Analyse von Mikroglia und Monozyten-abgeleiteten Makrophagen aus dem Zentralnervensystem durch Durchflusszytometrie

Zusammenfassung

Dieses Protokoll liefert eine Analyse der Makrophagen-Subpopulationen in das erwachsene Maus-Zentralnervensystem durch Durchflusszytometrie und ist hilfreich für die Untersuchung von mehreren Markern, die von diesen Zellen exprimiert werden.

Zusammenfassung

Zahlreiche Studien haben gezeigt, die Rolle der Immunzellen, insbesondere Makrophagen, in zentralen Zerversystem (ZNS) Pathologien. Es gibt zwei Hauptmakrophagenpopulationen im ZNS: (i) die Mikroglia, die die residenten Makrophagen des ZNS sind und von Dottersack-Progenitoren während der Embryogenese abgeleitet sind, und (ii) die Monozyten-abgeleiteten Makrophagen (MDM), die infiltrieren können Das ZNS während der Krankheit und werden aus Knochenmark-Vorläufern abgeleitet. Die Rollen jeder Makrophagen-Subpopulation unterscheiden sich je nach der untersuchten Pathologie. Darüber hinaus gibt es keinen Konsens über die histologischen Marker oder die für diese Makrophagen-Subpopulationen verwendeten Unterscheidungskriterien. Die Analyse der Expressionsprofile der CD11b- und CD45-Marker durch Durchflusszytometrie erlaubt es uns jedoch, die Mikroglia (CD11b ⁺ CD45 ^med ) vom MDM (CD11b ⁺ CD45 ^high ) zu unterscheiden. In diesem Protokoll zeigen wir, dass die DichtegradientenzentrifugationUnd die Durchflusszytometrieanalyse kann verwendet werden, um diese ZNS-Makrophagen-Subpopulationen zu charakterisieren und mehrere von diesen Zellen exprimierte Marker zu untersuchen, wie wir vor kurzem veröffentlicht haben. So kann diese Technik unser Verständnis der Rolle von Makrophagen in Mausmodellen von neurologischen Erkrankungen weitergeben und kann auch zur Bewertung von Arzneimittelwirkungen auf diese Zellen verwendet werden.

Einleitung

Die Mikroglia sind die parenchymalen Gewebe-residenten Makrophagen des Zentralnervensystems (ZNS). Sie spielen zwei wichtige Funktionsrollen: Immunabwehr und Wartung der ZNS-Homöostase. Im Gegensatz zu den MDM, die kontinuierlich aus den hämatopoetischen Stammzellen im Knochenmark erneuert werden, unterscheiden sich die Mikrogliazellen von primitiven hämatopoetischen Vorläuferzellen aus dem Dottersack (YS), die das Gehirn während der embryonalen Entwicklung ^{1 , 2 , 3} kolonisierten. Bei Nagetieren spielt der Transkriptionsfaktor Myb eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung aller von Knochenmark abgeleiteten Monozyten und Makrophagen, aber für YS-abgeleitete Mikroglia ist dieser Faktor entbehrlich und die Differenzierung bleibt abhängig vom Transkriptionsfaktor PU.1 ⁴ .

Im gesunden ZNS sind Mikroglia dynamische Zellen, die ständig ihre Umgebung abtasten, scaNning und Vermessung zum Eindringen von Krankheitserregern oder Gewebeschäden ⁵ . Die Erkennung solcher Signale leitet einen Weg ein, um die Verletzung zu lösen. Die Mikroglia wechselt schnell von einer verzweigten Morphologie zu einer amöboiden, die von Phagozytose und Freisetzung verschiedener Mediatoren wie pro- oder entzündungshemmenden Zytokinen gefolgt wird. So kann abhängig von ihrer Mikroumgebung aktivierte Mikroglia ein Spektrum unterschiedlicher Priming-Zustände ⁶ erwerben.

