Vorbereitung und Charakterisierung von neuartigen HDL-imitierenden Nanopartikeln für die Nervenwachstumsfaktorverkapselung

Zusammenfassung

Eine einfache Homogenisierung wurde verwendet, um neuartige, hochdichte, lipoproteinimimierende Nanopartikel herzustellen, um den Nervenwachstumsfaktor einzukapseln. Herausforderungen, detaillierte Protokolle für die Nanopartikelpräparation, in vitro Charakterisierung und in vivo Studien sind in diesem Artikel beschrieben.

Zusammenfassung

Das Ziel dieses Artikels ist es, Präparations- und Charakterisierungsmethoden für Nervenwachstumsfaktor (NGF) -belastete, hochdichte, lipoprotein (HDL) -Mimiking-Nanopartikel (NPs) einzuführen. HDLs sind endogene NPs und wurden als Vehikel für die Lieferung von therapeutischen Mitteln untersucht. Es wurden verschiedene Methoden entwickelt, um HDL-mimicking NPs vorzubereiten. Allerdings sind sie in der Regel kompliziert, zeitaufwendig und schwierig für die industrielle Scale-up. In dieser Studie wurde eine einstufige Homogenisierung verwendet, um die Hilfsstoffe zu mischen und die Prototyp-NPs zu bilden. NGF ist ein wasserlösliches Protein von 26 kDa. Um die Verkapselung von NGF in die Lipidumgebung von HDL-imitierenden NPs zu erleichtern, wurde Protamin USP verwendet, um einen Ionenpaarkomplex mit NGF zu bilden, um die Ladungen auf der NGF-Oberfläche zu neutralisieren. Der NGF / Protamin-Komplex wurde dann in die Prototyp-NPs eingeführt. Apolipoprotein AI wurde schließlich auf die Oberfläche der NPs aufgetragen. NGF HDL-imitieren NPs zeigten bevorzugte Eigenschaften im BegriffS Partikelgröße, Größenverteilung, Einfangwirkung, In-vitro- Freisetzung, Bioaktivität und Biodistribution. Mit dem sorgfältigen Design und der Erforschung der Homogenisierung in HDL-imitierenden NPs wurde das Verfahren stark vereinfacht und die NPs wurden skalierbar gemacht. Darüber hinaus wurden verschiedene Herausforderungen wie die Trennung von unbelastetem NGF von den NPs, die Durchführung zuverlässiger in vitro- Freisetzungsuntersuchungen und die Messung der Bioaktivität der NPs überwunden.

Einleitung

Makromoleküle wie Proteine, Peptide und Nukleinsäuren sind als vielversprechende Medikamente aufgetaucht und haben in den vergangenen Jahrzehnten erhebliche Aufmerksamkeit erlangt ^{1 , 2} . Aufgrund ihrer hohen Wirksamkeit und spezifischen Wirkungsweisen zeigen sie ein großes therapeutisches Potenzial für die Behandlung von Krebs, Immunerkrankungen, HIV und verwandten Bedingungen ^{3 , 4} . Jedoch machen physiochemische Eigenschaften, wie ihre große molekulare Größe, dreidimensionale Struktur, Oberflächenladungen und hydrophile Natur, die in vivo- Abgabe dieser Makromoleküle sehr anspruchsvoll. Dies beeinträchtigt ihre klinische Anwendung erheblich ⁴ . Jüngste Fortschritte in Arzneimittelabgabesystemen wie Mikropartikeln, Polymer-Nanopartikeln, Nerven, Liposomen und Lipid-NPs, überwand diese Herausforderungen und verbesserte die in vivo- Zufuhr von Makromolekülen erheblich. HoWeil, einige Nachteile in Bezug auf diese Liefergüter wurden aufgedeckt, einschließlich niedrige Drogenbelastung Kapazität, niedrige Einschluss Effizienz, kurze Halbwertszeit, Verlust der Bioaktivität und unerwünschte Nebenwirkungen ^{5 , 6 , 7 , 8} . Effektive Trägersysteme bleiben ein Forschungsgebiet. Darüber hinaus ist die Entwicklung von analytischen Methoden zur Charakterisierung von Arzneimittel-geladenen NPs für Makromoleküle schwieriger als für kleine Moleküle.

