通过流式细胞术分析来自中枢神经系统的小胶质细胞和单核细胞衍生的巨噬细胞

摘要

该方案通过流式细胞术提供成年小鼠中枢神经系统中巨噬细胞亚群的分析，有助于研究由这些细胞表达的多种标志物。

摘要

许多研究已经证明了免疫细胞，特别是巨噬细胞在中枢神经系统（CNS）病理学中的作用。 CNS中有两个主要的巨噬细胞群体:（i）小神经胶质细胞，其是CNS的驻极体巨噬细胞，并且在胚胎发生过程中衍生自卵黄囊祖细胞，以及（ii）可以渗透的单核细胞衍生的巨噬细胞（MDM）疾病期间的CNS来源于骨髓祖细胞。每个巨噬细胞亚群的作用根据正在研究的病理学而不同。此外，对于这些巨噬细胞亚群的组织学标记或区别标准尚未达成共识。然而，通过流式细胞术分析CD11b和CD45标记物的表达谱使我们能够区分小胶质细胞（CD11b ⁺ CD45 ^med ）与MDM（CD11b ⁺ CD45 ^高 ）。在本协议中，我们显示密度梯度离心并且流式细胞术分析可以用于表征这些CNS巨噬细胞亚群，并且如我们最近公布的那样研究由这些细胞表达的感兴趣的标记物。因此，这种技术可以进一步了解巨噬细胞在神经系统疾病小鼠模型中的作用，也可用于评估对这些细胞的药物作用。

引言

小胶质细胞是中枢神经系统（CNS）的实质性组织沉积巨噬细胞。它们扮演两个关键的功能角色:免疫防御和维持CNS动态平衡。与从骨髓中的造血干细胞不断更新的MDM相反，小胶质细胞与原始造血祖细胞分化，起源于卵母细胞（YS），其在胚胎发育^1,2,3期间定植于大脑。在啮齿动物中，转录因子Myb在所有骨髓来源的单核细胞和巨噬细胞的发育中起着至关重要的作用，但是对于YS衍生的小胶质细胞来说，这个因子是有限的，分化依赖于转录因子PU.1。

在健康的CNS中，小神经胶质细胞是动态细胞，不断地对其环境进行采样，入侵和测量入侵病原体或组织损伤⁵ 。这种信号的检测启动了解决伤害的途径。小胶质细胞从分枝形态迅速转变为变形虫，随后是各种介质的吞噬和释放，例如促炎或抗炎细胞因子。因此，取决于它们的微环境，活化的小胶质细胞可获得不同引发状态的谱。

小胶质细胞对许多神经系统疾病的发展和进展产生深刻的影响。在阿尔茨海默病（AD） ⁷ ，肌萎缩性侧索硬化症（ALS） ⁸ ，多发性硬化症（MS） ⁹或帕金森病（PD） ¹⁰ ）的啮齿动物模型中，小胶质细胞被证明具有双重作用，诱导有害的神经毒性或作用以神经保护的方式，这是依赖于o特定疾病，疾病阶段，以及该疾病是否受到全身免疫隔室7,8,9,10,11的影响。在上述疾病中观察到的大多数CNS损伤包含异质骨髓细胞群体，不仅包括实质性小胶质细胞，还包括血管周围和脑膜巨噬细胞以及CNS浸润MDM。这些细胞类型可能差异有助于与损伤和修复相关的病理生理机制7,12,13,14,15。正在研究这些疾病模型的调查人员目前面临的挑战是确定外周单核细胞和巨噬细胞是否渗透到CNS，如果是这样，到dist从这些细胞诱导居民小神经胶质细胞。事实上，小胶质细胞是非常塑料的;当它们被激活时，小胶质细胞重新表达通常由外周单核细胞和巨噬细胞表达的标志物。因此，这个问题依赖于识别可以区分宿主小胶质细胞与浸润性单核细胞和巨噬细胞的标记。

由于缺乏特异性抗体，通过免疫组织学应用对这些人群对脑切片的鉴别是有限的。然而，流式细胞术分析是评估几种标记物的表达并区分细胞群体（例如，淋巴细胞，巨噬细胞/ MDM CD11b ⁺ CD45 ^高和小胶质细胞CD11b ⁺ CD45 ^med ）以及细胞亚群^{16的有效技术 ， 17，18} 。该协议描述了隔离的过程通过使用优化的酶组织解离和密度梯度离心，在神经疾病模型中从小鼠CNS获得单核细胞;以及通过使用流式细胞术分离CNS中的小胶质细胞和MDM群体的方法。

另一种方法是通过使用与特异性抗体缀合的磁珠^19,20,21来消除髓磷脂并纯化细胞。使用抗髓磷脂磁珠的髓磷脂去除更昂贵并影响分离细胞的生存力和产量²² 。该步骤和以下免疫磁性分离的小胶质细胞，限制进一步研究特异性免疫细胞群体^21,22 。

