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요약

이 프로토콜은 유행 세포 계측법에 의한 성체 마우스 중추 신경계에서 대 식세포 모집단의 분석을 제공하며, 이들 세포에 의해 표현되는 다중 마커의 연구에 도움이됩니다.

초록

수많은 연구가 중추 신경계 (CNS) 병리학에서 면역 세포, 특히 대 식세포의 역할을 입증했다. 중추 신경계에 두 가지 주요 대 식세포 개체군이있다 : (i) 중추 신경계의 상주 대 식세포이며 배아 발생 과정에서 난황낭 전구 세포에서 유래 된 미세 아교 세포 및 (ii) 단핵구에서 유래 된 대 식세포 (MDM) 질병 중 중추 신경계는 골수 선조 세포에서 유래한다. 각 macrophage subpopulation의 역할은 연구중인 병리학에 따라 다릅니다. 또한, 이러한 macrophage subpopulation에 사용되는 histological 마커 또는 구분 기준에 대한 합의가 없습니다. 그러나, 유동 세포 계측법에 의한 CD11b 및 CD45 마커의 발현 프로파일의 분석은 우리가 MDM (CD11b + CD45 high )으로부터 미 글 리아 (CD11b + CD45 med )를 구별 할 수있게한다. 이 프로토콜에서는 밀도 구배 원심 분리유동 세포 계측법 분석은이 CNS 대식 세포 하위 집단을 특성화하고 최근에 출판 한 것처럼 이들 세포가 나타내는 여러 마커를 연구하는데 사용될 수 있습니다. 따라서,이 기술은 신경 질환의 마우스 모델에서 대 식세포의 역할에 대한 우리의 이해를 더할 수 있으며, 또한 이들 세포에 대한 약물 효과를 평가하는데 사용될 수있다.

서문

미세 아교 세포는 중추 신경계 (CNS)의 실질 조직 내성 대 식세포입니다. 그들은 두 가지 중요한 기능적 역할을합니다 : 면역 방어와 CNS 항상성 유지. 골수에서 조혈 줄기 세포로부터 계속적으로 재생되는 MDM과 달리, 소구 세포는 배아 발달 중 뇌를 식민지로 만든 난황낭 (YS)에서 기원하는 조혈 전구 세포와 구별된다. 설치류에서 전사 인자 Myb는 모든 골수 유래 단핵 세포와 대 식세포의 발달에 중요한 역할을하지만, YS 유도 된 미세 아교 세포에 대해서는이 인자가 필요없고 분화는 전사 인자 PU.14에 의존한다.

건강한 CNS에서, 미세 아교 세포는 끊임없이 그들의 환경을 채취하는 역동적 인 세포입니다. sca침입하는 병원체 또는 조직 손상에 대한 육안 검사 및 측량 5 . 이러한 신호의 검출은 상해를 해결하기위한 경로를 시작합니다. microglia 신속하게 ramified 형태에서 amoeboid 하나, 다음 phagocytosis 및 프로 또는 항 염증성 cytokines 등 다양한 중재자의 릴리스 스위치. 따라서, 그들의 microenvironment에 따라, 활성화 된 microglia는 스펙트럼의 별개 프라이밍 상태 6을 얻을 수 있습니다.