High-Density-Lipoprotein (HDL) ist ein natürlicher NP, der aus einem Lipidkern besteht, der mit Apolipoproteinen und einer Phospholipidmonoschicht beschichtet ist. Endogene HDL spielt eine wichtige Rolle beim Transport von Lipiden, Proteinen und Nukleinsäuren durch ihre Wechselwirkung mit Zielrezeptoren wie SR-BI, ABCAI und ABCG1. Es wurde als Vehikel für die Lieferung von verschiedenen therapeutischen Mitteln untersucht ⁹, ^{10 , 11 , 12} . Es wurden verschiedene Methoden entwickelt, um HDL-mimicking NPs vorzubereiten. Dialyse ist ein beliebter Ansatz. Bei diesem Verfahren werden NPs durch Hydratisierung eines Lipidfilms unter Verwendung von Natriumcholatlösung gebildet. Das Salz wird dann durch eine 2-tägige Dialyse mit drei Puffern ^{13 entfernt} . Sonessionsverfahren herstellen NPs durch Beschallung einer Lipidmischung für 60 min unter einer Heizbedingung; Die NPs werden durch Gelchromatographie weiter gereinigt. Mikrofluidik erzeugt NPs über eine mikrofluidische Vorrichtung, die Phospholipide und Apolipoprotein AI (Apo AI) Lösungen durch die Herstellung von Mikrovortices in einem Fokussierungsmuster ¹⁵ vermischt. Klar, diese Methoden können zeitraubend, hart und schwierig für industrielle Scale-up.

In diesem Artikel stellen wir die Vorbereitung und Charakterisierung von neuartigen HDL-mimicking NPs für Nerven vorWachstumsfaktor (NGF) Verkapselung. NGF ist ein Disulfid-verknüpftes Polypeptid-Homodimer, das zwei 13,6-kDa-Polypeptidmonomere enthält. Ein neuartiges Verfahren zur Herstellung der NPs durch Homogenisierung, gefolgt von der Verkapselung von NGF in die NPs, wurde entwickelt. Die NGF-HDL-imitierenden NPs wurden für Partikelgröße, Größenverteilung, Zetapotential und in vitro Freisetzung charakterisiert. Ihre Bioaktivität wurde für das Neuritenwachstum in PC12-Zellen untersucht. Die Biodistribution von NGF-HDL-imitierenden NPs wurde mit der von freiem NGF nach intravenöser Injektion bei Mäusen verglichen.

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Protokoll

ANMERKUNG: Die Tierstudien, die in allen Verfahren enthalten sind, wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee an der University of North Texas Health Science Center genehmigt.

1. Vorbereitung von NGF-HDL-nachahmenden Nanopartikeln

1. Lösen Sie die Exzipienten, Phosphatidylcholin (PC), Sphingomyelin (SM), Phosphatidylserin (PS), Cholesteryloleat (CO) und D-α-Tocopherylpolyethylenglykolsuccinat (TPGS) in Ethanol, um Stammlösungen bei 1 mg / ml zuzubereiten.
   HINWEIS: Die Stammlösungen wurden aliquotiert und bei -20 ° C gelagert. Das Cholesteryloleat wurde in dunklen Flaschen gelagert. Die PC-, SM-, PS- und CO-Stammlösungen waren für bis zu 6, 3, 12 und 12 Monate bei -20 ° C stabil. Die TPGS-Lösung war für mindestens 12 Monate bei -20 ° C stabil.
2. Mischen Sie 10 μl NGF (1 mg / ml in Wasser) mit 10 μl Protamin USP (1 mg / ml in Wasser) in einem 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen und lassen Sie es 10 min bei Raumtemperatur stehenBilden den Komplex.
   HINWEIS: Die NGF- und Protamin-Stammlösungen wurden aliquotiert und bei -20 ° C gelagert. Wiederholtes Einfrieren und Auftauen wird für die NGF-Bestände nicht empfohlen.
3. Es werden 59 μl PC, 11 μl SM, 4 μl PS, 15 μl CO und 45 μl TPGS in eine Glasampulle gegeben. Das Ethanol wird unter einem sanften Stickstoffstrom für etwa 5 min vermischt und verdampft; Alle Hilfsstoffe sollten einen öligen, dünnen Film an der Unterseite der Glasampulle bilden.
4. Füge 1 ml ultrareines (Typ 1) Wasser in die Durchstechflasche und homogenisiere bei 9.500 U / min (8.600 xg) für 5 min bei Raumtemperatur, um die Prototyp-NPs zu bilden.
5. Fügen Sie den in Schritt 1.2 hergestellten Komplex zu den Prototyp-NPs hinzu und inkubieren Sie bei 37 ° C für 30 min unter Rühren unter Verwendung eines kleinen Rührstabes in der Glasampulle.
   1. Die NPs unter Rühren bei Raumtemperatur weitere 30 min abkühlen lassen. Danach werden 106 μl Apo AI (1,49 mg / ml) zugesetzt und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, um das Finale zu bildenNGF HDL-Nachahmung von NPs.

