Preparação e caracterização de novas nanopartículas simuladoras de HDL para encapsulação de fatores de crescimento nervoso

Resumo

Utilizou-se homogeneização simples para preparar novas nanopartículas imitando lipoproteínas de alta densidade para encapsular o factor de crescimento nervoso. Desafios, protocolos detalhados para a preparação de nanopartículas, caracterização in vitro e estudos in vivo são descritos neste artigo.

Resumo

O objetivo deste artigo é introduzir métodos de preparação e caracterização de nanopartículas (NPs) de nanopartículas de alta densidade, lipoproteínas (NPs) carregadas com fator de crescimento nervoso (NGF). As HDLs são NPs endógenas e foram exploradas como veículos para a administração de agentes terapêuticos. Vários métodos foram desenvolvidos para preparar NPs que imitam o HDL. No entanto, eles são geralmente complicados, demorados e difíceis para a escala industrial up. Neste estudo, a homogeneização em uma etapa foi utilizada para misturar os excipientes e formar o protótipo NPs. O NGF é uma proteína solúvel em água de 26 kDa. Para facilitar a encapsulação de NGF no ambiente lipídico de NPs que imitam HDL, utilizou-se protamina USP para formar um complexo de pares de iões com NGF para neutralizar as cargas na superfície de NGF. O NGF / complexo de protamina foi então introduzido no protótipo NPs. A apolipoproteína AI foi finalmente revestida na superfície dos NPs. NGF HDL imitando NPs mostraram propriedades preferíveis em termosS de tamanho de partícula, distribuição de tamanho, eficiência de aprisionamento, liberação in vitro , bioatividade e biodistribuição. Com o cuidadoso desenho e exploração da homogeneização em NPs que imitam HDL, o procedimento foi grandemente simplificado e as NPs foram feitas escalonáveis. Além disso, foram superados vários desafios, como separar o NGF não carregado dos NPs, realizar estudos confiáveis ​​de liberação in vitro e medir a bioatividade dos NPs.

Introdução

As macromoléculas, como proteínas, peptídeos e ácidos nucleicos, têm emergido como medicamentos promissores e ganharam considerável atenção nas últimas décadas ^{1 , 2} . Devido à sua alta eficácia e modos de ação específicos, eles apresentam grande potencial terapêutico para os tratamentos de câncer, doenças imunes, HIV, e condições relacionadas ^{3 , 4} . No entanto, as propriedades físico-químicas, tais como o seu grande tamanho molecular, estrutura tridimensional, cargas de superfície e natureza hidrofílica, tornam a introdução in vivo destas macromoléculas muito desafiadora. Isto dificulta consideravelmente o seu uso clínico ⁴ . Avanços recentes em sistemas de libertação de fármacos, tais como micropartículas, nanopartículas de polímero (NPs), lipossomas e NPs lipídicos superaram estes desafios e melhoraram significativamente a administração in vivo de macromoléculas. HoAlgumas desvantagens quanto a estas cargas de entrega foram reveladas, incluindo baixa capacidade de carga de droga, baixa eficiência de aprisionamento, meia-vida curta, perda de bioatividade e efeitos colaterais indesejáveis ^{5 , 6 , 7 , 8} . Sistemas portadores eficazes continuam a ser uma área de interesse de pesquisa. Além disso, o desenvolvimento de métodos analíticos para caracterizar NPs carregados de fármaco é mais desafiador para macromoléculas do que para moléculas pequenas.

A lipoproteína de alta densidade (HDL) é um NP natural composto de um núcleo lipídico que é revestido por apolipoproteínas e uma monocamada de fosfolípidos. O HDL endógeno desempenha um papel crítico no transporte de lípidos, proteínas e ácidos nucleicos através da sua interacção com receptores alvo, tais como SR-BI, ABCAI e ABCG1. Foi explorado como um veículo para a distribuição de diferentes agentes terapêuticos ⁹, ^{10 , 11 , 12} . Vários métodos foram desenvolvidos para preparar NPs que imitam o HDL. A diálise é uma abordagem popular. Neste método, os NPs são formados por hidratação de um filme lipídico utilizando solução de colato de sódio. O sal é então removido através de uma diálise de 2 dias com três tampões ¹³ . Os métodos de sonicação fabricam NPs por sonicação de uma mistura de lípidos durante 60 min sob uma condição de aquecimento; As NPs são ainda purificadas através de cromatografia em gel ¹⁴ . Microfluídica gera NPs através de um dispositivo microfluídico, que mistura fosfolipídios e apolipoproteína AI (Apo AI) soluções, criando microvórtices em um padrão de focalização [ ^15] . Claramente, estes métodos podem ser demorados, duros, e difíceis para o scale-up industrial.