microglia는 근본적으로 많은 신경 장애의 발달과 진행에 영향을 미칩니다. 알츠하이머 병 (AD) 7 , 근 위축성 측삭 경화증 (ALS) 8 , 다발성 경화증 (MS) 9 또는 파킨슨 병 (PD) 10 의 설치류 모델에서, 소아 글 리아는 해로운 신경 독성 또는 행동을 유도하는 이중 역할을하는 것으로 나타났다 신경 보호적인 방식으로,n 특정 질병, 병기 및 질병이 전신 면역 부 7 , 8 , 9 , 10 , 11의 영향을 받았는지 여부. 상기 언급 된 질병에서 관찰 된 대부분의 중추 신경계 병변은 실질 세포 미세 소견뿐만 아니라 혈관 주위 및 수막 상피 세포뿐만 아니라 중추 신경계 침윤성 MDM을 포함하는 골수 세포의 이종 집단을 포함한다. 이러한 세포 유형은 손상 및 수리와 관련된 병리학 적 기전에 차별적으로 기여할 수있다 ( 7 , 12 , 13 , 14 , 15) . 이러한 질병 모델을 연구하는 연구자가 현재 직면 한 문제는 말초 단핵 세포와 대 식세포가 CNS에 침투하는지 여부를 확인하는 것이고, 그렇다면 dist이 세포에서 상주 microglia를 잉태하십시오. 실제로, 소교 세포는 매우 플라스틱입니다. 그들이 활성화되면, microglia는 일반적으로 말초 monocytes 및 macrophages에 의해 표현되는 마커를 다시 표현합니다. 따라서이 문제는 상주 소아 글로불린과 침윤 단핵구 및 대 식세포를 구분할 수있는 마커를 확인하는 데 달려있다.

면역 조직 학적 적용에 의한 뇌 조각에 대한 이들 집단의 차별은 특이 항체가 부족하기 때문에 제한적이다. 그러나, 유동 세포 계측법 분석은 여러 마커의 발현을 평가하고 세포 집단 (예 : 림프구, 대 식세포 / MDM CD11b + CD45 high 및 microglia CD11b + CD45 med )을 구별하는 효율적인 기술이며 세포 아군 16 , 17 , 18 . 이 프로토콜은최적화 된 효소 조직 해리 및 밀도 구배 원심 분리를 사용하여 신경계 질환 모델에서 마우스 CNS 유래의 단핵구; 뿐만 아니라, 유동 세포 계측법을 사용하여 중추 신경계에서 미 글로리아 및 MDM 모집단을 구별하는 방법을 제공한다.

또 다른 접근법은 특정 항체 19 , 20 , 21에 접합 된 ​​자기 구슬을 사용하여 미엘린을 제거하고 세포를 정제하는 것입니다. 안티 - myelin 자기 구슬을 사용하여 myelin 제거는 더 비싸며 분리 된 세포의 생존력과 수율에 영향을 미칩니다 22 . 이 단계와 microglia의 다음 immunomagnetic 분리는 특정 면역 세포 인구의 추가 연구를 제한 21 , 22 .

이 절차는 질병 발달에서 대 식세포 하위 집단을 연구하는 쉬운 방법을 제공하며,대 식세포 표현형 및 활성화 상태에 대한 약물 효과 또는 유전자 변형을 결정한다.

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프로토콜

여기에 설명 된 모든 방법은 ICM 연구소의 기관 동물 관리 및 사용위원회와 다윈 프랑스 동물 동물위원회의 승인을 받았으며 프로토콜 01407.02로 보호됩니다.

1. 준비

  1. 각 마우스에 다음을 결합하여 1.5 ML 튜브에서 소화 칵테일을 준비하십시오 : 1 ML 인산염 완충 식염수 (PBS); 13 wunsch / mL (원액), 최종 농도 1.6 wunsch / mL에서 123 μL 소화 효소 (물질 표 참조); 및 100 mg / mL (원액), 최종 농도 0.5 mg / mL에서 5 μL DNase I (물질 표 참조).