2. Charakterisierung von NGF-HDL-Mimik-Nanopartikeln

1. Messen Sie die Partikelgröße und das Zetapotential mit einem Partikelanalysator (siehe Materialtabelle) gemäß den Anweisungen des Herstellers.
2. Verwenden Sie eine vernetzte Agarose-Gelfiltrationschromatographie-Säule, um das unbelastete NGF von den NGF-HDL-imitierenden NPs zu trennen und die Einfangwirkung des NGF zu bestimmen.
   1. Für die Säulenpräparation 15 ml Sepharose 4B-CL Suspension in ein 50-ml-Becherglas überführen. Die Wulstaufhängung mit einem Glasstab umrühren und etwas in eine Säule geben (30 cm Länge × 1 cm Durchmesser, mit einer Glasfritte an der Unterseite). Vorsicht tippen Sie auf die Säule, um Blasen loszuwerden. Lassen Sie das Lösungsmittel abtropfen lassen und die Perlen für ein paar Minuten absetzen.
   2. Weiter führe die restliche Aufhängung hinzu. Spülen Sie die Innenwand der Säule, um die Perlen zu reinigen. Das Lösungsmittel abtropfen lassen, bis der Lösemittelgehalt geringfügig istBove die Oberseite der stationären Phase. Waschen und Konditionieren der Säule mit 20 ml 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, enthaltend 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na ₂ HPO ₄ und 2 mM KH ₂ PO ₄ ).
   3. Um die Fraktionen mit unbelastetem NGF zu bestimmen, werden 200 μl NGF-Lösung (10 μg / mL) auf die Gelfiltrationssäule (25 cm Länge x 1 cm Durchmesser) gegeben und mit 1x PBS eluiert.
   4. Sammeln Sie insgesamt 12 Fraktionen (1 ml für jede Fraktion) und messen Sie die Konzentration von NGF in jeder Fraktion mit einem Sandwich ELISA Kit für NGF.
   5. Erfassen Sie NGF aus den Fraktionen 6 bis 10 mit dem Sandwich ELISA Kit. Erhalten Sie ein Chromatogramm von unbelastetem NGF auf der Säule. Die Säule mit 20 ml PBS waschen.
   6. Um die Fraktionen zu bestimmen, die NGF-HDL-imitierende NPs enthalten, beladen Sie 200 & mgr; l der NPs auf die Säule und eluieren mit 1x PBS. Sammeln Sie insgesamt 12 Fraktionen (1 ml für jede Fraktion) und messen Sie die Intensität der Partikel in jeder Fraktion uSingen Sie den Partikelgrößenanalysator. Erkennung der NGF-NPs aus den Fraktionen 2 bis 4.
      HINWEIS: Die Intensität ist ein Parameter, der von dem Partikelanalysator gemessen wird, der angibt, wie viele Nanopartikel in der Testlösung vorhanden sein können. Je mehr NPs in Lösung existieren, desto höher ist die Intensität. Durch diesen Ansatz können wir bestätigen, dass die Spalte NGF-NPs von unbelastetem NGF trennen kann.
   7. Um die Einfangwirkung von NGF zu messen, laden Sie 200 μl NGF HDL-nachgeahmte NPs auf die Säule und eluieren mit 1x PBS. Sammle insgesamt 12 Fraktionen (1 ml für jede Fraktion).
   8. Messen Sie die unbelastete NGF-Konzentration von den Fraktionen 6 bis 10 mit dem Sandwich ELISA Kit.
   9. Fügen Sie die NGF-Mengen, die von den Fraktionen 6 bis 10 gemessen wurden, zusammen als das unbelastete NGF und berechnen Sie die Einfangwirkung von NGF unter Verwendung der folgenden Gleichung.
      % EE = (1 - unbelastetes NGF / Gesamt-NGF in NP) x 100% Gleichung (1)