Neste artigo, apresentamos a preparação e caracterização de novos NPs simuladores de HDL paraEncapsulamento de factor de crescimento (NGF). O NGF é um homodímero de polipéptido ligado por dissulfureto contendo dois monómeros de polipéptido de 13,6 kDa. Foi desenvolvido um novo procedimento para preparar as NPs por homogeneização, seguido pela encapsulação de NGF nas NPs. As NPs simuladoras de HDL de NGF foram caracterizadas quanto ao tamanho de partícula, distribuição de tamanho, potencial zeta e libertação in vitro . A sua bioactividade foi avaliada quanto ao crescimento de neurites em células PC12. A biodistribuição de NGF HDL-imitando NPs foi comparada com a de NGF livre após injecção intravenosa em ratinhos.

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Protocolo

NOTA: Os estudos em animais incluídos em todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais no Centro de Ciências da Saúde da Universidade do Norte de Texas.

1. Preparação de nanopartículas NGF HDL-imitando

1. Dissolver os excipientes, fosfatidilcolina (PC), esfingomielina (SM), fosfatidilserina (PS), oleato de colesterilo (CO) e succinato de D-α-tocoferil polietilenoglicol (TPGS), em etanol para preparar soluções-mãe a 1 mg / mL.
   NOTA: As soluções stock foram aliquotadas e armazenadas a -20 ° C. O oleato de colesterilo foi armazenado em garrafas escuras. As soluções mãe PC, SM, PS e CO foram estáveis ​​até 6, 3, 12 e 12 meses, respectivamente, a -20 ° C. A solução de TPGS foi estável durante pelo menos 12 meses a -20 ° C.
2. Misturar 10 μL de NGF (1 mg / mL em água) com 10 μL de protamina USP (1 mg / mL em água) num tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e deixar repousar durante 10 minutos à temperatura ambiente paraForma o complexo.
   NOTA: As soluções stock de NGF e protamina foram aliquotadas e armazenadas a -20 ° C. O congelamento e descongelamento repetidos não são recomendados para o stock de NGF.
3. Adicionar 59 μL de PC, 11 μL de SM, 4 μL de PS, 15 μL de CO e 45 μL de TPGS num frasco de vidro. Misturar e evaporar o etanol sob uma corrente de azoto suave durante cerca de 5 min; Todos os excipientes devem formar uma película fina e oleosa na parte inferior do frasco de vidro.
4. Adicionar 1 mL de água ultrapura (tipo 1) ao frasco e homogeneizar a 9.500 rpm (8.600 xg) durante 5 min à temperatura ambiente para formar o protótipo NPs.
5. Adicionar o complexo preparado no passo 1.2 ao protótipo de NPs e incubar a 37 ° C durante 30 min com agitação utilizando uma pequena barra de agitação no frasco de vidro.
   1. Arrefecer os NPs por agitação à temperatura ambiente durante mais 30 min. Após esta arrefecer, adicionar 106 μL de Apo AI (1,49 mg / mL) e agitar à temperatura ambiente durante a noite para formar a solução finalNGF HDL imitando NPs.

