Preparación y caracterización de nuevas nanopartículas que imitan las HDL para la encapsulación del factor de crecimiento nervioso

Resumen

Se utilizó una homogeneización simple para preparar nanopartículas nuevas, de alta densidad, que imitan las lipoproteínas para encapsular el factor de crecimiento nervioso. En este artículo se describen los desafíos, los protocolos detallados para la preparación de nanopartículas, la caracterización in vitro y los estudios in vivo .

Resumen

El objetivo de este artículo es introducir métodos de preparación y caracterización de nanopartículas (NPs) de alta densidad, lipoproteína (HDL) cargadas con factor de crecimiento nervioso (NGF). Los HDLs son NPs endógenos y han sido explorados como vehículos para el suministro de agentes terapéuticos. Se han desarrollado varios métodos para preparar NPs que imitan a HDL. Sin embargo, generalmente son complicados, requieren mucho tiempo y son difíciles para la ampliación industrial. En este estudio, se utilizó una homogeneización en un solo paso para mezclar los excipientes y formar el prototipo de NP. El NGF es una proteína soluble en agua de 26 kDa. Para facilitar la encapsulación de NGF en el medio lipídico de NPs que imitan a HDL, se usó protamina USP para formar un complejo de pares de iones con NGF para neutralizar las cargas sobre la superficie de NGF. El complejo NGF / protamina se introdujo entonces en el prototipo de NP. La apolipoproteína AI fue finalmente recubierta sobre la superficie de los NPs. NGF HDL imitación NPs mostraron propiedades preferibles en términosS de tamaño de partícula, distribución de tamaño, eficacia de atrapamiento, liberación in vitro , bioactividad y biodistribución. Con el cuidadoso diseño y exploración de la homogeneización en las NPs que imitan a HDL, el procedimiento se simplificó en gran medida y los NP se hicieron escalables. Además, se superaron varios desafíos, como la separación del NGF sin carga de los NPs, la realización de estudios fiables de liberación in vitro y la medición de la bioactividad de los NPs.

Introducción

Las macromoléculas, como las proteínas, los péptidos y los ácidos nucleicos, han aparecido como medicamentos prometedores y han adquirido considerable atención en las últimas décadas ^{1 , 2} . Debido a su alta eficacia y los modos de acción específicos, que muestran un gran potencial terapéutico para los tratamientos de cáncer, la enfermedad inmune, el VIH, y las condiciones relacionadas [ ^{3 , 4]} . Sin embargo, las propiedades fisicoquímicas, tales como su gran tamaño molecular, estructura tridimensional, cargas superficiales y naturaleza hidrófila, hacen que la administración in vivo de estas macromoléculas sea muy difícil. Esto dificulta considerablemente su uso clínico ⁴ . Avances recientes en sistemas de administración de fármacos, tales como micropartículas, nanopartículas de polímero (NPs), liposomas y NPs lipídicos, superaron estos desafíos y mejoraron significativamente la administración in vivo de macromoléculas. HoSe han revelado algunos inconvenientes con respecto a estas cargas de entrega, incluyendo baja capacidad de carga de fármacos, baja eficacia de atrapamiento, vida media corta, pérdida de bioactividad y efectos secundarios indeseables ^{5 , 6 , 7 , 8} . Los sistemas portadores eficaces siguen siendo un área de interés para la investigación. Además, el desarrollo de métodos analíticos para caracterizar las NPs cargadas de fármacos es más difícil para las macromoléculas que para las moléculas pequeñas.

La lipoproteína de alta densidad (HDL) es un NP natural compuesto de un núcleo lipídico que está recubierto por apolipoproteínas y una monocapa de fosfolípidos. HDL endógena juega un papel crítico en el transporte de lípidos, proteínas y ácidos nucleicos a través de su interacción con receptores objetivo, como SR-BI, ABCAI y ABCG1. Se ha explorado como vehículo para la administración de diferentes agentes terapéuticos ⁹, ^{10 , 11 , 12} . Se han desarrollado varios métodos para preparar NPs que imitan a HDL. La diálisis es un enfoque popular. En este método, los NPs se forman hidratando una película lipídica usando solución de colato sódico. La sal se elimina a través de una diálisis de 2 días con tres tampones ¹³ . Los métodos de sonicación fabrican NPs sonicando una mezcla de lípidos durante 60 minutos bajo una condición de calentamiento; Los NPs se purifican adicionalmente mediante cromatografía en gel ¹⁴ . Microfluídica genera NPs a través de un dispositivo microfluídico, que mezcla fosfolípidos y apolipoproteína AI (Apo AI) soluciones mediante la creación de microvórtices en un patrón de enfoque [ ^15] . Evidentemente, estos métodos pueden llevar mucho tiempo, ser ásperos y difíciles para la ampliación industrial.