3. In vitro Freisetzung von NGF HDL-Mimiking Nanopartikel

1. NGF (10 μg / ml in n = 4) und NGF HDL-nachahmenden NPs (10 μg / mL; n = 4) parallel untersuchen.
2. Vorbehandeln von 8 Dialyse-Röhrchen (Molekulargewichts-Cutoff: 300 kDa) nach den Anweisungen des Herstellers.
3. Bereiten Sie 5% Rinderserumalbumin (BSA) in PBS als Freisetzungsmedium vor. Füge 30 ml Freisetzungsmedium zu einem 50-ml-Zentrifugenröhrchen hinzu und erwärme es bis zu 37 ° C in einem Schüttler mit einer Schüttelgeschwindigkeit von 135 U / min. Legen Sie weitere 50 ml Freisetzungsmedium in den Schüttler für den Austausch.
4. Fügen Sie 400 μl Freisetzungsmedium in das Dialyseschlauch hinzu und fügen Sie schnell 200 μl der getesteten Probe hinzu, um genügend Volumen für die Dialyse zu machen.
5. Schließen Sie den Schlauch und setzen Sie den Dialyseschlauch schnell in das Trennmedium (das Zentrifugenröhrchen). Ziehen Sie schnell 100 μl des Trennmediums aus dem äußeren Dialyseschlauch als Probe für die Zeit 0 ab. Setzen Sie die Probe sofort in -20 ° C für eine spätere Analyse ein. 100 μl frische ReLeasing-Medium in das Zentrifugenröhrchen, um die entnommene Probe zu ersetzen. Starten Sie den Timer.
6. Bei 1, 2, 4, 6, 8, 24, 48 und 72 h werden 100 μl des Trennmediums abgezogen und mit 100 μl frischem Medium ersetzt. Setzen Sie die entnommenen Proben sofort in -20 ° C für die spätere Analyse ein.
7. Nach 72 h alle Proben von -20 ° C herausnehmen und bei Raumtemperatur auftauen. Messen Sie die NGF-Konzentrationen der Freisetzungsproben mit dem Sandwich ELISA Kit.

