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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Questo protocollo fornisce un'analisi delle subpopulazioni del macrofage nel sistema nervoso centrale del mouse adulto mediante citometria a flusso ed è utile per lo studio di marcatori multipli espressi da queste cellule.

Abstract

Numerosi studi hanno dimostrato il ruolo delle cellule immunitarie, in particolare dei macrofagi, nelle patologie del sistema nervoso centrale (CNS). Esistono due principali popolazioni di macrofagi nel CNS: (i) la microglia, che sono i macrofagi residenti del CNS e sono derivate da progenitori di sacchi di tuorlo durante l'embriogenesi e (ii) i macrofagi derivanti da monociti (MDM), che possono infiltrarsi Il CNS durante la malattia e sono derivate da progenitori del midollo osseo. I ruoli di ciascuna sottopopolazione dei macrofagi variano a seconda della patologia studiata. Inoltre, non esiste un consenso sui marcatori istologici o sui criteri distintivi utilizzati per queste sottopopolazioni macrofagi. Tuttavia, l'analisi dei profili di espressione dei marker CD11b e CD45 mediante citometria a flusso ci consente di distinguere la microglia (CD11b + CD45 med ) dall' MDM (CD11b + CD45 alta ). In questo protocollo mostriamo che la centrifugazione di gradiente di densitàE l'analisi della citometria a flusso può essere utilizzata per caratterizzare queste subpopulazioni del macrofago del CNS e per studiare diversi marcatori di interesse espressi da queste cellule come abbiamo recentemente pubblicato. Così, questa tecnica può ulteriormente comprendere il ruolo dei macrofagi nei modelli di topi di malattie neurologiche e può anche essere usato per valutare gli effetti della droga su queste cellule.

Introduzione

La microglia sono i macrofagi del tissue-residuo parenchimale del sistema nervoso centrale (CNS). Essi svolgono due ruoli funzionali chiave: difesa immunitaria e mantenimento dell'omeostasi CNS. In contrasto con l'MDM, che vengono continuamente rinnovate dalle cellule staminali ematopoietiche nel midollo osseo, le cellule microgliali si differenziano dalle cellule progenitrici primitive ematopoietiche originate dal sacco di tuorlo (YS) che colonizzarono il cervello durante lo sviluppo embrionale 1 , 2 , 3 . Nei roditori il fattore di trascrizione Myb svolge un ruolo fondamentale nello sviluppo di tutti i monociti e macrofagi derivanti dal midollo osseo, ma per Yglia microglia, questo fattore è dispensabile e la differenziazione rimane dipendente dal fattore di trascrizione PU.1.

Nel sano CNS, microglia sono cellule dinamiche che continuamente esemplare il loro ambiente, scaNning e indagini per l'invasione di patogeni o danni ai tessuti 5 . La rilevazione di tali segnali inizia un percorso per risolvere il danno. La microglia va rapidamente da una morfologia ramificata a quella amoboide, seguita da fagocitosi e rilascio di vari mediatori, come citochine pro o anti-infiammatorie. Pertanto, a seconda del loro microambiente, la microglia attivata può acquisire uno spettro di stati distinti di preparazione 6 .

La microglia influenza profondamente lo sviluppo e la progressione di molti disturbi neurologici. Nei modelli roditori della malattia di Alzheimer (AD) 7 , della sclerosi laterale amyotrofica (ALS) 8 , della sclerosi multipla (MS) 9 o della malattia di Parkinson (PD) 10 , la microglia dimostra di svolgere un ruolo doppio, o indurre neurotossicità dannosa o agire In modo neuroprotettivo, che è dipendente oN la malattia specifica, la fase della malattia e se la malattia è stata influenzata dal vano immunitario sistemico 7 , 8 , 9 , 10 , 11 . La maggior parte delle lesioni CNS osservate nelle malattie citate sopra contengono una popolazione eterogenea di cellule mieloide, tra cui non solo microglia parenchimale, ma anche macrofagi perivascolari e meningiali, nonché MDM infiltrante CNS. Questi tipi di cellule possono contribuire in modo differenziato ai meccanismi patofisiologici legati alla lesione e alla riparazione 7 , 12 , 13 , 14 , 15 . La sfida attuale per gli investigatori che stanno studiando questi modelli di malattia è stabilire se i monociti e i macrofagi periferici si infiltrano nel CNS e, in caso affermativo, a distInguiare la microglia residente da queste cellule. Infatti, le cellule microgliali sono molto plastiche; Quando sono attivati, i marcatori di re-espressione di microglia che sono solitamente espressi da monociti e macrofagi periferici. La questione si basa pertanto sull'individuazione di marcatori che possono distinguere la microglia residente dai monociti infiammatori e dai macrofagi.