En este artículo, introducimos la preparación y caracterización de NPs de imitación de HDL nuevos para el nervioEncapsulación del factor de crecimiento (NGF). El NGF es un homodímero de polipéptido unido por disulfuro que contiene dos monómeros de polipéptido de 13,6 kDa. Se desarrolló un nuevo procedimiento para preparar los NPs mediante homogeneización, seguido por la encapsulación de NGF en los NPs. Los NGF HDL imitación NPs se caracterizaron por tamaño de partícula, distribución de tamaño, potencial zeta, y la liberación in vitro . Su bioactividad se evaluó para el crecimiento de neuritas en células PC12. La biodistribución de NGF HDL imitando NPs se comparó con la de NGF libre después de la inyección intravenosa en ratones.

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Protocolo

NOTA: Los estudios en animales incluidos en todos los procedimientos han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales en el Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad del Norte de Texas.

1. Preparación de nanopartículas NGF HDL-imitando

1. Disolver los excipientes, fosfatidilcolina (PC), esfingomielina (SM), fosfatidilserina (PS), oleato de colesterilo (CO) y succinato de D-α-tocoferil polietilenglicol (TPGS), en etanol para preparar soluciones madre a 1 mg / ml.
   NOTA: Las soluciones madre se alicuotaron y se almacenaron a -20ºC. El oleato de colesterilo se almacenó en botellas oscuras. Las soluciones madre de PC, SM, PS y CO eran estables hasta 6, 3, 12 y 12 meses, respectivamente, a -20ºC. La solución de TPGS fue estable durante al menos 12 meses a -20ºC.
2. Mezclar 10 μl de NGF (1 mg / ml en agua) con 10 μl de protamina USP (1 mg / ml en agua) en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y dejar reposar durante 10 min a temperatura ambiente hastaForman el complejo.
   NOTA: Las soluciones madre de NGF y protamina se dividieron en alícuotas y se almacenaron a -20ºC. No se recomienda una congelación y descongelación repetidas para el stock de NGF.
3. Añadir 59 μL de PC, 11 μL de SM, 4 μL de PS, 15 μL de CO y 45 μL de TPGS a un vial de vidrio. Mezclar y evaporar el etanol bajo una corriente de nitrógeno suave durante aproximadamente 5 min; Todos los excipientes deben formar una película delgada y aceitosa en el fondo del vial de vidrio.
4. Añadir 1 mL de agua ultrapura (tipo 1) al vial y homogeneizar a 9.500 rpm (8.600 xg) durante 5 min a temperatura ambiente para formar el prototipo de NPs.
5. Añadir el complejo preparado en el paso 1.2 al prototipo de NPs e incubar a 37 ° C durante 30 minutos con agitación utilizando una pequeña barra de agitación en el vial de vidrio.
   1. Enfriar los NPs por agitación a temperatura ambiente durante otros 30 min. Después de que se enfríe, añadir 106 μl de Apo AI (1,49 mg / ml) y agitar a temperatura ambiente durante la noche para formar la solución finalNGF HDL-imitación NPs.