4. Bioaktivität von NGF-HDL-nachgeahmten Nanopartikeln (Neurite Outgrowth Study)

1. Kultur-PC12-Zellen in RPMI-1640-Medium, ergänzt mit 10% hitzeinaktiviertem Pferdeserum, 5% fötalem Rinderserum, 100 μg / ml Streptomycin und 100 Einheiten / ml Penicillin. Halten Sie die Zellen in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C und mit 5% CO ₂ .
2. Wenn die Zellen ~ 60-80% Konfluenz erreichen, entfernen Sie das Kulturmedium und waschen die Zellen mit 1x PBS (ca. 2 ml pro 10 cm <)Sup> 2 Kulturfläche). Entfernen Sie die Waschlösung. Trypsinisieren der Zellen durch Zugabe von 0,25% Trypsin-EDTA-Lösung (0,25% Trypsin und 1 mM EDTA, 0,5 ml pro 10 cm ² Kulturoberfläche) in den Kolben und inkubieren bei 37 ° C, bis die meisten Zellen abgelöst sind.
3. Füge zwei Volumina Kulturmedium hinzu und spinze bei 180 xg für 5 min ab. Den Überstand entfernen und das Zellpellet in 5 ml Kulturmedium resuspendieren. Filtern Sie die Zellen durch eine 22 G, ½ Zoll Nadel, um Zellcluster zu brechen.
4. Die Zellen im Verhältnis 1: 3 in einen neuen Zellkulturkolben aufteilen. Nach der Inkubation über Nacht, entfernen Sie ungebundene PC12-Zellen. Lassen Sie die angehängten Zellen für weiteres Wachstum bleiben.
5. Wiederholen Sie diesen Vorgang für 3 Passagen, um die Subkultur von PC12 auszuwählen, die eine starke Adhäsionseigenschaft aufweist. Vorbereiten einer 6-Well-Platte mit 800 & mgr; l / Vertiefung des Rattenschwanzkollagen Typ I (100 & mgr; g / ml).
6. Trypsinisieren Sie die ausgewählten PC12-Zellen wie in Schritt 4.2 beschrieben und filtrieren sie durch eine22 G, ½ Zoll Nadel, um die Zellcluster zu brechen. Zähle die Zellen mit einem Hämocytometer. Die Zellen über Nacht mit einer Dichte von 10.000 Zellen / Vertiefung in der vorbeschichteten 6-Well-Platte in Schritt 4,5 abgesaugt, um die Zellen an der Platte zu befestigen.
7. Verdünnen Sie freie NGF (10 μg / ml) und NGF HDL-imitierende NPs (10 μg / ml) mit dem Kulturmedium (beschrieben in Schritt 4.1), um 0,5, 1, 5, 10, 50 und 100 ng / ml-Konzentrationen herzustellen. 2 ml Medium aus jeder Vertiefung entfernen und mit 2 ml der verdünnten freien NGF- oder NGF-HDL-Mimik-NPs ersetzen. Kultur für 4 Tage.
8. Am Tag 4 wechseln Sie das Medium auf frisches Medium (beschrieben in Schritt 4.1), das die entsprechende Behandlung enthält und die Behandlung für weitere 3 Tage fortsetzt.
9. Am Tag 7, visualisieren Sie die Zellen mit einem invertierten Lichtmikroskop und Bild jedes gut an zufälligen Flecken unter 10facher Vergrößerung.

5. Biodistribution von NGF HDL-nachahmenden Nanopartikeln

1. Verwenden Sie erwachsene BALB / c-Mäuse (männlich, 25-30 g) bis tEst die Gewebeverteilung von NGF-NPs. Gelegentlich teilen die Mäuse in drei Gruppen von 3 Mäusen pro Gruppe. Verwenden Sie eine kegelförmige Kunststoff-Rückhaltevorrichtung ( zB Decapicone), um eine Maus zurückzuhalten und den Schwanz mit Ethanol zu wischen, um die Vasodilatation und die Sichtbarkeit der Vene zu fördern.
2. In einer Dosis von 40 & mgr; g / kg NGF werden 100 & mgr; l entweder Kochsalzlösung, freie NGF oder NGF HDL-nachgeahmte NPs zu jeder Gruppe von Mäusen (3 Gruppen) durch die Schwanzvenen injiziert. Verwenden Sie eine 30 ½ G-Nadel, die an einer 1-ml-Spritze befestigt ist.
3. Nach 30 Minuten nach der Injektion die Mäuse mit 3% inhaliertem Isofluran (in Sauerstoff bei einer Durchflussmenge von 2 l / min) anästhesieren. Führen Sie eine Schwanz-und Zehen-Prise, um die Tiefe der Anästhesie zu bestimmen. Blut durch Herzpunktion sammeln.
   1. Ziehe ungefähr 1 ml Blut aus dem Herzen. Euthanisieren jede Maus durch zervikale Versetzung.
4. Legen Sie die Maus Karkasse in dorsal Recumbency. Öffnen Sie den Bauch mit chirurgischen Scheren und bewegen Sie Fett und Darm beiseiteMit einem Wattestäbchen, um Leber, Milz und Niere auszusetzen. Ernten Sie diese Gewebe und spülen Sie sie in 1x PBS, um das Blut zu reinigen.
5. Die Blutproben sofort bei 3.400 xg und 4 ° C für 5 min zentrifugieren, um das Plasma zu erhalten. Das Plasma und das Gewebe bei -80 ° C bis zur Analyse aufbewahren.
6. Um die Gewebeproben zu analysieren, bewegen Sie die Proben von -80 ° C auf 4 ° C und suspendieren 100 mg Gewebeprobe in einem 10-fachen Volumen des Extraktionspuffers (0,05 M Natriumacetat, 1,0 M Natriumchlorid, 1% Triton X-100, 1% BSA, 0,2 mM Phenylmethansulfonylfluorid und 0,2 mM Benzethoniumchlorid). Bei 10.000 U / min und 4 ° C für 5 min homogenisieren.
7. Opfer zwei unbehandelte Mäuse, um leeres Plasma und Gewebe zu sammeln, wie in den Schritten 5.3 und 5.4 beschrieben. NGF-Standardlösungen mit leeren Plasma- oder Blindgewebe-Homogenaten vorbereiten.
8. Bestimmen Sie die Konzentrationen von NGF in den Plasma- und Gewebehomogenaten mit dem Sandwich-ELISA-Kit, wie oben beschrieben.