2. 관류 및 해부

  1. 치사량의 pentobarbital (400 μg / mL에서 100 μL)로 마우스를 안락사하십시오.
  2. 동물을 앙와위에 놓고 70 % 에탄올로 몸을 적시십시오.
  3. xyphoid 프로세스 바로 아래의 미세 가위로 복부 피부를 잘라 흉부 캐비닛을 노출시킵니다.와이.
  4. 횡격막을 절개하고 가슴을 노출시키기 위해 주둥이 방향에서 꼬리 방향으로 미세한 가위로 늑골의 측면을 잘라냅니다 (다른 장기 절단을 피하십시오). 좌심실 (LV)과 우심방 (RA)을 확인하십시오.
  5. LV 내부에 25G 바늘이 달린 나비 카테터를 삽입하십시오. 미세 가위로 RA를 절개하고 혈류가 시작될 때 혈관에서 세포와 혈액을 제거하기 위해 20 mL PBS로 LV를 통해 10 mL / 분 유속으로 관류를 시작하십시오. 성공적인 관류는 혈액이 옮겨지면서 폐와 간이 희석되어 나타납니다.
  6. 중간 가위로 동물의 목을 베십시오. 척추의 해부학적인 측면에서 복부 근육 조직을 절제하고 꼬리의 기저부에서 척추를 절단하여 척추를 정밀한 가위로 해부하여 체내에서 분리합니다.
  7. 요추 측면에 PBS와 마운트 200 μL 피펫 팁을 포함하는 10 ML 주사기를 삽입척수를 제거하고 척수를 자궁 경부에 플러시하십시오.
    참고 : 200 μL 피펫 팁은 가장 넓은 끝 (약 1 cm)에서 가위로 자르고 이전에 PBS로 채워진 10 mL 주사기에 단단히 삽입됩니다.
  8. 두개골 위의 피부를 제거하고 포셉을 사용하여 뇌를 노출시킵니다. 두개골 바닥에 가위 날을 넣고 화살 봉합 후 두개골을 자릅니다. 작은 포셉을 절단 부위에 넣고 부드럽게 두개골을 들어 올리십시오. 마우스 머리에서 두뇌를 해부하고 후각 구근과 소뇌를 제거합니다.
  9. 소화 칵테일 (단계 1.1에서) 1.128 ML PBS를 포함 1.5 ML 튜브에 뇌와 척수를 수집합니다.

3. 세포 해리

  1. 작은 가위 ( 그림 1 )로 1-2 밀리미터 3 조각으로 1.5 ML 튜브 (단계 2.9)에서 뇌와 척수를 미세하게 자르십시오.
  2. 인큐베이터에서 30 분 동안 다진 조직이 들어있는 1.5 ML 튜브를 품어5 % CO2로 37 ° C에서 건조시킨다.
    참고 :이 단계에서 밀도 그래디언트를 준비하십시오.
  3. 효소 반응을 중지 1.5 ML 튜브에 20 μL 0.5 M EDTA (재고 솔루션), 최종 농도 10 MM을 추가합니다.
  4. 부드럽게 5 ML 피펫으로 위아래로 pipetting하여 세포 현탁액을 확인하십시오.
  5. 10 ML 주사기의 플런저를 사용하여 50 ML 튜브에 나일론 메쉬 (70 μm의 기공 크기)를 통해 세포 현탁액을 전달하십시오.
  6. 20 ML 5 % 태아 소 혈청 (FBS) -PBS와 나일론 메쉬를 씻으십시오.
  7. 실온 (18 ° C)에서 7 분 (300 XG) 동안 원심 분리기. 흡인으로 상징액을 버리고 다음 단계로 진행하십시오. 뜨는 물을 제거 할 때 매우 조심하십시오. 흡인 피펫으로 쉽게 흡입 할 수있는 펠릿을 방해하지 마십시오.

