신경 성장 인자 인 캡슐 레이션을위한 새로운 HDL 모방 나노 입자의 제조 및 특성 규명

요약

간단한 균질화를 사용하여 신경 성장 인자를 캡슐화하기위한 고밀도의 고밀도 지단백질 모방 나노 입자를 제조 하였다. 과제, nanoparticle 준비, 시험관 특성 및 생체 내 연구에 대한 자세한 프로토콜은이 문서에서 설명합니다.

초록

이 기사의 목적은 신경 성장 인자 (NGF) - 부하 된 고밀도 지단백질 (HDL) - 흉내내는 나노 입자 (NP)에 대한 준비 및 특성화 방법을 소개하는 것입니다. HDL은 내인성 NP이며 치료제를 전달하기위한 수단으로 사용됩니다. HDL 모방 NP를 제조하기위한 다양한 방법이 개발되었다. 그러나, 이들은 일반적으로 복잡하고, 시간 소모적이며, 산업적 규모면에서 어렵다. 이 연구에서는 1 단계 균질화를 사용하여 부형제를 혼합하고 원형 NP를 형성했습니다. NGF는 26 kDa의 수용성 단백질이다. HDL 모방 NP의 지질 환경으로의 NGF 캡슐화를 촉진하기 위해 프로타민 USP를 사용하여 NGF와 이온 쌍을 형성시켜 NGF 표면의 전하를 중화시켰다. NGF / 프로타민 복합체는 원형 NP에 도입되었다. 최종적으로 Apolipoprotein AI가 NP의 표면에 코팅되었다. NGF HDL 모방 NP는 장기간에 바람직한 특성을 보였다입자 크기, 크기 분포, 포착 효율, 생체 외 방출, 생체 활성 및 생체 분포에 관한 정보를 제공합니다. HDL 모방 NP의 조심스럽게 설계 및 균질화를 통해 절차가 크게 단순화되었으며 NP는 확장 성을 갖게되었습니다. 더욱이, NP로부터 무부하 NGF를 분리하고, 신뢰할 수 있는 시험 관내 방출 연구를 수행하고, NP 의 생체 활성을 측정하는 것과 같은 다양한 과제가 극복되었다.

서문

단백질, 펩타이드 및 핵산과 같은 거대 분자는 유망한 약물로 등장하여 지난 수십 년 동안 상당한 주목을 받았다. 높은 효능과 특수한 행동 방식으로 인해 암, 면역 질환, HIV 및 관련 질병 치료에 큰 치료 잠재력을 나타냅니다 ^{3 , 4} . 그러나, 큰 분자 크기, 3 차원 구조, 표면 전하 및 친수성과 같은 물리 화학적 성질은 이러한 거대 분자의 생체 내 전달을 매우 어렵게 만든다. 이것은 그들의 임상 적 사용을 상당히 방해한다. 미립자, 고분자 나노 입자 (NP), 리포좀 및 지질 NP와 같은 약물 전달 시스템의 최근 발전은 이러한 과제를 극복하고 고분자 의 생체 내 전달을 크게 향상시켰다. 호경미한 로딩 용량, 낮은 포착 효율, 짧은 반감기, 생체 활성 상실 및 바람직하지 못한 부작용 ^{5 , 6 , 7 , 8을 포함} 하여 이러한 운반화물에 관한 몇 가지 단점이 밝혀졌습니다. 효과적인 운송 시스템은 여전히 ​​연구 관심 분야입니다. 더욱이, 약물 로딩 된 NP를 특성화하기위한 분석 방법의 개발은 작은 분자에 비해 거대 분자에 대해 더욱 어렵습니다.

고밀도 지단백질 (HDL)은 아포지 단백질 (apolipoproteins)과 인지질 단층 (phospholipid monolayer)으로 코팅 된 지질 코어로 구성된 천연 NP입니다. 내인성 HDL은 SR-BI, ABCAI 및 ABCG1과 같은 표적 수용체와의 상호 작용을 통해 지질, 단백질 및 핵산의 전달에 중요한 역할을합니다. 다른 치료제를 전달하기위한 수단으로 탐구되어왔다., ^{10 , 11 , 12} . HDL 모방 NP를 제조하기위한 다양한 방법이 개발되었다. 투석은 널리 사용되는 방법입니다. 이 방법에서는 NP 콜레스테롤 솔루션을 사용하여 지질 필름을 수화하여 NPs가 형성됩니다. 그런 다음 소금을 3 개의 완충액으로 2 일간 투석하여 제거합니다 ¹³ . Sonication 방법은 가열 조건 하에서 60 분 동안 지질 혼합물을 초음파 처리하여 NP를 제조한다. NP는 겔 크로마토 그래피 ¹⁴ 를 통해 추가로 정제된다. Microfluidics는 농축 패턴 ¹⁵ microvortices을 만들어서 phospholipids과 apolipoprotein AI (Apo AI) 솔루션을 혼합 microfluidic 장치를 통해 NPs를 생성합니다. 분명히, 이러한 방법은 시간이 많이 걸리고, 거칠며, 산업 규모가 커질 수 있습니다.

