Preparazione e caratterizzazione di novel nanoparticelle che imitano HDL per l'incapsulamento del fattore di crescita del nervo

Riepilogo

L'omogeneizzazione semplice è stata usata per preparare nanoparticelle nuove, ad alta densità, che simulano lipoproteine ​​per incapsulare il fattore di crescita del nervo. Le sfide, i protocolli dettagliati per la preparazione di nanoparticelle, la caratterizzazione in vitro e gli studi in vivo sono descritti in questo articolo.

Abstract

L'obiettivo di questo articolo è quello di introdurre metodi di preparazione e caratterizzazione per le nanoparticelle (NP) di carico di NFF-caricato, ad alta densità, lipoproteine ​​(HDL). Le HDL sono NPs endogene e sono state esplorate come veicoli per la consegna di agenti terapeutici. Sono stati sviluppati diversi metodi per preparare NPs che imitano HDL. Tuttavia, sono generalmente complicate, richiedono molto tempo e sono difficili per la scala industriale. In questo studio, l'omogeneizzazione in un passo è stata usata per mescolare gli eccipienti e formare i prototipi NP. NGF è una proteina solubile in acqua di 26 kDa. Per facilitare l'incapsulamento di NGF nell'ambiente lipidico dei NP NPN che imitano HDL, la protamina USP è stata usata per formare un complesso di ioni-coppia con NGF per neutralizzare le cariche sulla superficie NGF. Il complesso NGF / protamina è stato quindi introdotto nei prototipi NP. Apolipoproteina AI è stata finalmente ricoperta sulla superficie dei NP. NGF HDL-imitando NP hanno mostrato preferibili proprietà in terminiS di dimensione delle particelle, distribuzione delle dimensioni, efficienza di entrapment, rilascio in vitro , bioattività e biodistribuzione. Con l'accurata progettazione e l'esplorazione dell'omogeneizzazione in NPs che imitano HDL, la procedura è stata notevolmente semplificata e gli NP sono stati resi scalabili. Inoltre, sono state superate diverse sfide, come la separazione di NGF scaricati dai NP, che conduce affidabili studi di rilascio in vitro e misurando la bioattività dei NP.

Introduzione

Macromolecole, come proteine, peptidi e acidi nucleici, stanno emergendo come farmaci promettenti e hanno guadagnato una notevole attenzione negli ultimi decenni ^{1 , 2} . A causa della loro elevata efficacia e modalità di azione specifica, essi presentano un grande potenziale terapeutico per i trattamenti del cancro, della malattia immunitaria, dell'HIV e delle condizioni correlate ^{3 , 4} . Tuttavia, le proprietà fisiochimiche, come la loro grande dimensione molecolare, la struttura tridimensionale, le cariche superficiali e la natura idrofila, rendono la consegna in vivo di queste macromolecole molto impegnative. Ciò ostacola notevolmente il loro uso clinico ⁴ . Recenti progressi nei sistemi di erogazione di farmaci, come microparticelle, nanoparticelle polimeriche (NP), liposomi e NPs lipidi, hanno superato queste sfide e migliorato significativamente la distribuzione in vivo di macromolecole. HoTuttavia, sono stati rivelati alcuni inconvenienti riguardanti questi carichi di consegna, tra cui la scarsa capacità di caricamento del farmaco, l'efficienza di scarsa entrapment, l'emivita breve, la perdita di bioattività e gli effetti collaterali indesiderati ^{5 , 6 , 7 , 8} . Sistemi di trasporto efficaci rimangono un'area di interesse di ricerca. Inoltre, lo sviluppo di metodi analitici per caratterizzare NPs caricati da droga è più impegnativo per le macromolecole che per le piccole molecole.

La lipoproteina ad alta densità (HDL) è un NP naturale composto da un nucleo lipidico rivestito da apolipoproteine ​​e da un monosilofo fosfolipido. L'HDL endogeno svolge un ruolo fondamentale nel trasporto di lipidi, proteine ​​e acidi nucleici attraverso la sua interazione con i recettori target, come SR-BI, ABCAI e ABCG1. È stato esplorato come veicolo per la consegna di diversi agenti terapeutici ⁹, ^{10 , 11 , 12} . Sono stati sviluppati diversi metodi per preparare NPs che imitano HDL. La dialisi è un approccio popolare. In questo metodo, i NP sono formati dall'idratazione di un film lipidico utilizzando la soluzione di colato di sodio. Il sale viene quindi rimosso attraverso una dialisi di 2 giorni con tre tamponi ¹³ . I metodi di sonicazione fabbricano NP facendo subire una miscela lipidica per 60 min sotto una condizione di riscaldamento; I NP sono ulteriormente purificati mediante gel cromatografia ¹⁴ . La microfluidica genera NP attraverso un dispositivo microfluidico che mescola le soluzioni di fosfolipidi e apolipoproteine ​​AI (Apo AI) creando microvortici in un modello di messa a fuoco ¹⁵ . Chiaramente, questi metodi possono richiedere molto tempo, duri e difficili per la scala industriale.

