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  • Résumé
  • Résumé
  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Ce protocole fournit une analyse des sous-populations de macrophages dans le système nerveux central de souris par cytométrie de flux et est utile pour l'étude de marqueurs multiples exprimés par ces cellules.

Résumé

De nombreuses études ont démontré le rôle des cellules immunitaires, en particulier des macrophages, dans les pathologies du système nerveux central (SNC). Il existe deux principales populations de macrophages dans le SNC: (i) la microglie, qui sont les macrophages résidents du SNC et dérivent des progéniteurs du sac vésiculaire pendant l'embryogenèse, et (ii) les macrophages dérivés des monocytes (MDM), qui peuvent infiltrer Le SNC pendant la maladie et sont dérivés de progéniteurs de moelle osseuse. Les rôles de chaque sous-population de macrophages diffèrent en fonction de la pathologie étudiée. En outre, il n'y a pas de consensus sur les marqueurs histologiques ou les critères distinctifs utilisés pour ces sous-populations de macrophages. Cependant, l'analyse des profils d'expression des marqueurs CD11b et CD45 par cytométrie en flux nous permet de distinguer la microglie (CD11b + CD45 med ) du MDM (CD11b + CD45 haute ). Dans ce protocole, nous montrons que la centrifugation à gradient de densitéEt l'analyse par cytométrie de flux peut être utilisée pour caractériser ces sous-populations de macrophages du SNC et pour étudier plusieurs marqueurs d'intérêt exprimés par ces cellules au fur et à mesure de notre publication. Ainsi, cette technique peut favoriser notre compréhension du rôle des macrophages dans les modèles de souris de maladies neurologiques et peut également être utilisée pour évaluer les effets sur ces cellules.

Introduction

Les microglies sont les macrophages résiduels du système nerveux central (SNC) parenchymateux. Ils jouent deux rôles fonctionnels clés: la défense immunitaire et le maintien de l'homéostasie du SNC. Contrairement au MDM, qui sont renouvelés continuellement à partir des cellules souches hématopoïétiques dans la moelle osseuse, les cellules microgliales se différencient des cellules progénitrices hématopoïétiques primitifs provenant du sac vellé (YS) qui ont colonisé le cerveau pendant le développement embryonnaire 1 , 2 , 3 . Chez les rongeurs, le facteur de transcription Myb joue un rôle crucial dans le développement de tous les monocytes et macrophages dérivés de la moelle osseuse, mais pour la microglie dérivée de YS, ce facteur est dispensable et la différenciation reste dépendante du facteur de transcription PU.1 4 .

Dans le SNC sain, les microglies sont des cellules dynamiques qui échantillonnent constamment leur environnement, scaEt l'arpentage pour les agents pathogènes envahissants ou les dommages aux tissus 5 . La détection de ces signaux déclenche une voie pour résoudre la blessure. La microglie passe rapidement d'une morphologie ramifiée à une amiboïde, suivie d'une phagocytose et d'une libération de divers médiateurs, tels que des cytokines pro ou anti-inflammatoires. Ainsi, selon leur microenvironnement, la microglie activée peut acquérir un spectre d'états d'amorçage distincts 6 .

La microglie a un impact profond sur le développement et la progression de nombreux troubles neurologiques. Dans les modèles de rongeurs de la maladie d'Alzheimer (AD) 7 , de la Sclérose latérale amyotrophique (ALS) 8 , de la Sclérose en plaques (MS) 9 ou de la maladie de Parkinson (PD) 10 , la microglie joue un double rôle, induisant une neurotoxicité néfaste ou agissant De manière neuroprotective, qui dépend deN la maladie spécifique, le stade de la maladie et si la maladie a été influencée par le compartiment immunitaire systémique 7 , 8 , 9 , 10 , 11 . La plupart des lésions du SNC observées dans les maladies citées ci-dessus contiennent une population hétérogène de cellules myéloïdes, y compris non seulement la microglie parenchymateuse, mais aussi les macrophages périvasculaires et méningés, ainsi que le MDM infiltrant le SNC. Ces types de cellules peuvent contribuer de manière différentielle aux mécanismes pathophysiologiques liés aux blessures et à la réparation 7 , 12 , 13 , 14 , 15 . Le défi actuel pour les chercheurs qui étudient ces modèles de maladie est d'établir si les monocytes et les macrophages périphériques s'infiltrent dans le SNC et, dans l'affirmative,Astuce la microglie résidante de ces cellules. En effet, les cellules microgliales sont très plastiques; Lorsqu'ils sont activés, les marqueurs de réticine de microglie sont habituellement exprimés par des monocytes périphériques et des macrophages. La question, par conséquent, repose sur l'identification de marqueurs qui peuvent distinguer la microglie résidante des monocytes et des macrophages infiltrants.