이 기사에서는 신경을위한 새로운 HDL 모방 NP의 준비와 특성화를 소개합니다성장 인자 (NGF) 캡슐화. NGF는 2 개의 13.6 kDa 폴리펩티드 단량체를 함유하는 이황화 결합 폴리 펩타이드 호모 다이머이다. NGF를 NP에 캡슐화 한 후 균질화하여 NP를 제조하는 새로운 방법이 개발되었다. NGF HDL 모방 NP는 입자 크기, 크기 분포, 제타 전위 및 시험관 내 방출 에 대해 특징 지어졌다. 이들의 생체 활성을 PC12 세포에서 신경 돌기 성장 (neurite outgrowth)으로 평가 하였다. NGF HDL 모방 NP의 생체 분포는 생쥐에서의 정맥 주사 후 유리 NGF의 생체 분포와 비교되었다.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

프로토콜

참고 : 모든 절차에 포함 된 동물 연구는 노스 텍사스 보건 과학 센터의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았습니다.

1. NGF HDL을 모방 한 나노 입자의 제조

1. 부형제 인 포스파티딜콜린 (PC), 스 핑고 미엘린 (SM), 포스파티딜 세린 (PS), 콜레 스테 릴 올레 에이트 (CO) 및 D-α- 토코 페릴 폴리에틸렌 글리콜 석시 네이트 (TPGS)를 에탄올에 용해시켜 1 mg / mL의 원액을 제조하십시오.
   참고 : 저장 용액을 나누어서 -20 ° C에 보관하십시오. 콜레스테롤 올레 에이트는 어두운 병에 보관되었습니다. PC, SM, PS 및 CO 저장 용액은 -20 ℃에서 각각 6, 3, 12, 12 개월 동안 안정했다. TPGS 용액은 -20 ℃에서 12 개월 이상 안정했다.
2. 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브에 프로타민 USP (물에 1 MG / ML) 10 μL와 NGF (물에 1 MG / ML) 10 μL를 섞어서 실온에서 10 분 동안 서게하십시오복합체를 형성합니다.
   참고 : NGF와 프로타민 원액을 분주하고 -20 ° C에서 보관하십시오. 반복되는 동결 및 해동은 NGF 주식에는 권장되지 않습니다.
3. 유리 병에 PC 59 μL, SM 11 μL, PS 4 μL, CO 15 μL 및 TPGS 45 μL를 넣으십시오. 약 5 분 동안 약하게 질소 스트림하에 에탄올을 혼합하고 증발시켰다; 모든 부형제는 유리 병의 바닥에 유성 박막을 형성해야합니다.
4. 바이알에 초순수 (1) 물 1 mL를 넣고 실온에서 5 분간 9,500 rpm (8,600 xg)으로 균질화하여 원형 NP를 만듭니다.
5. 프로토 타입 NPs에 1.2 단계에서 준비된 복합체를 첨가하고 37 ℃에서 30 분 동안 배양 한 다음 유리 병에 작은 교반 막대를 사용하여 저어 준다.
   1. 실온에서 30 분 더 교반하여 NP를 냉각시킨다. 이 냉각 후, 106 μL의 Apo AI (1.49 mg / mL)를 첨가하고 실온에서 밤새 교반하여 최종NGF HDL- 모방 NPs.