In questo articolo introdurremo la preparazione e la caratterizzazione di nuovi NPs imitanti HDL per il nervoL'incapsulamento del fattore di crescita (NGF). NGF è un omodimero di polipeptidi legato al disolfuro contenente due monomeri di polipeptidi di 13,6 kDa. È stata sviluppata una nuova procedura per la preparazione dei NP mediante omogeneizzazione, seguita dall'incapsulamento di NGF nei NP. I NP NPN di NGF sono stati caratterizzati per dimensione delle particelle, distribuzione delle dimensioni, potenziale zeta e rilascio in vitro . La loro bioattività è stata valutata per la crescita del neurite nelle cellule PC12. La biodistribuzione di NPs NGF HDL-imitanti è stata confrontata con quella di NGF libera dopo l'iniezione endovenosa nei topi.

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Protocollo

NOTA: Gli studi sugli animali inclusi in tutte le procedure sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali presso l'Università di North Texas Health Science Center.

1. Preparazione delle nanoparticelle NGF HDL-imitanti

1. Sciogliere gli eccipienti, fosfatidilcolina (PC), sfingomielina (SM), fosfatidilserina (PS), colestero olio (CO) e D-a-tocoferil polietilenglicol-succinato (TPGS) in etanolo per preparare soluzioni a 1 mg / ml.
   NOTA: Le soluzioni di stock sono state sottoposte a aliquota e conservate a -20 ° C. L'oleato di colesterilico è stato conservato in bottiglie scure. Le soluzioni PC, SM, PS e CO sono state stabili fino a 6, 3, 12 e 12 mesi rispettivamente a -20 ° C. La soluzione TPGS era stabile per almeno 12 mesi a -20 ° C.
2. Mescolare 10 μL di NGF (1 mg / ml in acqua) con 10 μL di protamina USP (1 mg / ml in acqua) in un tubo di microcentrifuga da 1,5 ml e lasciarlo riposare per 10 minuti a temperatura ambiente aFormare il complesso.
   NOTA: Le soluzioni NGF e protamina sono state sottoposte a aliquota e conservate a -20 ° C. Il congelamento e lo scongelamento ripetuti non sono raccomandati per lo stock NGF.
3. Aggiungere 59 μl di PC, 11 μL di SM, 4 μL di PS, 15 μL di CO e 45 μL di TPGS in una fiala di vetro. Mescolare ed evaporare l'etanolo sotto un flusso nitrico di azoto per circa 5 min; Tutti gli eccipienti devono formare una pellicola sottile e grassa in fondo alla fiala di vetro.
4. Aggiungere 1 ml di acqua ultrapure (tipo 1) alla fiala e omogeneizzare a 9.500 giri / min (8.600 xg) per 5 minuti a temperatura ambiente per formare i prototipi NP.
5. Aggiungere il complesso preparato al punto 1.2 al NP prototipo e incubare a 37 ° C per 30 minuti con agitazione utilizzando una piccola barra di agitazione nel flaconcino di vetro.
   1. Raffreddare i NP in modo da agitare a temperatura ambiente per altri 30 minuti. Dopo questo raffreddamento, aggiungere 106 μL di Apo AI (1,49 mg / ml) e mescolare a temperatura ambiente per una notte per formare la finaleNGF NPN che imitano HDL.