2. Caracterización de nanopartículas que simulan HDL de NGF

1. Mida el tamaño de partícula y el potencial zeta usando un analizador de partículas (vea la Tabla de Materiales) según las instrucciones del fabricante.
2. Utilizar una columna de cromatografía de cromatografía de gel de agarosa reticulada para separar el NGF no cargado de las NPs que imitan el NGF HDL y determinar la eficacia de atrapamiento del NGF.
   1. Para la preparación de la columna, transfiera 15 ml de suspensión de Sepharose 4B-CL a un vaso de precipitados de 50 ml. Se agita la suspensión de perlas utilizando una varilla de vidrio y se vierte en una columna (30 cm de longitud x 1 cm de diámetro, con una frita de vidrio en la parte inferior). Golpee suavemente la columna para deshacerse de las burbujas. Dejar que el disolvente se drene y las cuentas se asienten durante unos pocos minutos.
   2. Continúe agregando la suspensión restante. Enjuague la pared interior de la columna para limpiar las perlas. Escurrir el disolvente hasta que el nivel de disolvente sea ligeramenteBove la parte superior de la fase estacionaria. Lavar y acondicionar la columna con 20 ml de solución salina tamponada con fosfato 1x (PBS, que contiene 137 mM de NaCl, 2,7 mM de KCl, 8 mM de Na2HPO4 y 2 mM de KH2PO4).
   3. Para determinar las fracciones que contienen NGF sin carga, cargar 200 μL de solución de NGF (10 μg / mL) en la columna de filtración en gel (25 cm de longitud x 1 cm de diámetro) y eluir con 1x PBS.
   4. Recoger un total de 12 fracciones (1 ml para cada fracción) y medir la concentración de NGF en cada fracción usando un kit de ELISA de Sandwich para NGF.
   5. Detectar el NGF de las fracciones 6 a 10 utilizando el kit Sandwich ELISA. Obtener un cromatograma de NGF sin carga en la columna. Lavar la columna con 20 ml de PBS.
   6. Para determinar las fracciones que contienen NPs que imitan a HDL de NGF, cargar 200 μL de los NP en la columna y eluir con 1x PBS. Recoger un total de 12 fracciones (1 mL para cada fracción) y medir la intensidad de las partículas en cada fracción uEl analizador de tamaño de partícula. Detectar los NP de NGF de las fracciones 2 a 4.
      NOTA: La intensidad es un parámetro medido por el analizador de partículas, que indica cuántas nanopartículas pueden existir en la solución de prueba. Cuanto más NPs existen en solución, mayor es la intensidad. Mediante este enfoque, podemos confirmar que la columna puede separar NGF NPs de NGF descargado.
   7. Para medir la eficacia de atrapamiento de NGF, cargar 200 μL de NPs que imitan a NGF HDL en la columna y eluir con 1x PBS. Recoger un total de 12 fracciones (1 ml para cada fracción).
   8. Mida la concentración de NGF descargada de las fracciones 6 a 10 usando el kit de ELISA de Sandwich.
   9. Añadir las cantidades de NGF medidas a partir de las fracciones 6 a 10 juntas como NGF sin carga y calcular la eficacia de atrapamiento de NGF usando la siguiente ecuación.
      % EE = (1 - NGF descargado / NGF total añadido a NP) x 100% Ecuación (1)

3. Liberación in vitro de NGF HDL-mimiendo las nanopartículas

1. NGF libre de estudio (10 μg / mL en agua, n = 4) y NGF HDL-imitando NPs (10 μg / mL, n = 4) en paralelo.
2. Pretratar 8 tubos de diálisis (peso molecular de corte: 300 kDa) siguiendo las instrucciones del fabricante.
3. Preparar 5% de albúmina de suero bovino (BSA) en PBS como medio de liberación. Añadir 30 ml de medio de liberación a un tubo de centrífuga de 50 ml y calentar hasta 37 ° C en un agitador con una velocidad de agitación de 135 rpm. Coloque otros 50 ml de medio de liberación en el agitador para su reemplazo.
4. Agregue 400 μl de medio de liberación al tubo de diálisis y añada rápidamente 200 μl de la muestra probada para obtener suficiente volumen para la diálisis.
5. Cierre el tubo y coloque rápidamente el tubo de diálisis en el medio de liberación (el tubo de centrífuga). Retire rápidamente 100 μl del medio de liberación del tubo de diálisis exterior como muestra durante el tiempo 0. Inmediatamente coloque la muestra en -20 ° C para un análisis posterior. Añadir 100 μl deEn el tubo de centrífuga para reemplazar la muestra retirada. Iniciar el temporizador.
6. A 1, 2, 4, 6, 8, 24, 48 y 72 h, retirar 100 μl del medio de liberación y sustituirlo por 100 μl de medio fresco. Colocar inmediatamente las muestras retiradas en -20 ° C para un análisis posterior.
7. Después de 72 h, extraer todas las muestras a -20 ° C y descongelarlas a temperatura ambiente. Mida las concentraciones de NGF de las muestras de liberación usando el kit de ELISA de Sandwich.