4. 밀도 구배

  1. 밀도 그래디언트 매체에 10x PBS의 적절한 금액을 추가하여 밀도 기울기 매체의 재고 솔루션을 준비합니다.
    참고 : 한 부분의 10X PBS를 9 부분 밀도 그 레이디 언트 매체에 추가하십시오.
  2. 표 1에 설명 된대로 다른 비율에 대한 1x PBS로 주식 밀도 그래디언트 매체를 희석하십시오.
  3. 4 ML 30 % 밀도 그래디언트 매체와 펠렛 (3.7 단계에서)을 Resuspend하고 15 ML 튜브로 전송할 수 있습니다.
  4. 15 ML 튜브의 바닥에 파스퇴르 피펫을 놓고 천천히 37 % 밀도 그라디언트 매체의 4 ML.
  5. 위에서 설명한대로 70 % 밀도 그라디언트 매체 4 ML을 추가합니다.
  6. 실온 (18 ° C)에서 40 분 (800 XG) 동안 그라디언트를 원심 분리하십시오. 계기가 방해받지 않도록 원심 분리기가 최소 또는 전혀 브레이크가 걸리지 않도록하십시오.
    참고 : 튜브가 계층화되어 나타납니다. 70 % -37 % 밀도 구배 계면에서 적층 된 세포는 단일핵화 된 면역 세포 (소교 세포 및 대 식세포 하위 집단); 상위 수준은 세포 파편과 myelin입니다 ( 그림 2 ).
  7. 전송 피펫을 사용하여 myelin의 층을 부드럽게 제거하십시오.
  8. 깨끗한 15 ML 튜브에 macrophage subpopulations 세포를 포함하는 70-37 % 밀도 그라디언트 interphase 3-4 ML을 수집합니다.
  9. PBS 15ml의 총 볼륨으로 세포를 3x 씻으십시오. 세포가 들어있는 밀도 구배 매체가 PBS로 적어도 세 번 희석되었는지 확인하고 "on"브레이크로 7 분 (500 xg, 4 ° C) 동안 원심 분리하십시오.
  10. 세포 라벨 또는 다른 기능 assays 1 ML PBS로 세포 펠렛을 Resuspend.

5. 유동 세포 계측법을위한 세포 라벨링

  1. 플로우 cytometry 튜브에 세포 (단계 4.10)를 전송합니다.
  2. 단계 4.10에서 얻은 각 세포 샘플에 고칠 수있는 죽은 세포 얼룩 시약 1 μL를 추가합니다. 빛으로부터 보호 된 얼음에서 30 분 동안 품어 낸다.
  3. 5 분 (300 XG, 4 ° C) 2 ML PBS와 원심 분리기로 한 번 세포를 씻으십시오.
  4. 뜨는을 제거하고 세포 펠렛을400 μL PBS 1 % BSA, 0.1 % 아 지드.
  5. 1 μg CD16 / CD32 항체를 100 μL의 세포에 첨가하여 Fc 수용체를 차단하십시오. 얼음에서 10-15 분 동안 인큐베이션하여 빛으로부터 보호합니다.
  6. 세포 내 얼룩에 대한 세포 permeabilization에 대한 PBS 1 % BSA, 0.1 % azide 또는 PBS 1 % BSA, 0.1 % azide, 0.25 % 사포닌의 기본 항체 믹스를 준비합니다.
  7. 1 차 항체 100 μL를 넣고 (2 배) 얼음에서 30 분 동안 인큐베이션하여 빛으로부터 보호합니다.
    참고 : 최적의 결과를 얻으려면 실험을 수행하기 전에 모든 항체를 적정해야합니다.
  8. 5 분 (300 XG, 4 ° C) 2 ML PBS와 원심 분리기로 세포를 씻으십시오. 이 단계를 세 번 반복하십시오.
  9. 일차 항체가 fluorophore에 직접 접합되지 않은 경우 보조 항체 100 μL를 추가하고 빛으로부터 보호 된 얼음에서 30 분 동안 품어 둡니다.
  10. 4시 300 XG에서 5 분 2 ML PBS와 원심 분리기로 세포를 씻으십시오 ° C). 이 단계를 세 번 반복하십시오.
  11. 수정빛으로부터 보호 된 실온에서 15 분 동안 100 μL 1 % PFA가있는 세포.
    참고 :주의 : PFA는 유독합니다. 흄 후드에 넣고 개인 보호 장비를 착용하십시오.
  12. 4시 300 XG에서 5 분 PBS 2 ML 및 원심 분리기와 세포를 씻으십시오 ° C. 이 단계를 세 번 반복하십시오.
  13. 200 μL PBS로 세포 펠렛을 Resuspend 및 흐름 cytometry 수집 및 분석 진행합니다. 그림 3 의 게이팅 전략을 따른다.