2. Caratterizzazione di nanoparticelle NGF HDL-imitanti

1. Misurare la dimensione delle particelle e il potenziale zeta utilizzando un analizzatore di particelle (vedere la tabella dei materiali) secondo le istruzioni del produttore.
2. Utilizzare una colonna cromatografica di filtrazione a gel agarosio reticolato per separare il NGF scaricato dai NP NPM NGF HDL e determinare l'efficienza di intrappolamento del NGF.
   1. Per la preparazione della colonna, trasferire 15 ml di sospensione di Sepharose 4B-CL in un bicchiere da 50 ml. Mescolare la sospensione del tallone utilizzando una barra di vetro e versare un po 'in una colonna (30 cm di lunghezza × 1 cm di diametro, con una fetta di vetro in basso). Toccare delicatamente la colonna per eliminare le bolle. Lasciare che il solvente venga scaricato e le perle si stabiliscano per qualche minuto.
   2. Continua ad aggiungere la sospensione rimanente. Sciacquare la parete interna della colonna per pulire le perle. Scaricare il solvente finché il livello del solvente è leggermente aBove la parte superiore della fase stazionaria. Lavare e condizionare la colonna con 20 ml di soluzione salina fosfato tamponata 1x (PBS, contenente 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na ₂ HPO ₄ e 2 mM KH ₂ PO ₄ ).
   3. Per determinare le frazioni contenenti NGF scaricate, caricare 200 μL di soluzione NGF (10 μg / mL) sulla colonna di filtrazione gel (25 cm di lunghezza x 1 cm di diametro) e eluire con 1x PBS.
   4. Raccogliere un totale di 12 frazioni (1 mL per ciascuna frazione) e misurare la concentrazione di NGF in ciascuna frazione utilizzando un kit Sandwich ELISA per NGF.
   5. Rileva NGF dalle frazioni da 6 a 10 utilizzando il kit Sandwich ELISA. Ottenere un cromatogramma di NGF scaricato sulla colonna. Lavare la colonna con 20 ml di PBS.
   6. Per determinare le frazioni contenenti NPs NGF HDL-imitanti, caricare 200 μL dei NP sulla colonna e eluire con 1x PBS. Raccogliere un totale di 12 frazioni (1 mL per ogni frazione) e misurare l'intensità delle particelle in ogni frazione uCantare l'analizzatore di particelle. Rileva i NP NGF dalle frazioni da 2 a 4.
      NOTA: L'intensità è un parametro misurato dall'analizzatore delle particelle, che indica quante nanoparticelle possono esistere nella soluzione di prova. Più NP esistono in soluzione, maggiore è l'intensità. Con questo approccio, possiamo confermare che la colonna può separare NGF NP da NGF non scaricato.
   7. Per misurare l'efficienza di entrapamento di NGF, caricare 200 μl di NPG NGF HDL-imitanti sulla colonna e eluire con 1x PBS. Raccogliere complessivamente 12 frazioni (1 mL per ogni frazione).
   8. Misurare la concentrazione NGF scaricata dalle frazioni da 6 a 10 usando il kit Sandwich ELISA.
   9. Aggiungere le quantità NGF misurate fra le frazioni da 6 a 10 come NGF scaricato e calcolare l'efficienza di entrapimento di NGF utilizzando la seguente equazione.
      % EE = (1 - scaricato NGF / totale NGF aggiunto in NP) x 100% equazione (1)

3. In Vitro Release di NGF HDL-mimicking Nanoparticles

1. Studiare in parallelo NGF (10 μg / mL in acqua, n = 4) e NGF HDL-imitanti NP (10 μg / mL; n = 4).
2. Pre-trattare 8 tubi di dialisi (cutoff di peso molecolare: 300 kDa) seguendo le istruzioni del produttore.
3. Preparare 5% di albumina bovina del siero (BSA) in PBS come mezzo di rilascio. Aggiungere 30 ml di mezzo di rilascio a un tubo da centrifuga da 50 ml e scaldare fino a 37 ° C in un agitatore con una velocità di scuotimento a 135 giri / min. Inserire altri 50 ml di mezzo di rilascio nell'evasatore per la sostituzione.
4. Aggiungere 400 μL di mezzo di rilascio nel tubo di dialisi e aggiungere rapidamente 200 μL del campione esaminato per ottenere un volume sufficiente per la dialisi.
5. Chiudere il tubo e mettere rapidamente il tubo di dialisi nel mezzo di rilascio (tubo di centrifuga). Ritirare rapidamente 100 μL del mezzo di rilascio dal tubo di dialisi esterno come campione per il tempo 0. Immediatamente mettere il campione in -20 ° C per ulteriori analisi. Aggiungere 100 μl di frescoImmettere il mezzo nel tubo di centrifuga per sostituire il campione ritirato. Avviare il timer.
6. A 1, 2, 4, 6, 8, 24, 48 e 72 h, prelevare 100 μL del mezzo di rilascio e sostituirlo con 100 μl di terreno fresco. Immediatamente mettere i campioni prelevati in -20 ° C per ulteriori analisi.
7. Dopo 72 h, estrarre tutti i campioni da -20 ° C e scongelarli a temperatura ambiente. Misurare le concentrazioni di NGF dei campioni di rilascio utilizzando il kit Sandwich ELISA.