4. Bioactividad de nanopartículas que simulan HDL de NGF (estudio de crecimiento neuronal)

1. Cultivo de células PC12 en medio RPMI-1640 suplementado con suero de caballo inactivado por calor al 10%, suero bovino fetal al 5%, estreptomicina 100 μg / ml y penicilina de 100 unidades / ml. Mantener las células en una incubadora humidificada a 37 ° C y con 5% de CO ₂ .
2. Cuando las células alcanzan una confluencia de ~ 70-80%, se retira el medio de cultivo y se lavan las células con 1x PBS (aproximadamente 2 ml por 10 cm ^{2 superficie de cultivo). Retire la solución de lavado. Trypsinize las células mediante la adición de 0,25% de tripsina-EDTA solución (0,25% de tripsina y 1 mM EDTA, 0,5 mL por 10 cm 2 de superficie de cultivo) al matraz e incubar a 37 ° C hasta que la mayoría de las células se separan.}
3. Añadir dos volúmenes de medio de cultivo y centrifugar a 180 xg durante 5 min. Se retira el sobrenadante y se resuspende el sedimento celular en 5 ml de medio de cultivo. Filtrar las células a través de una 22 G, aguja de ½ pulgada para romper los grupos de células.
4. Se divide las células en una proporción de 1: 3 en un nuevo matraz de cultivo celular. Después de incubar durante la noche, eliminar las células PC12 no unidas. Deje que las células unidas permanezcan para un mayor crecimiento.
5. Repita este procedimiento para 3 pasos para seleccionar la subcultura de PC12 que tiene una fuerte propiedad de adhesión. Pre-recubrir una placa de 6 pocillos con 800 μl / pocillo de colágeno de cola de rata tipo I (100 μg / mL).
6. Trypsinize las células PC12 seleccionadas como se describe en el paso 4.2 y filtrar a través de un22 G, ½ pulgada de aguja para romper los grupos de células. Contar las células con un hemocitómetro. Sembrar las células durante la noche a una densidad de 10.000 células / pocillo en la placa de 6 pocillos previamente recubiertos en la etapa 4.5 para permitir que las células se unan a la placa.
7. Diluir NGF libre (10 μg / mL) y NGF HDL-imitando NPs (10 μg / mL) con el medio de cultivo (descrito en el paso 4.1) para preparar concentraciones de 0,5, 1, 5, 10, 50 y 100 ng / mL. Retire 2 ml de medio de cada pocillo y reemplazar con 2 ml de NGF libre o NGF HDL-imitando NPs. Cultura durante 4 días.
8. El día 4, cambiar el medio a medio fresco (descrito en el paso 4.1) que contiene el tratamiento correspondiente y continuar el tratamiento durante otros 3 días.
9. El día 7, visualizar las células con un microscopio de luz invertida y la imagen de cada pozo en lugares aleatorios bajo aumento de 10X.

