フローサイトメトリーによる中枢神経系からのミクログリアおよび単球由来マクロファージの解析

要約

このプロトコールは、成体マウス中枢神経系におけるマクロファージ亜集団のフローサイトメトリーによる分析を提供し、これらの細胞によって発現される複数のマーカーの研究に有用である。

要約

数多くの研究が、中枢神経系（CNS）病変における免疫細胞、特にマクロファージの役割を実証している。 CNSには、（i）CNSの常在マクロファージであり、胚形成中に卵黄嚢前駆体に由来するミクログリア、および（ii）浸潤し得る単球由来マクロファージ（MDM）の2つの主要なマクロファージ集団が、疾患中のCNSは骨髄前駆細胞に由来する。各マクロファージ亜集団の役割は、研究されている病理によって異なる。さらに、これらのマクロファージ亜集団に使用される組織学的マーカーまたは識別基準にコンセンサスはない。しかし、フローサイトメトリーによるCD11bおよびCD45マーカーの発現プロファイルの分析は、我々がミクログリア（CD11b ⁺ CD45 ^med ）をMDM（CD11b ⁺ CD45 ^high ）から区別することを可能にする。このプロトコルでは、密度勾配遠心分離フローサイトメトリー分析を用いて、これらのCNSマクロファージ亜集団を特徴づけ、最近発表されたこれらの細胞によって発現されるいくつかの興味深いマーカーを研究することができる。従って、この技術は、神経疾患のマウスモデルにおけるマクロファージの役割をさらに理解することができ、これらの細胞に対する薬物効果を評価するためにも使用することができる。

概要

ミクログリアは、中枢神経系（CNS）の実質組織に存在するマクロファージである。それらは2つの重要な機能的役割を果たします：免疫防御およびCNSホメオスタシスの維持。骨髄の造血幹細胞から絶えず更新されているMDMとは対照的に、ミクログリア細胞は、胚発生の間に脳に定着した卵黄嚢（YS）に由来する原始造血前駆細胞から分化する^1,2,3 。げっ歯類では、転写因子Mybは、骨髄由来の単球およびマクロファージのすべての発生に重要な役割を果たすが、YS由来のミクログリアについては、この因子は不可欠であり、分化は転写因子PU.14に依存する。

健康な中枢神経系において、ミクログリアは、絶えず彼らの環境をスクリーニングする動的細胞である侵入する病原体または組織の損傷のための巣作りおよび調査⁵ 。そのようなシグナルの検出は、傷害を解決するための経路を開始する。ミクログリアは、急速に形態を変化させてアメイボイドに転換し、続いて食作用および炎症性サイトカインなどの様々なメディエーターの貪食および放出が起こる。したがって、それらの微小環境に依存して、活性化ミクログリアは、異なるプライミング状態のスペクトルを獲得することができる⁶ 。

ミクログリアは、多くの神経障害の発症および進行に深く影響する。アルツハイマー病（AD） ⁷ 、筋萎縮性側索硬化症（ALS） ⁸ 、多発性硬化症（MS） ⁹またはパーキンソン病（PD） ¹⁰のげっ歯類モデルにおいて、ミクログリアは有害な神経毒性を誘発するか、神経保護的な様式で、これは依存性である特定の疾患、病期、およびその病気が全身性免疫コンパートメント7,8,9,10,11の影響を受けているかどうかを判定した。上記の疾患において観察されるCNS病変の大部分は、実質性小膠細胞だけでなく、血管周囲および髄膜マクロファージならびにCNS浸潤性MDMを含む骨髄系細胞の異種集団を含む。これらの細胞型は、傷害および修復に関連する病態生理学的機構に示差的に寄与する可能性がある7,12,13,14,15。これらの疾患モデルを研究している研究者の現在の課題は、末梢単球およびマクロファージがCNSに浸潤するかどうかを確かめることであり、そうであれば、distこれらの細胞から常在性小膠細胞を摘出する。実際、小膠細胞は非常に塑性である。それらが活性化されると、ミクログリアは、通常、末梢単球およびマクロファージによって発現されるマーカーを再発現する。従って、この問題は、常在ミクログリアを浸潤単球およびマクロファージから区別することができるマーカーを同定することに依存する。