4. Bioattività delle nanoparticelle NGF HDL-imitanti (studio di crescita dei neuriti)

1. Coltivano le cellule PC12 nel supporto RPMI-1640 integrato con 10% di siero di cavallo caldo inattivato, 5% di siero fetale bovino, 100 μg / mL di streptomicina e 100 unità / ml di penicillina. Mantenere le cellule in un incubatore umidificato a 37 ° C e con 5% CO ₂ .
2. Quando le cellule raggiungono la confluenza di ~ 70-80%, rimuovere il mezzo di coltura e lavare le cellule con 1x PBS (circa 2 ml per 10 cm ^{2 superficie della coltura). Rimuovere la soluzione di lavaggio. Trypsinizzare le cellule con l'aggiunta di 0,25% di soluzione Trypsin-EDTA (0,25% di trysina e 1 mM EDTA, 0,5 ml per superficie di coltura da 10 cm 2 ) nel pallone e incubare a 37 ° C fino a quando non vengono eliminate più cellule.}
3. Aggiungere due volumi di terreno di coltura e spin giù a 180 xg per 5 minuti. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 5 ml di terreno di coltura. Filtrare le cellule attraverso un ago di 22 G, ½ pollici per rompere i cluster di cellule.
4. Distribuire le cellule ad un rapporto di 1: 3 in una nuova colonna di coltura cellulare. Dopo incubazione durante la notte, rimuovere le cellule PC12 non collegate. Lasciare che le cellule collegate rimangano per un'ulteriore crescita.
5. Ripetere questa procedura per 3 passaggi per selezionare la sottocultura di PC12 che ha una forte proprietà di adesione. Preimballare una piastra a 6 pozzetti con 800 μL / pozzetto di collagene di tipo I di ratto (100 μg / ml).
6. Trypsinizzare le celle PC12 selezionate come descritto nel passaggio 4.2 e filtrarle attraverso una22 G, ½ pollici ago per rompere i cluster di cellule. Conte le cellule con un emocitometro. Seed le cellule durante la notte a una densità di 10.000 cellule / pozzetto nella piastra a 6 pozzetti pre-rivestiti nel punto 4.5 per consentire alle cellule di attaccarsi alla piastra.
7. Diluire il NGF (10 μg / mL) e NGF HDL-imitanti NPs (10 μg / mL) con il terreno di coltura (descritto al punto 4.1) per preparare concentrazioni di 0,5, 1, 5, 10, 50 e 100 ng / mL. Rimuovere 2 mL di mezzo da ogni pozzetto e sostituire con 2 mL di NGF liberi diluiti NGF o NGF HDL-imitanti NP. Cultura per 4 giorni.
8. Il giorno 4, cambiare il mezzo medio al fresco (descritto nel punto 4.1) contenente il trattamento corrispondente e proseguire il trattamento per altri 3 giorni.
9. Il giorno 7, visualizza le cellule con un microscopio leggero invertito e immagine ogni pozzetto a punti casuali sotto l'ingrandimento di 10 volte.