2. Caracterização de nanopartículas NGF HDL-imitando

1. Medir o tamanho de partícula eo potencial zeta usando um analisador de partículas (veja a Tabela de Materiais) de acordo com as instruções do fabricante.
2. Utiliza-se uma coluna de cromatografia de filtração em gel de agarose reticulada para separar o NGF não carregado das NPs que imitam o HDL de NGF e determinar a eficiência de retenção do NGF.
   1. Para a preparação da coluna, transferir 15 mL de suspensão de Sepharose 4B-CL para um copo de 50 mL. Agitar a suspensão de pérolas usando uma haste de vidro e despejar um pouco em uma coluna (30 cm de comprimento x 1 cm de diâmetro, com uma frita de vidro na parte inferior). Toque suavemente a coluna para se livrar das bolhas. Permitir que o solvente para drenar e as pérolas para resolver por alguns minutos.
   2. Continue adicionando a suspensão restante. Enxágüe a parede interna da coluna para limpar os grânulos. Drenar o solvente até o nível de solvente ser ligeiramenteBove o topo da fase estacionária. Lavar e condicionar a coluna com 20 mL de solução salina tamponada com fosfato 1x (PBS, contendo NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, Na2HPO4 8 mM e KH2PO4 ₂ mM).
   3. Para determinar as fracções contendo NGF não carregado, introduzir 200 μL de solução de NGF (10 μg / mL) na coluna de filtração em gel (25 cm de comprimento x 1 cm de diâmetro) e eluir com 1x PBS.
   4. Recolher um total de 12 fracções (1 mL para cada fracção) e medir a concentração de NGF em cada fracção utilizando um kit ELISA de Sandwich para NGF.
   5. Detectar NGF a partir das fracções 6 a 10 utilizando o kit Sandwich ELISA. Obter um cromatograma de NGF não carregado na coluna. Lavar a coluna com 20 mL de PBS.
   6. Para determinar as fracções contendo NPs que imitam o HDL de NGF, carregue 200 μL dos NPs sobre a coluna e elui-se com 1x PBS. Recolher um total de 12 frações (1 mL para cada fração) e medir a intensidade de partículas em cada fração uO analisador de tamanho de partícula. Detectar os NGF NPs das fracções 2 a 4.
      NOTA: A intensidade é um parâmetro medido pelo analisador de partículas, que indica quantas nanopartículas podem existir na solução de teste. Quanto mais NPs existem em solução, maior a intensidade é. Por esta abordagem, podemos confirmar que a coluna pode separar NGF NPs de NGF não carregado.
   7. Para medir a eficiência de retenção de NGF, carregue 200 μL de NPs que imitam o NGF HDL para a coluna e elui-se com 1x PBS. Recolher um total de 12 fracções (1 mL para cada fracção).
   8. Medir a concentração de NGF não descarregada das fracções 6 a 10 utilizando o kit Sandwich ELISA.
   9. Adicionar as quantidades de NGF medidas a partir das fracções 6 a 10 juntas como o NGF não carregado e calcular a eficiência de retenção de NGF utilizando a equação seguinte.
      % EE = (1 - NGF não carregado / NGF total adicionado ao NP) x 100% Equação (1)

3. Libertação in vitro de NGF HDL-mimicando nanopartículas

1. Estudo de NGF livre (10 μg / mL em água, n = 4) e NGF HDL imitando NPs (10 μg / mL, n = 4) em paralelo.
2. Pre-treat 8 tubos de diálise (peso molecular de corte: 300 kDa), seguindo as instruções do fabricante.
3. Preparar 5% de albumina de soro bovino (BSA) em PBS como meio de libertação. Adicionar 30 mL de meio de libertação a um tubo de centrífuga de 50 mL e aquecer até 37 ° C num agitador com uma velocidade de agitação de 135 rpm. Coloque mais 50 ml de meio de liberação no agitador para substituição.
4. Adicionar 400 μL de meio de libertação ao tubo de diálise e adicionar rapidamente 200 μL da amostra testada para obter volume suficiente para diálise.
5. Feche o tubo e coloque rapidamente o tubo de diálise no meio de libertação (o tubo de centrífuga). Retire rapidamente 100 μL do meio de libertação do tubo de diálise exterior como amostra para o tempo 0. Coloque imediatamente a amostra em -20 ° C para análise posterior. Adicionar 100 μL deLeasing no tubo de centrifugação para substituir a amostra retirada. Inicie o temporizador.
6. A 1, 2, 4, 6, 8, 24, 48 e 72 h, retirar 100 μL do meio de libertação e substituí-lo por 100 μL de meio fresco. Colocar imediatamente as amostras retiradas em -20 ° C para análise posterior.
7. Após 72 h, retirar todas as amostras de -20 ° C e descongelá-las à temperatura ambiente. Meça as concentrações de NGF das amostras de libertação utilizando o kit Sandwich ELISA.