2. NGF HDL - 모방 Nanoparticles의 특성

1. 입자 분석기 (재료 표 참조)를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 입자 크기 및 제타 전위를 측정합니다.
2. 교차 연결된 아가로 오스 겔 여과 크로마토 그래피 컬럼을 사용하여 NGF HDL 모방 NP로부터 언로드 된 NGF를 분리하고 NGF의 포착 효율을 결정합니다.
   1. 컬럼 준비를 위해 Sepharose 4B-CL 현탁액 15 mL를 50 mL 비커에 옮긴다. 유리 막대를 사용하여 비드 서스펜션을 저어주고 일부 (30cm 길이 × 1cm 직경, 유리 프릿이 바닥에 있음)에 붓는다. 부드럽게 열을 눌러 거품을 제거하십시오. 용매를 배출시키고 몇 분 동안 비드가 안정되도록하십시오.
   2. 나머지 서스펜션을 계속 추가하십시오. 비드를 청소하려면 컬럼의 내부 벽을 헹구십시오. 용매 레벨이 약간 옅어 질 때까지 용매를 배출하십시오.정지 단계의 상단. 1x 인산염 완충 식염수 (PBS, 137 MM NaCl, 2.7 MM KCl, 8 MM Na ₂ HPO ₄ 및 2 MM KH ₂ PO ₄ 함유)의 20 mL로 컬럼을 세척하고 컨디셔닝한다.
   3. 무부하 NGF를 포함하는 분수를 결정하기 위해 겔 여과 컬럼 (길이 25cm, 직경 1cm)에 200μL의 NGF 용액 (10 μg / mL)을 넣고 1X PBS로 용리한다.
   4. NGF에 대한 샌드위치 ELISA 키트를 사용하여 총 12 분획 (각 분획마다 1 mL)을 수집하고 각 분획에서 NGF의 농도를 측정합니다.
   5. 샌드위치 ELISA 키트를 사용하여 분수 6에서 10까지의 NGF를 검출합니다. 컬럼에서 NGF가 제거 된 크로마토 그램을 얻습니다. PBS 20 mL로 칼럼을 씻는다.
   6. NGF HDL - 모방 NP를 함유하는 분획을 결정하기 위해, 200 ㎕의 NP를 컬럼에 로딩시키고 1x PBS로 용리시킨다. 총 12 개의 분수 (각 분획에 대해 1 mL)를 수집하고 각 분획에서 입자의 강도를 측정한다.입자 크기 분석기를 부릅니다. NGF NP를 분획 2에서 4까지 검출한다.
      참고 : 강도는 입자 분석기에서 측정 한 매개 변수로, 테스트 솔루션에 몇 개의 나노 입자가 존재 하는지를 알려줍니다. 솔루션에 더 많은 NP가 존재할수록 강도가 높아집니다. 이러한 접근에 의해, 컬럼이 NGF NP를 무 하중 NGF로부터 분리 할 수 ​​있음을 확인할 수있다.
   7. NGF의 포착 효율을 측정하기 위해 200 μL의 NGF HDL 모방 NP를 컬럼에 넣고 1X PBS로 용리한다. 총 12 개의 분획 (각 분획마다 1 mL)을 수집하십시오.
   8. 샌드위치 ELISA 키트를 사용하여 분획 6에서 10까지 무부하 NGF 농도를 측정합니다.
   9. 분획 6에서 10까지 측정 된 NGF 양을 무부하 NGF와 함께 더하고 다음 식을 사용하여 NGF의 포집 효율을 계산하십시오.
      % EE = (1- 무부하 NGF / NP에 첨가 된 총 NGF) × 100 % 식 (1)

3. NGF HDL의 체외 방출- 나노 입자를 흉내 낸다.

1. NGF (물에서 10 μg / mL, N = 4)와 NGF HDL을 모방 한 NP (10 μg / mL, n = 4)를 병행하여 연구합니다.
2. 제조사의 지시에 따라 8 개의 투석 튜브 (분자량 컷오프 : 300 kDa)를 전처리하십시오.
3. 릴리스 매체로 PBS에 5 % 소 혈청 알부민 (BSA)을 준비합니다. 50 mL 원심 분리 관에 이형 배지 30 mL를 넣고 흔들어 속도 135 rpm의 쉐이커에서 37 ° C까지 따뜻하게한다. 교체 용 쉐이커에 방출 매체 50 mL를 넣으십시오.
4. 투석 튜브에 릴리스 매체 400 μL를 추가하고 신속하게 투석을위한 충분한 볼륨을 만들기 위해 테스트 샘플의 200 μL를 추가합니다.
5. 튜브를 닫고 신속하게 투석 튜브를 방출 매체 (원심 분리 튜브)에 넣으십시오. 나중에 0 시간 동안 외부 투석 튜브에서 방출 매체 100 μL를 채취하십시오. 나중에 분석 할 수 있도록 즉시 샘플을 -20 ° C에 넣으십시오. 신선한 다시 100 μL를 추가하십시오회수 된 샘플을 대체하기 위해 원심 분리 관 안으로 배지를 임대하십시오. 타이머를 시작하십시오.
6. 1, 2, 4, 6, 8, 24, 48 및 72 시간에 100 μL의 방출 매질을 꺼내 100 μL의 새로운 매질로 대체하십시오. 즉시 분석 된 샘플을 나중에 분석을 위해 -20 ° C에 넣으십시오.
7. 72 시간 후 -20 ° C에서 모든 시료를 꺼내 실온에서 녹입니다. 샌드위치 ELISA 키트를 사용하여 릴리스 샘플의 NGF 농도를 측정합니다.