La discrimination de ces populations sur les tranches de cerveau par des applications immunohistologiques est limitée en raison du manque d'anticorps spécifiques. Cependant, l'analyse par cytométrie en flux est une technique efficace pour évaluer l'expression de plusieurs marqueurs et pour distinguer les populations cellulaires (par exemple, lymphocytes, macrophages / MDM CD11b + CD45 haute et microglie CD11b + CD45 med ), ainsi que les sous-populations cellulaires 16 , 17 , 18 . Ce protocole décrit les procédures pour isoler lesDes cellules mononucléaires du SNC de souris dans des modèles de maladies neurologiques en utilisant une dissociation de tissu enzymatique optimisée et une centrifugation en gradient de densité; Ainsi qu'une méthode pour différencier les populations de microglie et MDM dans le SNC en utilisant la cytométrie en flux.

Une autre approche est d'éliminer la myéline et de purifier les cellules en utilisant des billes magnétiques conjuguées à des anticorps spécifiques 19 , 20 , 21 . L'élimination de la myéline à l'aide de perles magnétiques anti-myéline est plus coûteuse et affecte la viabilité et le rendement des cellules isolées 22 . Cette étape et la séparation immunomagnétique suivante de la microglie, limitent les études supplémentaires de populations de cellules immunitaires spécifiques 21 , 22 .

Ces procédures fournissent un moyen simple d'étudier les sous-populations de macrophages dans le développement de la maladie, etPour déterminer les effets des médicaments ou les modifications des gènes sur les phénotypes et les états d'activation des macrophages.

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Protocole

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par le Comité institutionnel pour les soins et l'utilisation des animaux à l'Institut ICM et par le Comité d'éthique française de Darwin, et sont couverts par le protocole 01407.02.

1. Préparation

  1. Préparez le cocktail de digestion dans un tube de 1,5 mL en combinant les suivants pour chaque souris: 1 ml de solution salée tamponnée au phosphate (PBS); 123 μL enzyme de digestion (voir tableau de matériaux) à 13 wunsch / mL (solution mère), concentration finale 1,6 wunsch / mL; Et 5 μL d'ADNase I (voir tableau de matières) à 100 mg / mL (solution mère), concentration finale 0,5 mg / mL.

2. Perfusion et dissection

  1. Éuthaniser les souris avec une dose létale de pentobarbital (100 μL à 400 mg / mL).
  2. Placez l'animal en position couchée et humectez le corps avec 70% d'éthanol.
  3. Couper la peau ventrale avec des ciseaux fins juste en dessous du processus xyphoïde pour exposer la cavité thoraciqueY.
  4. Faire une incision dans le diaphragme et couper les aspects latéraux de la cage thoracique avec un ciseau fin dans une direction caudale à rostrale pour exposer le cœur (et éviter de couper d'autres organes). Identifiez le ventricule gauche (LV) et l'oreillette droite (RA).
  5. Insérez un cathéter papillon avec une aiguille de 25 G à l'intérieur du LV. Faire une incision sur la RA avec des ciseaux fins et au début du flux sanguin, commencer la perfusion à un débit de 10 ml / min dans le LV avec 20 ml de PBS pour éliminer les cellules et le sang des vaisseaux; Une perfusion réussie est notée par le blanchiment des poumons et le foie à mesure que le sang est déplacé.
  6. Décapiter l'animal avec des ciseaux moyens. Dissectionnez la colonne vertébrale avec des ciseaux fins et séparez-le du corps en excitant la musculature de la paroi abdominale sur le côté ventral de la colonne vertébrale et en coupant la colonne vertébrale à la base de la queue.
  7. Insérez une seringue de 10 ml contenant du PBS et une pointe de pipette de 200 μL montée dans le côté lombaire deLa colonne vertébrale et rincer la moelle épinière du côté cervical.
    REMARQUE: la pointe de la pipette de 200 μL est coupée avec des ciseaux à son extrémité la plus large (environ 1 cm) et bien insérée sur une seringue de 10 ml précédemment remplie de PBS.
  8. Retirez la peau au-dessus du crâne et utilisez une pince pour exposer le cerveau. Insérez une lame à ciseaux à la base du crâne et coupez le crâne suivant la suture sagittale. Insérez de petites pinces dans la coupe et soulevez doucement le crâne. Dissecez le cerveau de la tête de la souris et retirez l'ampoule olfactive et le cervelet.
  9. Recueillir le cerveau et la moelle épinière dans un tube de 1,5 ml contenant 1,128 mL de PBS avec un cocktail de digestion (à partir de l'étape 1.1).