Die Mikroglia beeinflusst die Entwicklung und den Fortschritt vieler neurologischer Erkrankungen. Bei den Nagetiermodellen der Alzheimer-Krankheit (AD) ⁷ , der amyotrophischen Lateralsklerose (ALS) ⁸ , der Multiple Sklerose (MS) ⁹ oder der Parkinson-Krankheit (PD) ^{10 wird gezeigt} , dass die Mikroglia eine doppelte Rolle spielt, die entweder eine nachteilige Neurotoxizität oder eine wirksame Wirkung hervorruft In einer neuroprotektiven Weise, die abhängig ist oN die spezifische Krankheit, das Krankheitsstadium und ob die Krankheit durch das systemische Immunabteil ^{7 , 8 , 9 , 10 , 11 beeinflusst wurde} . Die meisten der in den oben genannten Krankheiten beobachteten ZNS-Läsionen enthalten eine heterogene Population von myeloiden Zellen, darunter nicht nur parenchymale Mikroglia, sondern auch perivaskuläre und meningeale Makrophagen sowie CNS-infiltrierende MDM. Diese Zelltypen können unterschiedlich zu den pathophysiologischen Mechanismen beitragen, die sich auf Verletzungen und Reparaturen beziehen ^{7 , 12 , 13 , 14 , 15} . Die gegenwärtige Herausforderung für Forscher, die diese Krankheitsmodelle studieren, besteht darin, festzustellen, ob die peripheren Monozyten und Makrophagen das ZNS infiltrieren und wenn ja, in distLegen Sie die residenten Mikroglia aus diesen Zellen. In der Tat sind die Mikrogliazellen sehr plastisch; Wenn sie aktiviert sind, werden die Mikroglia-Marker, die üblicherweise durch periphere Monozyten und Makrophagen exprimiert werden, erneut exprimieren. Das Problem beruht daher auf der Identifizierung von Markern, die die residenten Mikroglia von den infiltrierenden Monozyten und Makrophagen unterscheiden können.

Die Diskriminierung dieser Populationen auf Gehirnscheiben durch immunhistologische Anwendungen ist aufgrund des Fehlens spezifischer Antikörper begrenzt. Die Durchflusszytometrieanalyse ist jedoch eine effiziente Technik zur Beurteilung der Expression mehrerer Marker und zur Unterscheidung von Zellpopulationen (z. B. Lymphozyten, Makrophagen / MDM CD11b ⁺ CD45 ^hoch und Microglia CD11b ⁺ CD45 ^med ) sowie Zellsubpopulationen ^{16 , 17 , 18} Dieses Protokoll beschreibt die Verfahren zur Isolierung derMononukleare Zellen aus dem Maus-ZNS in neurologischen Erkrankungsmodellen unter Verwendung einer optimierten, enzymatischen Gewebe-Dissoziation und einer Dichtegradienten-Zentrifugation; Sowie ein Verfahren zur Differenzierung der Mikroglia- und MDM-Populationen im ZNS durch Durchflusszytometrie.

Ein weiterer Ansatz besteht darin, das Myelin zu eliminieren und die Zellen unter Verwendung von magnetischen Perlen zu reinigen, die mit spezifischen Antikörpern ^{19 , 20 , 21} konjugiert sind. Die Myelinentfernung unter Verwendung von Anti-Myelin-Magnetperlen ist teurer und beeinflusst die Lebensfähigkeit und die Ausbeute an isolierten Zellen ²² . Dieser Schritt und die folgende immunomagnetische Trennung der Mikroglia, beschränken weitere Untersuchungen der spezifischen Immunzellpopulationen ^{21 , 22} .

Diese Verfahren bieten eine einfache Möglichkeit, die Makrophagen-Subpopulationen in der Krankheitsentwicklung zu untersuchen undUm die Arzneimittelwirkungen oder Genmodifikationen auf Makrophagen-Phänotypen und Aktivierungszuständen zu bestimmen.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokoll

Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee am ICM Institute und dem Darwin French Ethic Animal Committee genehmigt und sind unter dem Protokoll 01407.02 abgedeckt.

1. Vorbereitung

1. Den Verdauungscocktail in einem 1,5 mL Röhrchen vorbereiten, indem man für jede Maus folgendes kombiniert: 1 ml Phosphatgepufferte Salzlösung (PBS); 123 μl Verdauungsenzym (siehe Materialtabelle) bei 13 wunsch / mL (Stammlösung), Endkonzentration 1,6 wunsch / mL; Und 5 & mgr; l DNase I (siehe Tabelle der Materialien) bei 100 mg / ml (Stammlösung), Endkonzentration 0,5 mg / ml.