4. Bioatividade de nanopartículas que simulam HDL de NGF (Estudo de Crescimento de Neurite)

1. Células PC12 de cultura em meio RPMI-1640 suplementado com 10% de soro de cavalo inactivado pelo calor, 5% de soro de bovino fetal, 100 μg / mL de estreptomicina e 100 unidades / mL de penicilina. Manter as células numa incubadora humidificada a 37 ° C e com 5% de CO2.
2. Quando as células atingem ~ 70-80% de confluência, remover o meio de cultura e lavar as células com 1x PBS (aproximadamente 2 mL por 10 cm ^{2 área de superfície de cultura). Remover a solução de lavagem. Trypsinize as células por adição de 0,25% de solução de tripsina-EDTA (0,25% de tripsina e 1 mM EDTA, 0,5 mL por 10 cm 2 área de superfície de cultura) para o frasco e incubar a 37 ° C até a maioria das células são destacados.}
3. Adicionar dois volumes de meio de cultura e girar para baixo a 180 xg durante 5 min. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em 5 mL de meio de cultura. Filtrar as células através de uma agulha de 22 G, ½ polegada para quebrar clusters de células.
4. Dividir as células numa proporção de 1: 3 num novo frasco de cultura de células. Após incubação durante a noite, remover as células PC12 não ligadas. Permitir que as células anexadas para permanecer para o crescimento.
5. Repita este procedimento para 3 passagens para selecionar a subcultura de PC12 que tem uma forte propriedade de adesão. Pré-revestir uma placa de 6 poços com 800 μL / poço de colágeno de cauda de rato tipo I (100 μg / mL).
6. Trypsinize as células PC12 selecionadas como descrito no passo 4.2 e filtrá-las através de um22 G, agulha de ½ polegada para quebrar os aglomerados de células. Conte as células com um hemocitômetro. Semear as células durante a noite a uma densidade de 10.000 células / poço na placa de 6 poços pré-revestida no passo 4.5 para permitir que as células se liguem à placa.
7. Diluir NPs (10 μg / mL) com NGF livre (10 μg / mL) e NGF HDL com o meio de cultura (descrito no passo 4.1) para preparar concentrações de 0,5, 1, 5, 10, 50 e 100 ng / mL. Remover 2 mL de meio de cada poço e substituir com 2 mL do NGF livre diluído ou NGF HDL imitando NPs. Cultura durante 4 dias.
8. No dia 4, mude o meio para meio fresco (descrito no passo 4.1) contendo o tratamento correspondente e continue o tratamento durante mais 3 dias.
9. No dia 7, visualize as células com um microscópio de luz invertida e imagem cada poço em pontos aleatórios sob ampliação 10X.

5. Biodistribuição de nanopartículas NGF HDL-imitando

1. Utilizar ratos BALB / c adultos (macho, 25-30 g) para tÉ a distribuição tecidual de NGF NPs. Distribua aleatoriamente os ratinhos em três grupos de 3 ratinhos por grupo. Use um sistema de retenção em forma de cone plástico ( por exemplo, decapicone) para restringir um mouse e limpe a cauda com etanol para promover a vasodilatação ea visibilidade da veia.
2. Injectar 100 μL de NPs de solução salina, NGF livre ou NGF HDL-imitando cada grupo de ratinhos (3 grupos) através das veias da cauda numa dose de 40 μg / kg de NGF. Use uma agulha de 30½ G presa a uma seringa de 1 mL.
3. Aos 30 minutos após a injecção, anestesiar os ratinhos utilizando isoflurano inalado a 3% (em oxigénio a uma taxa de fluxo de 2 L / min). Executar uma pinça de cauda e dedo do pé para determinar a profundidade da anestesia. Recolher sangue por punção cardíaca.
   1. Retirar aproximadamente 1 mL de sangue do coração. Eutanizar cada rato por deslocamento cervical.
4. Coloque a carcaça do mouse em decúbito dorsal. Abra o abdômen com tesoura cirúrgica e mova a gordura eo intestino de ladoUsando um cotonete para expor o fígado, baço e rim. Colher estes tecidos e enxaguá-los em 1x PBS para limpar o sangue.
5. Centrifugar imediatamente as amostras de sangue a 3,400 xg e 4 ° C durante 5 min para se obter o plasma. Armazenar o plasma e tecidos a -80 ° C até as análises.
6. Para analisar as amostras de tecido, mover as amostras de -80 ° C para 4 ° C e suspender 100 mg de amostra de tecido num volume 10x de tampão de extracção (acetato de sódio 0,05 M, cloreto de sódio 1,0 M, 1% de triton X-100, 1% de BSA, 0,2 mM de fluoreto de fenilmetanossulfonilo e 0,2 mM de cloreto de benzetónio). Homogeneizar a 10 000 rpm e 4 ° C durante 5 min.
7. Sacrifique dois ratinhos não tratados para recolher plasma e tecidos em branco, como descrito nos passos 5.3 e 5.4. Preparar soluções padronizadas de NGF utilizando homogeneizados de plasma em branco ou de tecido em branco.
8. Determine as concentrações de NGF nos homogeneizados de plasma e de tecido utilizando o kit ELISA de Sandwich, como descrito acima.