3. Dissociation cellulaire

  1. Couper finement le cerveau et la moelle épinière dans le tube de 1,5 mL (étape 2.9) en 1-2 mm 3 avec de petits ciseaux ( Figure 1 ).
  2. Incuber le tube de 1,5 ml contenant les tissus émincés pendant 30 min dans une incubaÀ 37 ° C avec 5% de CO 2 .
    REMARQUE: Préparez le gradient de densité à cette étape.
  3. Ajouter 20 μL d'EDTA 0,5 M (solution mère), concentration finale 10 mM, au tube de 1,5 ml pour arrêter la réaction enzymatique.
  4. Faites doucement une suspension de cellules en pipetant vers le haut et vers le bas avec une pipette de 5 mL.
  5. Passer la suspension cellulaire à travers un maille de nylon (taille de pores de 70 μm) dans un tube de 50 ml en utilisant le piston d'une seringue de 10 ml.
  6. Laver le filet de nylon avec 20 mL de sérum bovin fêtal 5% (FBS) -PBS.
  7. Centrifugeuse pendant 7 min (300 xg) à température ambiante (18 ° C). Jeter le surnageant par aspiration et passer à l'étape suivante. Soyez extrêmement prudent lorsque vous retirez le surnageant; Ne pas déranger la pastille, qui peut être facilement aspirée par la pipette d'aspiration.

4. Dégradé de densité

  1. Préparer une solution stock du milieu gradient de densité en ajoutant la quantité appropriée de PBS 10x au milieu à gradient de densité.
    REMARQUE: Ajoutez une partie 10X PBS à un gradient de densité de neuf parties.
  2. Diluer le milieu de gradient de densité de stock avec 1x PBS pour les différents pourcentages, comme décrit dans le tableau 1 .
  3. Remettre en suspension la pastille (à partir de l'étape 3.7) avec un milieu gradient de densité de 4 mL et 30% et passer à un tube de 15 mL.
  4. Placer une pipette Pasteur dans le fond du tube de 15 ml et sous-couche lentement 4 mL de milieu de gradient de densité de 37%.
  5. Ajouter 4 mL de milieu à gradient de densité à 70%, comme décrit ci-dessus.
  6. Centrifuger le gradient pendant 40 min (800 xg) à température ambiante (18 ° C). Assurez-vous que la centrifugeuse s'arrête avec un frein minimal ou nul, de sorte que l'interphase n'est pas perturbée.
    REMARQUE: Le tube apparaîtra stratifié. Les cellules superposées à l'interface à gradient de densité de 70% à 37% sont les cellules immunitaires mononucléées (sous-populations de microglie et de macrophages); Les niveaux supérieurs sont respectivement les débris cellulaires et la myéline ( figure 2 ).
  7. En utilisant une pipette de transfert, retirez doucement la couche de myéline.
  8. Recueillir 3 à 4 ml de l'interphase de gradient de densité 70 à 37% contenant les cellules des sous-populations de macrophages dans un tube propre de 15 ml.
  9. Lavez les cellules 3x avec du PBS, volume total de 15 ml. Assurez-vous que le milieu de gradient de densité contenant les cellules est dilué au moins trois fois avec du PBS et centrifuger pendant 7 minutes (500 xg, 4 ° C) avec le frein "on".
  10. Remettre en suspension le culot cellulaire avec 1 mL de PBS pour l'étiquetage cellulaire ou pour d'autres essais fonctionnels.

5. Étiquetage cellulaire pour la cytométrie de flux

  1. Transférer les cellules (étape 4.10) dans un tube de cytométrie en flux.
  2. Ajouter 1 μL de réactif de coloration de cellules mortes fixable à chaque échantillon de cellule obtenu à l'étape 4.10. Incuber pendant 30 minutes sur de la glace, protégé de la lumière.
  3. Laver les cellules une fois avec 2 ml de PBS et centrifuger pendant 5 min (300 xg, 4 ° C).
  4. Retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire avec400 μL de PBS 1% de BSA, 0,1% d'azide.
  5. Ajouter 1 μg d'anticorps CD16 / CD32 à 100 μL des cellules pour bloquer les récepteurs Fc. Incuber 10 à 15 minutes sur de la glace, protégé de la lumière.
  6. Préparer le mélange d'anticorps primaire dans PBS 1% de BSA, 0,1% d'azide ou PBS 1% de BSA, 0,1% d'azide, 0,25% de saponine, pour la perméabilisation cellulaire pour la coloration intracellulaire.
  7. Ajouter 100 μL de mélange d'anticorps primaires (2x) et incuber pendant 30 minutes sur de la glace, protégé de la lumière.
    REMARQUE: Tous les anticorps doivent être titrés avant de mener l'expérience afin d'obtenir des résultats optimaux.
  8. Laver les cellules avec 2 mL de PBS et centrifuger pendant 5 min (300 xg, 4 ° C). Répétez cette étape trois fois.
  9. Ajouter 100 μL d'un anticorps secondaire si les anticorps primaires ne sont pas directement conjugués à un fluorophore et incuber pendant 30 minutes sur de la glace, protégés de la lumière.
  10. Laver les cellules avec 2 mL de PBS et centrifuger pendant 5 min à 300 xg à 4 ° C). Répétez cette étape trois fois.
  11. Repare leCellules avec 100 μL de PFA à 1% pendant 15 minutes à température ambiante, protégées de la lumière.
    REMARQUE: Attention: le PFA est toxique. Utiliser dans une hotte et porter un équipement de protection individuelle.
  12. Laver les cellules avec 2 ml de PBS et centrifuger pendant 5 minutes à 300 xg à 4 ° C. Répétez cette étape trois fois.
  13. Remise en suspension de la pastille cellulaire avec 200 μl de PBS et procéder à l'acquisition et à l'analyse de la cytométrie en flux. Suivez la stratégie de verrouillage de la figure 3 .