免疫組織学的適用による脳切片上のこれらの集団の識別は、特異的抗体の欠如のために制限される。しかし、フローサイトメトリー分析は、いくつかのマーカーの発現を評価し、細胞集団（例えば、リンパ球、マクロファージ/ MDM CD11b ⁺ CD45 ^high 、およびミクログリアCD11b ⁺ CD45 ^med ）ならびに細胞亜集団^{16 、 17,18} 。このプロトコルは、最適化された酵素組織解離および密度勾配遠心分離を用いることによって神経疾患モデルにおいてマウスCNS由来の単核細胞を単離すること;ならびにフローサイトメトリーを用いてCNS中のミクログリアおよびMDM集団を識別するための方法を提供する。

別のアプローチは、特定の抗体19,20,21にコンジュゲートした磁気ビーズを使用することによってミエリンを除去し、細胞を精製することである。抗ミエリン磁気ビーズを使用するミエリン除去は、より高価であり、単離された細胞^22の生存率および収量に影響を及ぼす。この段階およびミクログリアの以下の免疫磁気分離は、特定の免疫細胞集団のさらなる研究を制限する^21,22 。

これらの手順は、疾患発症におけるマクロファージ亜集団を研究する簡単な方法を提供し、マクロファージの表現型および活性化状態における薬物効果または遺伝子修飾を決定する。

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プロトコル

ここに記載されている全ての方法は、ICM研究所の機関動物管理利用委員会とダーウィンフランス倫理委員会によって承認されており、プロトコル01407.02の適用を受けています。

1.準備

1. 各マウスのために以下のものを組み合わせることにより、1.5mLチューブで消化カクテルを調製する：1mLリン酸緩衝食塩水（PBS）; 13 wunsch / mL（ストック溶液）、最終濃度1.6 wunsch / mLで123μLの消化酵素（材料の表参照）。 100mg / mL（ストック溶液）、最終濃度0.5mg / mLで5μLのDNase I（材料の表参照）を添加する。

2.灌流および切開

1. 致死量のペントバルビタール（400mg / mLで100μL）でマウスを安楽死させる。
2. 動物を仰臥位に置き、70％エタノールで体を濡らします。
3. 胸骨の窩を露出させるために、腸骨棘のちょうど下の細かいはさみで腹部の皮膚を切るy。
4. 横隔膜に切開を入れ、心臓を露出させるために（そして他の器官を切断することを避けるために）尾側から吻側への細かいはさみで胸郭の側面を切断する。左心室（LV）と右心房（RA）を特定する。
5. LVの内側に25Gの針を入れたバタフライカテーテルを挿入します。細かいはさみでRAを切開し、血流の開始時に、20mLのPBSを用いて10mL /分の流速で灌流を開始し、血管から細胞および血液を除去する。正常な灌流は、血液が移動するにつれて肺と肝臓との間のブランチングによって示される。
6. 中位のはさみで動物を断頭してください。脊柱の腹側にある腹壁筋肉を切除し、尾根の根元で脊柱を切断することにより、脊柱を細かいハサミで解剖し、体から分離する。
7. PBSと腰椎側に200μLピペットチップを搭載している10mLシリンジを挿入脊柱を洗浄し、頚椎側の脊髄を洗い流す。
   注：200μLのピペットチップは、最も広い端部（約1cm）ではさみで切断し、PBSであらかじめ充填した10mLのシリンジにしっかりと挿入します。
8. 頭蓋骨の上の肌を除去し、脳を暴露するために鉗子を使用してください。頭蓋骨の基部にはさみ刃を挿入し、矢状縫合に続いて頭蓋を切断する。小さな鉗子をカットに挿入し、頭蓋骨を静かに持ち上げます。マウスの頭部から脳を解剖し、嗅球と小脳を除去する。
9. 1.128 mLの消化カクテルを含むPBS（ステップ1.1から）を含む1.5 mLチューブに脳と脊髄を集める。