5. Biodistribuzione delle nanoparticelle NGF HDL-imitanti

1. Usi i topi adulti BALB / c (maschio, 25-30 g) a tEst la distribuzione dei tessuti dei NP NGF. Ridurre a caso i topi in tre gruppi di 3 topi per gruppo. Utilizzare un contenitore a forma di cono ( ad esempio, decapicone) per trattenere un topo e strofinare la coda con etanolo per promuovere la vasodilatazione e la visibilità della vena.
2. Iniettare 100 μL di NPs nocivi, NGF liberi o NGF HDL, a ciascun gruppo di topi (3 gruppi) attraverso le vene della coda ad una dose di 40 μg / kg di NGF. Usare un ago da 30,5 G attaccato ad una siringa da 1 ml.
3. A 30 minuti dopo l'iniezione, anestetizzano i topi usando l'isoflurano inalato del 3% (in ossigeno a portata di 2 L / min). Esegui una coda e un pizzico per determinare la profondità dell'anestesia. Raccogliere il sangue per foratura cardiaca.
   1. Prendi circa 1 ml di sangue dal cuore. Eutanizzare ogni mouse dalla dislocazione cervicale.
4. Mettere la carcassa del mouse in ricompensa dorsale. Aprire l'addome utilizzando forbici chirurgiche e spostare grasso e intestino da parteUtilizzando un tampone di cotone per esporre il fegato, la milza e il rene. Raccogliere questi tessuti e sciacquarli in 1x PBS per pulire il sangue.
5. Centrifugare immediatamente i campioni di sangue a 3.400 xg e 4 ° C per 5 minuti per ottenere il plasma. Conservare il plasma ei tessuti a -80 ° C fino alle analisi.
6. Per analizzare i campioni di tessuto, spostare i campioni da -80 ° C a 4 ° C e sospendere 100 mg di campione di tessuto in un volume di 10 volte di tampone di estrazione (0,05 M di sodio acetato, 1,0 M di cloruro di sodio, 1% di tritone X-100, 1% BSA, 0,2 mM fenilmetanesolfonilfluoruro e 0,2 mM benzetonio cloruro). Homogenizzare a 10.000 giri / min e 4 ° C per 5 min.
7. Sacrificare due topi non trattati per raccogliere plasma e tessuti vuoti, come descritto nei passaggi 5.3 e 5.4. Preparare soluzioni standard NGF usando omogenei in polvere vuota o in tessuto vuoto.
8. Determinare le concentrazioni di NGF nei homogenati del plasma e del tessuto utilizzando il kit Sandwich ELISA, come sopra descritto.

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Risultati

Nella figura 1 è mostrato lo schema di ingegnerizzazione dei NPs NGF rivestiti con α-tocoferolo emulsionati in HDL preparati da una strategia di ioni-coppia. Per neutralizzare le cariche superficiali di NGF, la protamina USP è stata usata come agente di ioni-coppia per formare un complesso con NGF. Per proteggere la bioattività, sono stati progettati prototipi NPs che imitano HDL, in primo luogo utilizzando l'omogeneizzazione; Quindi il complesso NGF / protamina ...

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Discussione

In questo studio dimostriamo un metodo semplice per preparare NPs imitanti HDL per l'incapsulamento di NGF. Sono stati studiati diversi sistemi di erogazione di NP per fornire proteine. Attualmente, molti preparati NP coinvolgono la dialisi, la precipitazione dei solventi e l'idratazione del film. Questi processi sono generalmente complessi e impegnativi in ​​termini di scalabilità. Durante questo sviluppo di NP, è stato determinato che i lipidi avevano una forte adesione alla parete di vetro del contenito...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Recombinant Human Beta-NGF	Creative Biomart	NGF-05H
L-α-Phosphatidylcholine (PC)	Avanti	131601P	95%, Egg, Chicken
Sphingomyelin (SM)	Avanti	860062P	Brain, Porcine
Phosphatidylserine (PS)	Avanti	840032P	Brain, Porcine
Cholesteryl oleate (CO)	Sigma	C9253
D-α-Tocopheryl polyethylene glycol succinate (TPGS)	BASF	9002-96-4	Vitamin E Polyethylene Glycol Succinate
Protamine sulfate	Sigma	P3369	meets USP testing specifications
Apolipoprotein A1, Human plasma	Athens Research & Technology	16-16-120101	1 mg in 671 µL 10 mM NH4HCO3, pH 7.4
Sepharose 4B-CL	Sigma	CL4B200	Cross-linked agarose,  gel filtration chromatography column filling material
Sandwich ELISA Kit for NGF	R&D system	DY008
Bovine Serum Albumin	Sigma	A2153
RPMI-1640 medium	GE Healthcare Life Science	SH30096.02
Horse serum	GE Healthcare Life Science	SH30074.03
Fetal bovine serum	Gibco	10082147
PC12 cells	ATCC	CRL-1721
Rat tail collagen type I	Sigma	C3867
Sodium acetate	Sigma	S2889
Sodium chloride	Sigma	31414
Triton X-100	Sigma	T8787
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)	Sigma	P7626
Benzethonium chloride	Sigma	B8879
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Homogenizer	Tekmar	T 25-S1
Delsa Nano HC particle analyzer	Beckman-Coulter	Delsa Nano HC
Float-A-Lyzer G2 Dialysis Device	Spectrum Laboratories	G235036	Molecule Cutoff 300 kDa
Centrifuge	Eppendoff	5424R
Polytron homogenizer	Kinematica	PT 1200C
DecapiCone	Braintree Scientific Inc.	DC-M200