2. Perfusion und Dissektion

1. Euthanisieren der Mäuse mit einer letalen Dosis Pentobarbital (100 μl bei 400 mg / ml).
2. Legen Sie das Tier in Rückenlage und nass den Körper mit 70% Ethanol.
3. Schneide die ventrale Haut mit feiner Schere direkt unterhalb des Xyphus-Prozesses, um den Thorax-Cavit auszusetzenY
4. Machen Sie einen Einschnitt in die Membran und schneiden Sie die seitlichen Aspekte des Brustkorbes mit feinen Scheren in einer kaudalen zu rostralen Richtung, um das Herz auszusetzen (und vermeiden Sie das Schneiden von anderen Organen). Identifizieren Sie den linken Ventrikel (LV) und den rechten Vorhof (RA).
5. Setzen Sie einen Schmetterlingskatheter mit einer 25 G Nadel im Inneren des LV ein. Machen Sie einen Einschnitt auf der RA mit feinen Scheren und am Anfang des Blutflusses, starten Sie die Perfusion bei 10 mL / min Durchflussrate durch die LV mit 20 mL PBS, um Zellen und Blut aus Gefäßen zu entfernen; Die erfolgreiche Perfusion wird durch die Blanchierung der Lunge und der Leber als Blut verunreinigt.
6. Das Tier mit einer mittleren Schere enthaupten. Die Wirbelsäule mit feiner Schere zerreißen und vom Körper trennen, indem man die Bauchwandmuskulatur auf der Bauchseite der Wirbelsäule aufhebt und die Wirbelsäule an der Unterseite des Schwanzes schneidet.
7. Legen Sie eine 10 ml Spritze mit PBS und eine 200 μl Pipettenspitze in die Lendenwirbelsäule einDie Wirbelsäule und spüle das Rückenmark auf der zervikalen Seite.
   HINWEIS: Die 200 μl Pipettenspitze wird mit einer Schere an ihrem breitesten Ende (ca. 1 cm) geschnitten und auf eine 10 mL Spritze, die zuvor mit PBS gefüllt ist, fest eingesteckt.
8. Entfernen Sie die Haut über dem Schädel und verwenden Sie Pinzette, um das Gehirn freizulegen. Setzen Sie ein Scherenblatt an die Basis des Schädels und schneiden Sie den Schädel nach der sagittalen Naht. Setzen Sie kleine Zangen in den Schnitt und heben Sie den Schädel vorsichtig an. Ziehen Sie das Gehirn aus dem Mauskopf und entfernen Sie die olfaktorische Glühbirne und Kleinhirn.
9. Sammeln Sie das Gehirn und das Rückenmark in einem 1,5 ml-Röhrchen mit 1,128 ml PBS mit dem Verdauungscocktail (ab Schritt 1.1).

3. Zelldissoziation

1. Das Gehirn und das Rückenmark im 1,5 mL Röhrchen (Schritt 2.9) in 1-2 mm ³ Stück mit kleiner Schere schneiden ( Bild 1 ).
2. Inkubieren Sie das 1,5 ml-Röhrchen, das das gehackte Gewebe enthält, für 30 min in einem InkubaBei 37 ° C mit 5% CO ₂ .
   HINWEIS: Den Dichtegradienten in diesem Schritt vorbereiten.
3. Füge 20 μl 0,5 M EDTA (Stammlösung), Endkonzentration 10 mM, zum 1,5 mL Röhrchen hinzu, um die enzymatische Reaktion zu stoppen.
4. Vorsichtig eine Zellsuspension durch Pipettieren auf und ab mit einer 5-ml-Pipette machen.
5. Führen Sie die Zellsuspension durch ein Nylongewebe (70 μm Porengröße) in einem 50 mL Röhrchen unter Verwendung des Tauchkolbens einer 10 ml Spritze.
6. Waschen Sie das Nylongewebe mit 20 ml 5% fetalem Rinderserum (FBS) -PBS.
7. 5 min (300 xg) bei Raumtemperatur (18 ° C) zentrifugieren. Verwerfe den Überstand durch Aspiration und gehe zum nächsten Schritt. Sei besonders vorsichtig beim Entfernen des Überstandes; Störe nicht das Pellet, das leicht von der Saugpipette angesaugt werden kann.