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Résultats

Après la centrifugation en gradient de densité et la coloration d'anticorps, les cellules ont été acquises sur un cytomètre de flux et analysées à l'aide d'une stratégie de fermeture morphologique comme suit. Une première grille a été définie dans la zone de répartition par points (FSC-A) par rapport à la hauteur réversible (FSC-H) pour discriminer les cellules individuelles des doublets ( Figure 3A ). Les cellules individ...

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Discussion

Il a été démontré que la microglie et le MDM ont différentes fonctions et phénotypes dans le SNC, et donc l'identification et l'analyse de ces sous-populations de macrophages sont essentielles pour mieux comprendre les maladies neurologiques 9 , 18 , 25 . L'analyse de cytométrie de flux utilisant deux marqueurs (CD11b et CD45) permet la distinction entre chaque sous-population ( Figure 3C...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à dévoiler

Remerciements

Ce travail a été soutenu par des subventions de l'Agence Nationale pour la Recherche (ANR-12-MALZ-0003-02-P2X7RAD), de l'Association France Alzheimer et de Bpifrance. Notre laboratoire est également soutenu par l'Inserm, le CNRS, l'Université Pierre et Marie-Curie et le programme "Investissements d'avenir" ANR-10-IAIHU-06 (IHU-A-ICM). Nous tenons à remercier l'assistance de l'établissement de base CELIS de la culture cellulaire.

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
5 month-old MiceJanvierC57BL/6J
Liberase TL Research GradeSigma-Aldrich5401020001Digestion enzyme
Deoxyribonuclease I from bovine pancreasSigma-AldrichDN25
PercollGE Healthcare Life Sciences17-0891-01Density gradient medium
Cell Strainer size 70 µm NylonCorning731751
Venofix 25 GBRAUN4056370
Piston syringe 10 mLTerumoSS+10ES1
Pasteur pipette 230 mmDustcher20420
1.5 mL tubeEppendorf0030 123.328
15 mL tubeTPP91015
50 mL tubeTPP91050
5 mL polystyrene round bottom tubeBD Falcon352054
D-PBS (1x) without Ca2+/Mg2+Thermo Fisher Scientific14190-094
D-PBS (10x) without Ca2+/Mg2+Thermo Fisher Scientific14200-067
Fetal bovine serumThermo Fisher Scientific10270-106
EDTASigma-AldrichE4884
Bovine Serum Albumin solution 30%Sigma-AldrichA7284
Paraformaldehyde 32% SolutionElectron Microscopy Sciences15714-SCaution -Toxic
SaponinSigma-AldrichS2002
Sodium AzideSigma-Aldrich47036
PerCPCy5.5 Rat anti-mouse CD11b (clone M1/70)eBioscience45-0112
Rat IgG2b K Isotype Control PerCP-Cyanine5.5eBioscience45-4031
BV421 Rat anti-mouse CD45 (clone 30-F11)BD Biosciences563890
BV421 Rat IgG2b, κ Isotype Control RUOBD Biosciences562603
Rabbit anti-mouse TMEM119 (clone28 - 3)Abcamab209064
AlexaFluor 647 Donkey anti-rabbit IgGLife TechnologiesA31573
Anti-Mouse CD16/CD32 PurifiedeBioscience14-0161Mouse Fc Block
Fixable Dead Cell Stain KitsInvitrogenL34969
Mouse CCR2 APC-conjugated AntibodyR&DFAB5538A
Rat IgG2B APC-conjugated Isotype ControlR&DIC013A
Mouse CX3CR1 PE-conjugated AntibodyR&DFAB5825P
Goat IgG PE-conjugated AntibodyR&DIC108P
CentrifugeEppendorf5804R
Cell analyzerBD BiosciencesBD FACSVERSE
Data Analysis SoftwareFlowJo LLCFlowJo
Fine scissorsF.S.T14090-11
Standard Pattern ForcepsF.S.T11000-13
Mayo ScissorsF.S.T14010-15
Dumont #5 ForcepsF.S.T11251-20

Références

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