4. NGF HDL - 모방 Nanoparticles의 생체 활성 (신경 돌기 성장 연구)

1. 10 % 열 불 활성화 말 혈청, 5 % 태아 소 혈청, 100 ㎍ / mL 스트렙토 마이신 및 100 유닛 / mL 페니실린을 보충 한 RPMI-1640 배지에서 PC12 세포를 배양 하였다. 가습 된 배양기에서 37 ° C 및 5 % CO2로 세포를 유지합니다.
2. 세포가 ~ 70-80 % 합류에 도달하면, 문화 매체를 제거하고 1x PBS (10cm 당 약 2 ML <배양 표면적). 세척 용액을 제거하십시오. 0.25 % 트립신 - EDTA 솔루션 (0.25 % 트립신과 1mM EDTA, 10cm ² 문화 표면 면적 당 0.5 ML)을 추가하여 세포를 trypsinize하고 대부분의 세포가 분리 될 때까지 37 ° C에서 품어.
3. 문화 매체의 두 볼륨을 추가하고 5 분 180 XG에서 스핀 다운. 뜨는를 제거하고 문화 매체 5 ML에서 세포 펠렛을 resuspend. 세포 클러스터를 파괴하기 위해 22G, ½ 인치 바늘을 통해 세포를 필터링합니다.
4. 새로운 세포 배양 플라스크에 1 : 3의 비율로 세포를 분할합니다. 하룻밤 배양 후, 부착되지 않은 PC12 세포를 제거합니다. 첨부 된 세포가 더 성장할 수 있도록 허용합니다.
5. 강한 접착력을 가진 PC12의 하위 계도를 선택하기 위해 3 단계에 대해이 과정을 반복하십시오. 쥐 꼬리 콜라겐 타입 I (100 μg / ML)의 800 μL / 잘 6 잘 판을 사전 코트.
6. 4.2 절에서 설명한대로 선택된 PC12 세포를 트립신 처리하고22 G, ½ 인치 바늘로 세포 덩어리를 깰 수 있습니다. hemocytometer로 세포를 센다. 세포가 접시에 첨부 할 수 있도록 4.5 단계에서 미리 코팅 6 잘 접시에 10,000 세포 / 잘 밀도에 세포를 밤새 시드.
7. 0.5, 1, 5, 10, 50 및 100 ng / ML 농도를 준비하기 위해 무료로 NGF (10 μg / ML)와 NGF HDL - 모방 NP (10 μg / ML) 문화 매체 (단계 4.1에 설명 된)로 희석. 각 우물에서 배지 2 mL를 제거하고 희석 된 NGF 또는 NGF HDL 모방 NP 2 mL로 교체하십시오. 문화 4 일.
8. 4 일에, 해당 치료를 포함하는 새로운 매체 (단계 4.1에서 설명한)로 매체를 변경하고 또 다른 3 일 동안 치료를 계속합니다.
9. 7 일째, 거꾸로 된 광학 현미경으로 세포를 시각화하고 배율 10 배 미만의 무작위로 각 우물을 상상하십시오.