4. Dichtegradient

1. Vorbereiten einer Stammlösung des Dichtegradientenmediums durch Zugabe der geeigneten Menge von 10x PBS zu dem Dichtegradientenmedium.
   HINWEIS: Füge einen Teil 10X PBS zu neun Teilen Dichtegradientenmedium hinzu.
2. Verdünnen Sie das Stammdichtegradientenmedium mit 1x PBS für die verschiedenen Prozentsätze, wie in Tabelle 1 beschrieben .
3. Das Pellet (ab Schritt 3.7) mit 4 mL 30% Dichtegradientenmedium resuspendieren und in ein 15 mL Röhrchen überführen.
4. Legen Sie eine Pasteurpipette in den Boden des 15-ml-Röhrchens und legen Sie langsam 4 ml 37% Dichtegradientenmedium auf.
5. Füge 4 ml 70% Dichtegradientenmedium hinzu, wie oben beschrieben.
6. Den Gradienten für 40 min (800 xg) bei Raumtemperatur (18 ° C) zentrifugieren. Stellen Sie sicher, dass die Zentrifuge mit minimaler oder keiner Bremse stoppt, damit die Zwischenphase nicht gestört wird.
   HINWEIS: Die Röhre wird geschichtet erscheinen. Die Zellen, die an der 70% - 37% Dichtegradientenschnittstelle geschichtet sind, sind die mononukleierten Immunzellen (Mikroglia und Makrophagen Subpopulationen); Die oberen Ebenen sind Zelltrümmer und Myelin ( Abbildung 2 ).
7. Verwenden Sie eine Transferpipette, entfernen Sie vorsichtig die Myelinschicht.
8. Sammeln Sie 3-4 ml der 70-37% Dichtegradienten-Interphase, die die Makrophagen-Subpopulationszellen enthält, in ein sauberes 15-ml-Röhrchen.
9. Waschen Sie die Zellen 3x mit PBS, Gesamtvolumen von 15 ml. Achten Sie darauf, dass das die Zellen enthaltende Dichtegradientenmedium mindestens dreimal mit PBS verdünnt und 7 min (500 xg, 4 ° C) mit der Bremse "ein" zentrifugiert wird.
10. Das Zellpellet mit 1 ml PBS zur Zellmarkierung oder für andere funktionelle Assays resuspendieren.

5. Zellbeschriftung für Durchflusszytometrie

1. Übertragen Sie die Zellen (Schritt 4.10) in eine Durchflusszytometrie-Röhre.
2. Füge 1 μl fixierbares totes Zellfleck-Reagens zu jeder in Schritt 4.10 erhaltenen Zellprobe hinzu. Inkubieren für 30 min auf Eis, vor Licht geschützt.
3. Die Zellen einmal mit 2 ml PBS waschen und 5 min zentrifugieren (300 xg, 4 ° C).
4. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet mit400 & mgr; l PBS 1% BSA, 0,1% Azid.
5. Füge 1 μg CD16 / CD32 Antikörper zu 100 μl der Zellen hinzu, um die Fc-Rezeptoren zu blockieren. Inkubieren Sie 10-15 min auf Eis, geschützt vor Licht.
6. Bereiten Sie die primäre Antikörpermischung in PBS 1% BSA, 0,1% Azid oder PBS 1% BSA, 0,1% Azid, 0,25% Saponin, für die Zellpermeabilisierung für intrazelluläre Färbung vor.
7. 100 μl Primär-Antikörper-Mischung (2x) zugeben und 30 min auf Eis, inkubiert, inkubieren.
   HINWEIS: Alle Antikörper sollten vor der Durchführung des Experiments titriert werden, um optimale Ergebnisse zu erzielen.
8. Die Zellen mit 2 ml PBS waschen und 5 min zentrifugieren (300 xg, 4 ° C). Wiederholen Sie diesen Schritt dreimal.
9. Fügen Sie 100 μl eines sekundären Antikörpers hinzu, wenn die primären Antikörper nicht direkt an einen Fluorophor konjugiert sind und für 30 min auf Eis, vor Licht geschützt, inkubieren.
10. Die Zellen mit 2 ml PBS waschen und 5 min bei 300 xg bei 4 ° C zentrifugieren). Wiederholen Sie diesen Schritt dreimal.
11. Beheb dasZellen mit 100 μl 1% PFA für 15 min bei Raumtemperatur, vor Licht geschützt.
    HINWEIS: Achtung: PFA ist giftig. In einer Dunstabzugshaube verwenden und persönliche Schutzausrüstung tragen.
12. Die Zellen mit 2 ml PBS waschen und 5 min bei 300 xg bei 4 ° C zentrifugieren. Wiederholen Sie diesen Schritt dreimal.
13. Das Zellpellet mit 200 μl PBS resuspendieren und die Cytometrieerfassung und -analyse durchlaufen. Befolgen Sie die Gating-Strategie in Abbildung 3 .