这些程序提供了一个简单的方法来研究巨噬细胞亚群在疾病发展中确定对巨噬细胞表型和激活状态的药物作用或基因修饰。

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研究方案

本文所述的所有方法均已获得ICM研究所机构动物护理和使用委员会以及达尔文法国道德动物委员会的批准，并且符合协议01407.02。

准备

1. 通过对每只小鼠组合以下物质，在1.5 mL管中制备消化鸡尾酒:1 mL磷酸盐缓冲盐水（PBS）;将123μL消化酶（参见表格）以13wunsch / mL（储备溶液），终浓度1.6wunsch / mL;和5μLDNase I（见材料表），以100mg / mL（储备溶液），最终浓度为0.5mg / mL。

灌注和解剖

1. 用致死剂量的戊巴比妥（100μL，400mg / mL）安乐死小鼠。
2. 将动物置于仰卧位，用70％乙醇湿身体。
3. 用正确的剪刀剪下腹部皮肤，露出胸腔年。
4. 在隔膜中切开切口，用精细剪刀切割肋骨的侧面，以尾端朝向方向，以暴露心脏（并避免切割其他器官）。识别左心室（LV）和右心房（RA）。
5. 在LV内插入一个25 G针的蝴蝶导管。用精细剪刀在RA上切开，血液开始时，以20 mL PBS的流速以10mL / min的速度开始灌注，以从血管中除去细胞和血液;成功的灌注是随着血液流离失所而肺和肝脏的烫伤所引起的。
6. 用中等剪刀剪掉动物。用精细剪刀解剖脊柱，并通过切除脊柱腹侧的腹壁肌肉组织并通过切割尾部基部的脊柱将其与体部分离开。
7. 将含有PBS的10mL注射器和安装的200μL移液管吸头插入腰部脊柱冲洗颈部脊髓。
   注意:200μL移液管尖端在最宽端（约1 cm）用剪刀切割，并紧紧插入预先填充PBS的10mL注射器上。
8. 去除头骨上方的皮肤，并使用镊子暴露大脑。在颅骨底部插入剪刀，并在矢状缝合后切开颅骨。将小镊子插入切口，轻轻抬起头骨。解剖大脑从鼠标头，并去除嗅球和小脑。
9. 在含有1.128mL PBS的含有消化混合物的1.5mL管中收集脑和脊髓（来自步骤1.1）。

细胞分离

1. 用小剪刀将1.5 mL管（步骤2.9）中的脑和脊髓细分为1-2 mm ³ （ 图1 ）。
2. 在孵育中孵育含有切碎的组织的1.5mL管30分钟在37℃下用5％CO ₂ 。
   注意:在此步骤准备密度梯度。
3. 向1.5 mL管中加入20μL0.5 M EDTA（储备溶液），终浓度为10 mM，以停止酶反应。
4. 通过用5 mL移液管上下移动轻轻地制备细胞悬液。
5. 使用10mL注射器的柱塞，将细胞悬液通过50mL管中的尼龙网（70μm孔径）。
6. 用20 mL 5％胎牛血清（FBS）-PBS清洗尼龙网。
7. 在室温（18℃）下离心7分钟（300×g）。通过抽吸弃去上清液，并进行下一步骤。去除上清液要格外小心;不要打扰沉淀，这可以很容易地被抽吸吸管吸出。

密度梯度

1. 通过向密度梯度介质中加入适量的10x PBS来制备密度梯度介质的储备溶液。
   注意:将一份10X PBS加入到9份密度梯度培养基中。
2. 如表1所述，用1x PBS稀释存储密度梯度培养基的不同百分比。
3. 用4mL 30％密度的梯度培养基重新悬浮沉淀（来自步骤3.7）并转移到15mL管中。
4. 将巴斯德吸管置于15 mL管的底部，并缓慢地铺上4 mL 37％密度梯度培养基。
5. 加入4mL 70％密度梯度培养基，如上所述。
6. 在室温（18℃）下将梯度离心40分钟（800xg）。确保离心机以最小或无制动器停止，以使相间不受干扰。
   注意:管将显示分层。分层在70％ - 37％密度梯度界面的细胞是单核细胞免疫细胞（小胶质细胞和巨噬细胞亚群）;上层分别是细胞碎片和髓鞘（ 图2 ）。
7. 使用转移移液管，轻轻取出髓鞘层。
8. 将含有巨噬细胞亚群细胞的3-4mL 70-37％密度梯度相间收集到干净的15mL管中。
9. 用PBS洗涤细胞3次，总体积为15mL。确保将含有细胞的密度梯度培养基用PBS稀释至少三次，并用制动器"开"离心7分钟（500×g，4℃）。
10. 用1 mL PBS重悬细胞沉淀，用于细胞标记或其他功能测定。