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Ergebnisse

Das Engineering-Schema von HDL-imitierenden, α-Tocopherol-beschichteten NGF-NPs, die durch eine Ionenpaar-Strategie hergestellt wurden, ist in 1 gezeigt . Um die Oberflächenladungen von NGF zu neutralisieren, wurde Protamin USP als Ionenpaarmittel verwendet, um einen Komplex mit NGF zu bilden. Um die Bioaktivität zu schützen, wurden Prototyp-HDL-imitierende NPs entwickelt, zuerst mit Homogenisierung; Dann wurde der NGF / Protamin-Komplex in die Prototyp-NPs eingekaps...

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Diskussion

In dieser Studie zeigen wir eine einfache Methode zur Vorbereitung von HDL-Mimik-NPs für die NGF-Kapselung. Verschiedene NP-Abgabesysteme wurden untersucht, um Proteine ​​zu liefern. Derzeit umfassen viele NP-Präparate Dialyse, Lösungsmittelabscheidung und Filmhydratation. Diese Prozesse sind im Allgemeinen kompliziert und anspruchsvoll beim Scale-up. Während dieser NP-Entwicklung wurde festgestellt, dass die Lipide eine starke Haftung an der Glaswand des Behälters hatten, was zu den Schwierigkeiten bei der Hyd...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Recombinant Human Beta-NGF	Creative Biomart	NGF-05H
L-α-Phosphatidylcholine (PC)	Avanti	131601P	95%, Egg, Chicken
Sphingomyelin (SM)	Avanti	860062P	Brain, Porcine
Phosphatidylserine (PS)	Avanti	840032P	Brain, Porcine
Cholesteryl oleate (CO)	Sigma	C9253
D-α-Tocopheryl polyethylene glycol succinate (TPGS)	BASF	9002-96-4	Vitamin E Polyethylene Glycol Succinate
Protamine sulfate	Sigma	P3369	meets USP testing specifications
Apolipoprotein A1, Human plasma	Athens Research & Technology	16-16-120101	1 mg in 671 µL 10 mM NH4HCO3, pH 7.4
Sepharose 4B-CL	Sigma	CL4B200	Cross-linked agarose,  gel filtration chromatography column filling material
Sandwich ELISA Kit for NGF	R&D system	DY008
Bovine Serum Albumin	Sigma	A2153
RPMI-1640 medium	GE Healthcare Life Science	SH30096.02
Horse serum	GE Healthcare Life Science	SH30074.03
Fetal bovine serum	Gibco	10082147
PC12 cells	ATCC	CRL-1721
Rat tail collagen type I	Sigma	C3867
Sodium acetate	Sigma	S2889
Sodium chloride	Sigma	31414
Triton X-100	Sigma	T8787
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)	Sigma	P7626
Benzethonium chloride	Sigma	B8879
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Homogenizer	Tekmar	T 25-S1
Delsa Nano HC particle analyzer	Beckman-Coulter	Delsa Nano HC
Float-A-Lyzer G2 Dialysis Device	Spectrum Laboratories	G235036	Molecule Cutoff 300 kDa
Centrifuge	Eppendoff	5424R
Polytron homogenizer	Kinematica	PT 1200C
DecapiCone	Braintree Scientific Inc.	DC-M200