L / min). בצע זנב קמצוץ קמצוץ כדי לקבוע את עומק ההרדמה. איסוף דם על ידי לנקב לב.
   1. משוך כ 1 מ"ל של דם מהלב. להרדים כל עכבר על ידי נקע בצוואר הרחם.
4. מניחים את פגר העכבר בשכיבה הגב. פתח את הבטן באמצעות מספריים כירורגיים להעביר שומן ומעי בצדבאמצעות צמר גפן כדי לחשוף את הכבד, הטחול והכליות. קציר אלה רקמות ולשטוף אותם 1x PBS לנקות את הדם.
5. מיד צנטריפוגה דגימות דם ב 3,400 XG ו 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות כדי לקבל את הפלזמה. חנות פלזמה ורקמות ב -80 מעלות צלזיוס עד הניתוחים.
6. כדי לנתח את דגימות רקמה, להזיז את הדגימות מ -80 מעלות צלזיוס עד 4 מעלות צלזיוס ו להשעות 100 מ"ג של מדגם רקמה בנפח 10x של חיץ החילוץ (0.05 M אצטט אצטט, 1.0 M כלורי נתרן, 1% טריטון X-100, 1% BSA, 0.2 mM phenylmethanesulfonyl פלואוריד, ו 0.2 mM benzethonium כלורי). Homogenize ב 10,000 סל"ד ו 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
7. להקריב שני עכברים untreated לאסוף ריק פלזמה ורקמות, כמתואר צעדים 5.3 ו - 5.4. הכן פתרונות סטנדרטיים NGF באמצעות הומוגנטים ריק פלזמה ריק או homogenates ריק.
8. לקבוע את ריכוזי NGF ב homogenates פלזמה ורקמות באמצעות ערכת סנדוויץ ELISA, כמתואר לעיל.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

ערכת הנדסה של HDL מחקה, α-tocopherol מצופה NGF NPs שהוכנו על ידי אסטרטגיה יון זוג מוצג באיור 1 . כדי לנטרל את המטענים על פני השטח של NGF, פרוטמין USP שימש כסוכן יון זוג כדי ליצור מורכבת עם NGF. כדי להגן על bioactivity, אב טיפוס HDL - חיקוי NPs היו מהונדסים, תחילה באמצעו?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

במחקר זה, אנו מדגימים שיטה פשוטה להכין NPs HDL מחקה עבור אנקפסולציה NGF. מערכות שונות של משלוח NP נחקרו על מנת לספק חלבונים. נכון לעכשיו, ההכנות NP רבים כוללים דיאליזה, משקעים ממס, ואת הסרט הידרציה. תהליכים אלה הם בדרך כלל מסובך ומאתגר בקנה מידה. במהלך פיתוח NP זה, נקבע כי השומנ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Recombinant Human Beta-NGF	Creative Biomart	NGF-05H
L-α-Phosphatidylcholine (PC)	Avanti	131601P	95%, Egg, Chicken
Sphingomyelin (SM)	Avanti	860062P	Brain, Porcine
Phosphatidylserine (PS)	Avanti	840032P	Brain, Porcine
Cholesteryl oleate (CO)	Sigma	C9253
D-α-Tocopheryl polyethylene glycol succinate (TPGS)	BASF	9002-96-4	Vitamin E Polyethylene Glycol Succinate
Protamine sulfate	Sigma	P3369	meets USP testing specifications
Apolipoprotein A1, Human plasma	Athens Research & Technology	16-16-120101	1 mg in 671 µL 10 mM NH4HCO3, pH 7.4
Sepharose 4B-CL	Sigma	CL4B200	Cross-linked agarose,  gel filtration chromatography column filling material
Sandwich ELISA Kit for NGF	R&D system	DY008
Bovine Serum Albumin	Sigma	A2153
RPMI-1640 medium	GE Healthcare Life Science	SH30096.02
Horse serum	GE Healthcare Life Science	SH30074.03
Fetal bovine serum	Gibco	10082147
PC12 cells	ATCC	CRL-1721
Rat tail collagen type I	Sigma	C3867
Sodium acetate	Sigma	S2889
Sodium chloride	Sigma	31414
Triton X-100	Sigma	T8787
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)	Sigma	P7626
Benzethonium chloride	Sigma	B8879
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Homogenizer	Tekmar	T 25-S1
Delsa Nano HC particle analyzer	Beckman-Coulter	Delsa Nano HC
Float-A-Lyzer G2 Dialysis Device	Spectrum Laboratories	G235036	Molecule Cutoff 300 kDa
Centrifuge	Eppendoff	5424R
Polytron homogenizer	Kinematica	PT 1200C
DecapiCone	Braintree Scientific Inc.	DC-M200