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Ergebnisse

Nach der Dichtegradientenzentrifugation und Antikörperfärbung wurden die Zellen auf einem Durchflusszytometer gewonnen und unter Verwendung einer morphologischen Gating-Strategie wie folgt analysiert. Ein erstes Tor wurde im Punkt-Forward-Scattered-Area (FSC-A) gegenüber der Forward-Scattered-Height (FSC-H) definiert, um einzelne Zellen aus Dubletten zu unterscheiden ( Abbildung 3A ). Die einzelnen Zellen wurden dann auf FSC-A versus Sid...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Diskussion

Es wurde gezeigt, dass die Mikroglia und MDM unterschiedliche Funktionen und Phänotypen im ZNS haben und somit die Identifizierung und die Analyse dieser Makrophagen-Subpopulationen wesentlich sind, um neurologische Erkrankungen besser zu verstehen ^{9 , 18 , 25} . Durchflusszytometrieanalyse unter Verwendung von zwei Markern (CD11b und CD45) ermöglicht die Unterscheidung zwischen jeder Subpopulation ( Abbil...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 month-old Mice	Janvier	C57BL/6J
Liberase TL Research Grade	Sigma-Aldrich	5401020001	Digestion enzyme
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	DN25
Percoll	GE Healthcare Life Sciences	17-0891-01	Density gradient medium
Cell Strainer size 70 µm Nylon	Corning	731751
Venofix 25 G	BRAUN	4056370
Piston syringe 10 mL	Terumo	SS+10ES1
Pasteur pipette 230 mm	Dustcher	20420
1.5 mL tube	Eppendorf	0030 123.328
15 mL tube	TPP	91015
50 mL tube	TPP	91050
5 mL polystyrene round bottom tube	BD Falcon	352054
D-PBS (1x) without Ca2+/Mg2+	Thermo Fisher Scientific	14190-094
D-PBS (10x) without Ca2+/Mg2+	Thermo Fisher Scientific	14200-067
Fetal bovine serum	Thermo Fisher Scientific	10270-106
EDTA	Sigma-Aldrich	E4884
Bovine Serum Albumin solution 30%	Sigma-Aldrich	A7284
Paraformaldehyde 32% Solution	Electron Microscopy Sciences	15714-S	Caution -Toxic
Saponin	Sigma-Aldrich	S2002
Sodium Azide	Sigma-Aldrich	47036
PerCPCy5.5 Rat anti-mouse CD11b (clone M1/70)	eBioscience	45-0112
Rat IgG2b K Isotype Control PerCP-Cyanine5.5	eBioscience	45-4031
BV421 Rat anti-mouse CD45 (clone 30-F11)	BD Biosciences	563890
BV421 Rat IgG2b, κ Isotype Control RUO	BD Biosciences	562603
Rabbit anti-mouse TMEM119 (clone28 - 3)	Abcam	ab209064
AlexaFluor 647 Donkey anti-rabbit IgG	Life Technologies	A31573
Anti-Mouse CD16/CD32 Purified	eBioscience	14-0161	Mouse Fc Block
Fixable Dead Cell Stain Kits	Invitrogen	L34969
Mouse CCR2 APC-conjugated Antibody	R&D	FAB5538A
Rat IgG2B APC-conjugated Isotype Control	R&D	IC013A
Mouse CX3CR1 PE-conjugated Antibody	R&D	FAB5825P
Goat IgG PE-conjugated Antibody	R&D	IC108P
Centrifuge	Eppendorf	5804R
Cell analyzer	BD Biosciences	BD FACSVERSE
Data Analysis Software	FlowJo LLC	FlowJo
Fine scissors	F.S.T	14090-11
Standard Pattern Forceps	F.S.T	11000-13
Mayo Scissors	F.S.T	14010-15
Dumont #5 Forceps	F.S.T	11251-20