流式细胞术的细胞标记

1. 将细胞转移到流式细胞仪中（步骤4.10）。
2. 向步骤4.10中获得的每个细胞样品中加入1μL可固定死细胞染色剂。在冰上孵育30分钟，防光。
3. 用2mL PBS洗涤细胞一次并离心5分钟（300×g，4℃）。
4. 取出上清液，重悬细胞沉淀400μLPBS 1％BSA，0.1％叠氮化物。
5. 向100μL的细胞中加入1μgCD16 / CD32抗体以阻断Fc受体。在冰上孵育10-15分钟，防光。
6. 在PBS 1％BSA，0.1％叠氮化物或PBS 1％BSA，0.1％叠氮化物，0.25％皂苷的PBS中准备一级抗体混合物，用于细胞渗透用于细胞内染色。
7. 加入100μL的一级抗体混合物（2x），并在冰上孵育30分钟，避光保存。
   注意:在进行实验前应对所有抗体进行滴定以确保最佳结果。
8. 用2mL PBS洗涤细胞并离心5分钟（300×g，4℃）。重复此步骤三次。
9. 如果第一抗体不直接与荧光团缀合，则添加100μL的二抗，并在冰上孵育30分钟，防止光照。
10. 用2mL PBS洗涤细胞，并在4℃以300xg离心5分钟）。重复此步骤三次。
11. 修复细胞用100μL1％PFA在室温下15分钟，防止光照。
    注意:注意:PFA有毒。在通风橱中使用并佩戴个人防护装备。
12. 用2mL PBS洗涤细胞，并在4℃以300xg离心5分钟。重复此步骤三次。
13. 用200μLPBS重悬细胞沉淀，并进行流式细胞仪的获取和分析。按照图3中的门控策略。

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结果

密度梯度离心和抗体染色后，在流式细胞仪上获得细胞，并使用形态选择策略进行如下分析。点阵图前向散射面积（FSC-A） 与前向散射高度（FSC-H）之间定义了第一个门，以区分单个细胞与双峰（ 图3A ）。然后根据相对细胞大小和细胞粒度，将单细胞门控在FSC-A 与 Side-Scattered-Area（SSC-A）点图上以排除细胞碎片和固缩细胞（

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讨论

已经证明，小胶质细胞和MDM在CNS中具有不同的功能和表型，因此这些巨噬细胞亚群的鉴定和分析对于更好地了解神经疾病9,18,25是必不可少的。使用两个标记（CD11b和CD45）的流式细胞术分析可以区分每个亚群（ 图3C ）。以前通过使用其他特异性标记（例如MDM的CCR2和小胶质细胞的CX3CR1）以及最近开发的具有Tmem119抗体（ 图3E - 3G ?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 month-old Mice	Janvier	C57BL/6J
Liberase TL Research Grade	Sigma-Aldrich	5401020001	Digestion enzyme
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	DN25
Percoll	GE Healthcare Life Sciences	17-0891-01	Density gradient medium
Cell Strainer size 70 µm Nylon	Corning	731751
Venofix 25 G	BRAUN	4056370
Piston syringe 10 mL	Terumo	SS+10ES1
Pasteur pipette 230 mm	Dustcher	20420
1.5 mL tube	Eppendorf	0030 123.328
15 mL tube	TPP	91015
50 mL tube	TPP	91050
5 mL polystyrene round bottom tube	BD Falcon	352054
D-PBS (1x) without Ca2+/Mg2+	Thermo Fisher Scientific	14190-094
D-PBS (10x) without Ca2+/Mg2+	Thermo Fisher Scientific	14200-067
Fetal bovine serum	Thermo Fisher Scientific	10270-106
EDTA	Sigma-Aldrich	E4884
Bovine Serum Albumin solution 30%	Sigma-Aldrich	A7284
Paraformaldehyde 32% Solution	Electron Microscopy Sciences	15714-S	Caution -Toxic
Saponin	Sigma-Aldrich	S2002
Sodium Azide	Sigma-Aldrich	47036
PerCPCy5.5 Rat anti-mouse CD11b (clone M1/70)	eBioscience	45-0112
Rat IgG2b K Isotype Control PerCP-Cyanine5.5	eBioscience	45-4031
BV421 Rat anti-mouse CD45 (clone 30-F11)	BD Biosciences	563890
BV421 Rat IgG2b, κ Isotype Control RUO	BD Biosciences	562603
Rabbit anti-mouse TMEM119 (clone28 - 3)	Abcam	ab209064
AlexaFluor 647 Donkey anti-rabbit IgG	Life Technologies	A31573
Anti-Mouse CD16/CD32 Purified	eBioscience	14-0161	Mouse Fc Block
Fixable Dead Cell Stain Kits	Invitrogen	L34969
Mouse CCR2 APC-conjugated Antibody	R&D	FAB5538A
Rat IgG2B APC-conjugated Isotype Control	R&D	IC013A
Mouse CX3CR1 PE-conjugated Antibody	R&D	FAB5825P
Goat IgG PE-conjugated Antibody	R&D	IC108P
Centrifuge	Eppendorf	5804R
Cell analyzer	BD Biosciences	BD FACSVERSE
Data Analysis Software	FlowJo LLC	FlowJo
Fine scissors	F.S.T	14090-11
Standard Pattern Forceps	F.S.T	11000-13
Mayo Scissors	F.S.T	14010-15
Dumont #5 Forceps	F.S.T	11251-20