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Resultados

O esquema de engenharia de NGF NPs revestidos com α-tocoferol, imitando o HDL, preparado por uma estratégia de pares de iões é mostrado na Figura 1 . Para neutralizar as cargas superficiais de NGF, utilizou-se a protamina USP como um agente de pares de iões para formar um complexo com NGF. Para proteger a bioatividade, os protótipos de NPs simuladores de HDL foram projetados, primeiro usando homogeneização; Depois, o complexo NGF / protamina foi encapsulado no pr...

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Discussão

Neste estudo, demonstramos um método simples para preparar NPs que imitam o HDL para o encapsulamento de NGF. Vários sistemas de libertação de NP foram estudados para fornecer proteínas. Atualmente, muitas preparações de NP envolvem diálise, precipitação com solvente e hidratação de filme. Esses processos são geralmente complicados e desafiadores na escala-up. Durante este desenvolvimento de NP, determinou-se que os lípidos tinham uma forte aderência à parede de vidro do recipiente, o que levou às dific...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Recombinant Human Beta-NGF	Creative Biomart	NGF-05H
L-α-Phosphatidylcholine (PC)	Avanti	131601P	95%, Egg, Chicken
Sphingomyelin (SM)	Avanti	860062P	Brain, Porcine
Phosphatidylserine (PS)	Avanti	840032P	Brain, Porcine
Cholesteryl oleate (CO)	Sigma	C9253
D-α-Tocopheryl polyethylene glycol succinate (TPGS)	BASF	9002-96-4	Vitamin E Polyethylene Glycol Succinate
Protamine sulfate	Sigma	P3369	meets USP testing specifications
Apolipoprotein A1, Human plasma	Athens Research & Technology	16-16-120101	1 mg in 671 µL 10 mM NH4HCO3, pH 7.4
Sepharose 4B-CL	Sigma	CL4B200	Cross-linked agarose,  gel filtration chromatography column filling material
Sandwich ELISA Kit for NGF	R&D system	DY008
Bovine Serum Albumin	Sigma	A2153
RPMI-1640 medium	GE Healthcare Life Science	SH30096.02
Horse serum	GE Healthcare Life Science	SH30074.03
Fetal bovine serum	Gibco	10082147
PC12 cells	ATCC	CRL-1721
Rat tail collagen type I	Sigma	C3867
Sodium acetate	Sigma	S2889
Sodium chloride	Sigma	31414
Triton X-100	Sigma	T8787
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)	Sigma	P7626
Benzethonium chloride	Sigma	B8879
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Homogenizer	Tekmar	T 25-S1
Delsa Nano HC particle analyzer	Beckman-Coulter	Delsa Nano HC
Float-A-Lyzer G2 Dialysis Device	Spectrum Laboratories	G235036	Molecule Cutoff 300 kDa
Centrifuge	Eppendoff	5424R
Polytron homogenizer	Kinematica	PT 1200C
DecapiCone	Braintree Scientific Inc.	DC-M200