3.細胞の解離

1. 1.5 mLチューブ（ステップ2.9）の脳と脊髄を細かいはさみで1〜2 mm ^3に細かく切断します （ 図1 ）。
2. 細かくした組織を入れた1.5mLのチューブを30分間インキュベートする37℃、5％CO ₂でインキュベートする。
   注：このステップで密度勾配を準備します。
3. 酵素反応を停止するために1.5 mLチューブに0.5μMEDTA（ストック溶液）20μL、最終濃度10 mMを加えます。
4. 5mLのピペットでピペットで上下に静かに細胞懸濁液を作る。
5. 10mLシリンジのプランジャーを使用して、50mLチューブ内のナイロンメッシュ（70μm孔径）に細胞懸濁液を通過させます。
6. 20mLの5％ウシ胎仔血清（FBS）-PBSでナイロンメッシュを洗浄する。
7. 室温（18℃）で7分間遠心分離する（300×g）。上清を吸引して捨て、次のステップに進む。上清を取り除くときは十分に注意してください。ペレットを邪魔しないでください。ペレットは吸引ピペットで簡単に吸引できます。

4.密度勾配

1. 適切な量​​の10×PBSを密度勾配媒体に添加することによって、密度勾配媒体の保存溶液を調製する。
   注：1部の10X PBSを9部の密度勾配媒体に加えます。
2. 表1に記載されているように、 1 ％PBSでストック密度勾配媒体を異なる割合で希釈する。
3. ペレット（ステップ3.7から）を4mLの30％密度勾配媒体で再懸濁し、15mLチューブに移す。
4. パスツールピペットを15mLチューブの底に置き、37mLの密度勾配培地4mLをゆっくりと下ろす。
5. 上記のように、4mLの70％密度勾配媒体を添加する。
6. 勾配を室温（18℃）で40分間（800xg）遠心分離する。中間相が妨げられないように、遠心分離機が最小限のブレーキなしで停止することを確認する。
   注：チューブは層状に表示されます。 70％〜37％の密度勾配界面で層化された細胞は、単核免疫細胞（小膠細胞およびマクロファージ小集団）である。上位レベルは細胞破片およびミエリンである（ 図2 ）。
7. 転送ピペットを使用して、穏やかにミエリンの層を除去する。
8. 清潔な15mLのチューブに、マクロファージ亜集団細胞を含む70〜37％密度勾配間期の​​3-4mLを集める。
9. 細胞をPBSで3回洗浄し、全量を15mLとする。細胞を含む密度勾配培地をPBSで少なくとも3回希釈し、ブレーキを「オン」にして7分間遠心する（500 xg、4℃）ことを確認します。
10. 細胞ラベリングまたは他の機能アッセイのために1mL PBSで細胞ペレットを再懸濁する。

フローサイトメトリー用細胞標識

1. フローサイトメトリーチューブに細胞を移す（ステップ4.10）。
2. ステップ4.10で得られた各細胞サンプルに1μLの固定可能な死細胞染色試薬を加えます。氷上で30分間インキュベートし、光から保護する。
3. 細胞を2 mLのPBSで1回洗浄し、5分間遠心（300 xg、4℃）します。
4. 上清を除去し、細胞ペレットを400μLのPBS1％BSA、0.1％アジド。
5. 1μgのCD16 / CD32抗体を100μLの細胞に加えて、Fcレセプターをブロックする。氷上で10-15分間インキュベートし、光から保護する。
6. 細胞内染色のための細胞浸透化のために、PBS 1％BSA、0.1％アジドまたはPBS 1％BSA、0.1％アジド、0.25％サポニン中の一次抗体混合物を調製する。
7. 100μLの一次抗体ミックス（2×）を添加し、氷上で30分間インキュベートし、光から保護する。
   注：最適な結果を得るためには、実験を行う前にすべての抗体を滴定する必要があります。
8. 2mLのPBSで細胞を洗浄し、5分間遠心分離する（300×g、4℃）。この手順を3回繰り返します。
9. 一次抗体がフルオロフォアに直接コンジュゲートしていない場合は、100μLの二次抗体を添加し、氷上で30分間インキュベートし、光から保護する。
10. 4℃で300xgで5分間遠心分離して2mLのPBSで細胞を洗浄する。この手順を3回繰り返します。
11. 修正する100μLの1％PFAを含む細胞に、光から保護された室温で15分間インキュベートする。
    注意：注意：PFAは有毒です。ヒュームフードで使用し、個人用保護具を着用する。
12. 4℃で300 xgで5分間遠心分離して2 mL PBSで細胞を洗浄する。この手順を3回繰り返します。
13. 200μLのPBSで細胞ペレットを再懸濁し、フローサイトメトリーの取得と分析に進みます。 図3のゲーティング戦略に従います 。