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결과

밀도 구배 원심 분리 및 항체 염색 후, 세포를 유동 세포 계측기 (flow cytometer)상에서 획득하고 형태 학적 게이팅 전략을 사용하여하기와 같이 분석 하였다. 첫 번째 게이트는 이중 세포 ( 그림 3A )에서 단일 세포를 구별하기 위해 전방 산란 영역 (FSC-A) 대 전방 산란 - 높이 (FSC-H)로 정의되었다. 그런 다음 단일 세포를 FSC-A 대 Side Scattered-Area...

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토론

microglia와 MDM은 중추 신경계에서 서로 다른 기능과 표현형을 가지고 있으며 따라서 대 식세포 subpopulation의 확인과 분석은 신경계 질환 9 , 18 , 25 를 더 잘 이해하기 위해 필수적이라는 것이 입증되었습니다. 두 마커 (CD11b 및 CD45)를 사용하여 유동 세포 계측법 분석은 각 하위 집단 사이의 구별을 허용합니다 ( 그?...

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공개

저자는 아무 것도 공개하지 않는다.

감사의 말

이 작품은 Agence Nationale Pour la Recherche (ANR-12-MALZ-0003-02-P2X7RAD), 협회 France Alzheimer 및 Bpifrance의 교부금으로 지원되었습니다. 우리 연구소는 Inserm, CNRS, Université Pierre et Marie-Curie 및 "Investissements d' avenir"ANR-10-IAIHU-06 (IHU-A-ICM) 프로그램도 지원합니다. CELIS 세포 배양 핵심 시설의 도움에 감사드립니다.

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
5 month-old MiceJanvierC57BL/6J
Liberase TL Research GradeSigma-Aldrich5401020001Digestion enzyme
Deoxyribonuclease I from bovine pancreasSigma-AldrichDN25
PercollGE Healthcare Life Sciences17-0891-01Density gradient medium
Cell Strainer size 70 µm NylonCorning731751
Venofix 25 GBRAUN4056370
Piston syringe 10 mLTerumoSS+10ES1
Pasteur pipette 230 mmDustcher20420
1.5 mL tubeEppendorf0030 123.328
15 mL tubeTPP91015
50 mL tubeTPP91050
5 mL polystyrene round bottom tubeBD Falcon352054
D-PBS (1x) without Ca2+/Mg2+Thermo Fisher Scientific14190-094
D-PBS (10x) without Ca2+/Mg2+Thermo Fisher Scientific14200-067
Fetal bovine serumThermo Fisher Scientific10270-106
EDTASigma-AldrichE4884
Bovine Serum Albumin solution 30%Sigma-AldrichA7284
Paraformaldehyde 32% SolutionElectron Microscopy Sciences15714-SCaution -Toxic
SaponinSigma-AldrichS2002
Sodium AzideSigma-Aldrich47036
PerCPCy5.5 Rat anti-mouse CD11b (clone M1/70)eBioscience45-0112
Rat IgG2b K Isotype Control PerCP-Cyanine5.5eBioscience45-4031
BV421 Rat anti-mouse CD45 (clone 30-F11)BD Biosciences563890
BV421 Rat IgG2b, κ Isotype Control RUOBD Biosciences562603
Rabbit anti-mouse TMEM119 (clone28 - 3)Abcamab209064
AlexaFluor 647 Donkey anti-rabbit IgGLife TechnologiesA31573
Anti-Mouse CD16/CD32 PurifiedeBioscience14-0161Mouse Fc Block
Fixable Dead Cell Stain KitsInvitrogenL34969
Mouse CCR2 APC-conjugated AntibodyR&DFAB5538A
Rat IgG2B APC-conjugated Isotype ControlR&DIC013A
Mouse CX3CR1 PE-conjugated AntibodyR&DFAB5825P
Goat IgG PE-conjugated AntibodyR&DIC108P
CentrifugeEppendorf5804R
Cell analyzerBD BiosciencesBD FACSVERSE
Data Analysis SoftwareFlowJo LLCFlowJo
Fine scissorsF.S.T14090-11
Standard Pattern ForcepsF.S.T11000-13
Mayo ScissorsF.S.T14010-15
Dumont #5 ForcepsF.S.T11251-20

참고문헌

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