5. NGF HDL을 흉내 낸 나노 입자의 생체 분포

1. 성인 BALB / c 마우스 (남성, 25 ~ 30 g)를 사용하여NGF NPs의 조직 분포를 추정한다. 마우스를 그룹당 3 마리씩 3 그룹으로 무작위로 나눕니다. 원뿔 모양의 플라스틱 구속 ( 예 : decapicone)을 사용하여 마우스를 제지하고 에탄올로 꼬리를 닦아서 혈관 확장 및 혈관의 시정을 촉진하십시오.
2. NGF 40 ug / kg의 용량으로 꼬리 정맥을 통해 마우스 (3 그룹)의 각 그룹에 식염수, 유리 NGF, 또는 NGF HDL - 모방 NP 중 100 μL를 주입하십시오. 1 mL 주사기에 부착 된 30½ G 바늘을 사용하십시오.
3. 주사 후 30 분에 3 % 흡입 된 isoflurane (산소 2L / 분의 산소)을 사용하여 마우스를 마취시킨다. 마취의 깊이를 결정하기 위해 꼬리와 꼬집음을 수행하십시오. 심장 펑크로 혈액을 채취하십시오.
   1. 약 1 mL의 혈액을 심장에서 빼냅니다. 자궁 경관 탈구로 각 마우스를 안락사하십시오.
4. 등 지골에 마우스 시체를 놓습니다. 외과 용 가위로 복부를 열고 지방과 장을 옆으로 움직이십시오.간, 비장 및 신장을 노출시키기 위해 면봉을 사용합니다. 이 조직을 수확하고 1x PBS로 헹구어 혈액을 닦아냅니다.
5. 즉시 3,400 xg 및 4 ° C에서 5 분간 혈액 샘플을 원심 분리하여 혈장을 얻습니다. 분석 할 때까지 -80 ° C에서 혈장과 조직을 보관하십시오.
6. 조직 샘플을 분석하려면 샘플을 -80 ° C에서 4 ° C로 옮기고 10x 부피의 추출 완충액 (0.05 M sodium acetate, 1.0 M sodium chloride, 1 % triton X-100, 1 % BSA, 0.2 mM 페닐 메탄 설 포닐 플루오 라이드 및 0.2 mM 벤젠에 토늄 클로라이드). 10,000 RPM 및 4 ° C에서 5 분 동안 균질화하십시오.
7. 단계 5.3과 5.4에서 설명한대로 두 개의 치료받지 않은 생쥐를 희생하여 빈 혈장과 조직을 수집합니다. blank plasma 또는 blank tissue homogenates를 사용하여 NGF 표준 용액을 준비하십시오.
8. 위에서 설명한대로 Sandwich ELISA 키트를 사용하여 혈장 및 조직 균질 액에서 NGF의 농도를 결정합니다.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

결과

이온 쌍 전략에 의해 준비된 HDL 모방, α- 토코페롤 코팅 NGF NP의 엔지니어링 계획이 그림 1 에 나와 있습니다. NGF의 표면 전하를 중화시키기 위해, 프로타민 USP를 이온 쌍 제제로 사용하여 NGF와 복합체를 형성시켰다. 생체 활성을 보호하기 위해 프로토 타입 HDL 모방 NP를 먼저 균질화를 사용하여 조작했습니다. 그 다음, NGF / 프로타민 복합체가 원형 ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

토론

이 연구에서는 NGF 캡슐화를 위해 HDL 모방 NP를 준비하는 간단한 방법을 시연합니다. 다양한 NP 전달 시스템이 단백질을 전달하기 위해 연구되었습니다. 현재 많은 NP 준비 과정에는 투석, 용매 침전 및 필름 수화가 포함됩니다. 이러한 프로세스는 일반적으로 규모가 커질 경우 복잡하고 까다로운 작업입니다. 이 NP 발달 동안, 지질은 용기의 유리 벽에 강한 접착력을 가지므로 박막을 수화하고 부형?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Recombinant Human Beta-NGF	Creative Biomart	NGF-05H
L-α-Phosphatidylcholine (PC)	Avanti	131601P	95%, Egg, Chicken
Sphingomyelin (SM)	Avanti	860062P	Brain, Porcine
Phosphatidylserine (PS)	Avanti	840032P	Brain, Porcine
Cholesteryl oleate (CO)	Sigma	C9253
D-α-Tocopheryl polyethylene glycol succinate (TPGS)	BASF	9002-96-4	Vitamin E Polyethylene Glycol Succinate
Protamine sulfate	Sigma	P3369	meets USP testing specifications
Apolipoprotein A1, Human plasma	Athens Research & Technology	16-16-120101	1 mg in 671 µL 10 mM NH4HCO3, pH 7.4
Sepharose 4B-CL	Sigma	CL4B200	Cross-linked agarose,  gel filtration chromatography column filling material
Sandwich ELISA Kit for NGF	R&D system	DY008
Bovine Serum Albumin	Sigma	A2153
RPMI-1640 medium	GE Healthcare Life Science	SH30096.02
Horse serum	GE Healthcare Life Science	SH30074.03
Fetal bovine serum	Gibco	10082147
PC12 cells	ATCC	CRL-1721
Rat tail collagen type I	Sigma	C3867
Sodium acetate	Sigma	S2889
Sodium chloride	Sigma	31414
Triton X-100	Sigma	T8787
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)	Sigma	P7626
Benzethonium chloride	Sigma	B8879
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Homogenizer	Tekmar	T 25-S1
Delsa Nano HC particle analyzer	Beckman-Coulter	Delsa Nano HC
Float-A-Lyzer G2 Dialysis Device	Spectrum Laboratories	G235036	Molecule Cutoff 300 kDa
Centrifuge	Eppendoff	5424R
Polytron homogenizer	Kinematica	PT 1200C
DecapiCone	Braintree Scientific Inc.	DC-M200