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結果

密度勾配遠心分離および抗体染色の後、細胞をフローサイトメーターで取得し、以下のような形態学的ゲーティング戦略を用いて分析した。単一の細胞を二重線から区別するために、ドットプロット前方散乱領域（FSC-A） 対前方散乱高（FSC-H）で第1ゲートを定義した（ 図3A ）。次いで、相対細胞サイズおよび細胞粒度に基づいて、細胞破...

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ディスカッション

ミクログリアおよびMDMは、CNSにおいて異なる機能および表現型を有することが実証されており、したがって、これらのマクロファージ亜集団の同定および分析は^、神経疾患9,18,25をよりよく理解するために不可欠である。 2つのマーカー（CD11bおよびCD45）を使用するフローサイトメトリー分析は、各亜集団の間の区別を可能にする（ 図3C ）。この戦略は、MDMにつ?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 month-old Mice	Janvier	C57BL/6J
Liberase TL Research Grade	Sigma-Aldrich	5401020001	Digestion enzyme
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	DN25
Percoll	GE Healthcare Life Sciences	17-0891-01	Density gradient medium
Cell Strainer size 70 µm Nylon	Corning	731751
Venofix 25 G	BRAUN	4056370
Piston syringe 10 mL	Terumo	SS+10ES1
Pasteur pipette 230 mm	Dustcher	20420
1.5 mL tube	Eppendorf	0030 123.328
15 mL tube	TPP	91015
50 mL tube	TPP	91050
5 mL polystyrene round bottom tube	BD Falcon	352054
D-PBS (1x) without Ca2+/Mg2+	Thermo Fisher Scientific	14190-094
D-PBS (10x) without Ca2+/Mg2+	Thermo Fisher Scientific	14200-067
Fetal bovine serum	Thermo Fisher Scientific	10270-106
EDTA	Sigma-Aldrich	E4884
Bovine Serum Albumin solution 30%	Sigma-Aldrich	A7284
Paraformaldehyde 32% Solution	Electron Microscopy Sciences	15714-S	Caution -Toxic
Saponin	Sigma-Aldrich	S2002
Sodium Azide	Sigma-Aldrich	47036
PerCPCy5.5 Rat anti-mouse CD11b (clone M1/70)	eBioscience	45-0112
Rat IgG2b K Isotype Control PerCP-Cyanine5.5	eBioscience	45-4031
BV421 Rat anti-mouse CD45 (clone 30-F11)	BD Biosciences	563890
BV421 Rat IgG2b, κ Isotype Control RUO	BD Biosciences	562603
Rabbit anti-mouse TMEM119 (clone28 - 3)	Abcam	ab209064
AlexaFluor 647 Donkey anti-rabbit IgG	Life Technologies	A31573
Anti-Mouse CD16/CD32 Purified	eBioscience	14-0161	Mouse Fc Block
Fixable Dead Cell Stain Kits	Invitrogen	L34969
Mouse CCR2 APC-conjugated Antibody	R&D	FAB5538A
Rat IgG2B APC-conjugated Isotype Control	R&D	IC013A
Mouse CX3CR1 PE-conjugated Antibody	R&D	FAB5825P
Goat IgG PE-conjugated Antibody	R&D	IC108P
Centrifuge	Eppendorf	5804R
Cell analyzer	BD Biosciences	BD FACSVERSE
Data Analysis Software	FlowJo LLC	FlowJo
Fine scissors	F.S.T	14090-11
Standard Pattern Forceps	F.S.T	11000-13
Mayo Scissors	F.S.T	14010-15
Dumont #5 Forceps	F.S.T	11251-20