5. Biodistribución de nanopartículas NGF HDL-imitando

1. Utilizar ratones adultos BALB / c (macho, 25-30 g) para tEs la distribución tisular de NPs NGF. Se dividen aleatoriamente los ratones en tres grupos de 3 ratones por grupo. Utilice una restricción de plástico en forma de cono ( por ejemplo, decapicona) para contener un ratón y limpie la cola con etanol para promover la vasodilatación y la visibilidad de la vena.
2. Inyectar 100 μL de NPs de solución salina, NGF libre o NGF HDL-imitación a cada grupo de ratones (3 grupos) a través de las venas de la cola a una dosis de 40 μg / kg de NGF. Use una aguja de 30½ G unida a una jeringa de 1 mL.
3. A los 30 minutos después de la inyección, anestesiar los ratones usando isoflurano inhalado al 3% (en oxígeno a un caudal de 2 l / min). Realizar una pinza de la cola y el dedo del pie para determinar la profundidad de la anestesia. Recoger sangre por punción cardiaca.
   1. Retirar aproximadamente 1 ml de sangre del corazón. Eutanasia cada ratón por dislocación cervical.
4. Coloque la carcasa del ratón en decúbito dorsal. Abrir el abdomen con tijeras quirúrgicas y mover la grasa y el intestino a un ladoUsando un hisopo de algodón para exponer el hígado, el bazo y el riñón. Cosechar estos tejidos y enjuagarlos en 1x PBS para limpiar la sangre.
5. Inmediatamente centrifugar las muestras de sangre a 3.400 xg y 4 ° C durante 5 min para obtener el plasma. Almacenar el plasma y los tejidos a -80 ° C hasta el análisis.
6. Para analizar las muestras de tejido, mover las muestras de -80 ° C a 4 ° C y suspender 100 mg de muestra de tejido en un volumen 10x de tampón de extracción (acetato de sodio 0,05 M, cloruro sódico 1,0 M, triton X-100 al 1% 1% de BSA, 0,2 mM de fluoruro de fenilmetanosulfonilo y 0,2 mM de cloruro de bencetonio). Homogeneizar a 10.000 rpm y 4 ° C durante 5 min.
7. Sacrificar dos ratones no tratados para recoger plasma en blanco y tejidos, como se describe en los pasos 5.3 y 5.4. Preparar soluciones estándar de NGF utilizando plasma en blanco o homogenados de tejido en blanco.
8. Determine las concentraciones de NGF en los homogeneizados de plasma y de tejido usando el kit de ELISA de Sandwich, como se ha descrito anteriormente.

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Resultados

El esquema de ingeniería de NGF NPs recubierto con alpha - tocoferol imitando el HDL preparado por una estrategia de pares de iones se muestra en la Figura 1 . Para neutralizar las cargas superficiales de NGF, se usó protamina USP como un agente de pares de iones para formar un complejo con NGF. Para proteger la bioactividad, se diseñaron prototipos NPs que simulaban HDL, primero usando homogeneización; Entonces, el complejo NGF / protamina se encapsuló en el proto...

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Discusión

En este estudio, se demuestra un método simple para preparar HDL-imitación NPs para NGF encapsulación. Se han estudiado varios sistemas de liberación de NP para suministrar proteínas. Actualmente, muchas preparaciones NP incluyen diálisis, precipitación con disolventes e hidratación de películas. Estos procesos son generalmente complicados y desafiantes a escala. Durante este desarrollo de NP, se determinó que los lıpidos tenıan fuerte adhesión a la pared de vidrio del recipiente, lo que condujo a las dific...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Recombinant Human Beta-NGF	Creative Biomart	NGF-05H
L-α-Phosphatidylcholine (PC)	Avanti	131601P	95%, Egg, Chicken
Sphingomyelin (SM)	Avanti	860062P	Brain, Porcine
Phosphatidylserine (PS)	Avanti	840032P	Brain, Porcine
Cholesteryl oleate (CO)	Sigma	C9253
D-α-Tocopheryl polyethylene glycol succinate (TPGS)	BASF	9002-96-4	Vitamin E Polyethylene Glycol Succinate
Protamine sulfate	Sigma	P3369	meets USP testing specifications
Apolipoprotein A1, Human plasma	Athens Research & Technology	16-16-120101	1 mg in 671 µL 10 mM NH4HCO3, pH 7.4
Sepharose 4B-CL	Sigma	CL4B200	Cross-linked agarose,  gel filtration chromatography column filling material
Sandwich ELISA Kit for NGF	R&D system	DY008
Bovine Serum Albumin	Sigma	A2153
RPMI-1640 medium	GE Healthcare Life Science	SH30096.02
Horse serum	GE Healthcare Life Science	SH30074.03
Fetal bovine serum	Gibco	10082147
PC12 cells	ATCC	CRL-1721
Rat tail collagen type I	Sigma	C3867
Sodium acetate	Sigma	S2889
Sodium chloride	Sigma	31414
Triton X-100	Sigma	T8787
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)	Sigma	P7626
Benzethonium chloride	Sigma	B8879
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Homogenizer	Tekmar	T 25-S1
Delsa Nano HC particle analyzer	Beckman-Coulter	Delsa Nano HC
Float-A-Lyzer G2 Dialysis Device	Spectrum Laboratories	G235036	Molecule Cutoff 300 kDa
Centrifuge	Eppendoff	5424R
Polytron homogenizer	Kinematica	PT 1200C
DecapiCone	Braintree Scientific Inc.	DC-M200