La discriminazione di queste popolazioni sulle fette del cervello mediante applicazioni immunohistologiche è limitata a causa della mancanza di anticorpi specifici. Tuttavia, l'analisi della citometria a flusso è una tecnica efficace per valutare l'espressione di diversi marcatori e per distinguere le popolazioni cellulari (ad esempio, i linfociti, i macrofagi / MDM CD11b + CD45 e microglia CD11b + CD45 med ), così come le sottopopolazioni di cellule 16 , 17 , 18 . Questo protocollo descrive le procedure per l'isolamentoCellule mononucleari del topo CNS nei modelli di malattia neurologica utilizzando una dissociazione tissutale ottimizzata e enzimatica e una centrifugazione di gradiente di densità; Nonché un metodo per differenziare le popolazioni di microglia e MDM nel CNS utilizzando la citometria a flusso.

Un altro approccio è quello di eliminare la mielina e purificare le cellule utilizzando perline magnetiche coniugate a specifici anticorpi 19 , 20 , 21 . La rimozione della mielina usando le perline magnetiche anti-mieline è più costosa e influenza la vitalità e la resa delle cellule isolate 22 . Questo passaggio e la seguente separazione immunomagnetica della microglia, limitano ulteriori studi di popolazioni specifiche delle cellule immunitarie 21 , 22 .

Queste procedure forniscono un modo semplice per studiare le sottopopolazioni dei macrofagi nello sviluppo delle malattie, ePer determinare gli effetti farmacologici o le modificazioni geniche sui fenotipi macrofagi e sugli stati di attivazione.

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Protocollo

Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali presso l'Istituto ICM e dal Comitato per gli animali etnici di Darwin, e sono trattati con il protocollo 01407.02.

1. Preparazione

  1. Preparare il cocktail di digestione in un tubo da 1,5 ml combinando le seguenti forme per ogni topo: 1 mL di fosfato bucidato salina (PBS); 123 μL di enzima di digestione (vedere tabella dei materiali) a 13 wunsch / mL (soluzione di riserva), concentrazione finale 1,6 wunsch / mL; E 5 μL DNasi I (vedere tabella dei materiali) a 100 mg / ml (soluzione di scorta), concentrazione finale 0,5 mg / ml.

2. Perfusione e dissezione

  1. Eutanizzare i topi con una dose letale di pentobarbital (100 μL a 400 mg / ml).
  2. Posizionare l'animale in posizione supina e bagnare il corpo con il 70% di etanolo.
  3. Tagliare la pelle ventrale con forbici sottili appena al di sotto del processo xifoide per esporre la cavità toracicay.
  4. Effettuare un'incisione nel diaframma e tagliare gli aspetti laterali della gabbia con una raffinata scissorsin in direzione caudale-rostrala per esporre il cuore (evitando di tagliare altri organi). Identificare il ventricolo sinistro (LV) e l'atrio destro (RA).
  5. Inserire un catetere a farfalla con un ago da 25 G all'interno del LV. Effettuare un'incisione sulla RA con forbici finissime e all'inizio del flusso sanguigno, iniziare la perfusione a 10 mL / min di portata attraverso il LV con 20 mL di PBS per rimuovere le cellule e il sangue dalle vasi; La perfusione efficace è nota dal blanching dei polmoni e del fegato in quanto il sangue viene spostato.
  6. Decapitare l'animale con forbici medio. Disseccare la colonna vertebrale con forbici fine e separarla dal corpo escitando la muscolatura della parete addominale sul lato ventrale della colonna vertebrale e tagliando la colonna vertebrale alla base della coda.
  7. Inserire una siringa da 10 ml contenente PBS e una punta pipetta montata da 200 μL nel lato lombare diLa colonna vertebrale e sciacquare il midollo spinale sul lato cervicale.
    NOTA: La punta della pipetta da 200 μL viene tagliata con forbici alla sua estremità più larga (circa 1 cm) e strettamente inserita su una siringa da 10 ml precedentemente riempita con PBS.
  8. Rimuovere la pelle sopra il cranio e utilizzare le pinze per esporre il cervello. Inserire una lama di forbice alla base del cranio e tagliare il cranio seguendo la sutura sagittale. Inserire piccole pinze nel taglio e sollevare delicatamente il cranio. Disseccare il cervello dalla testa del mouse e rimuovere la lampadina olfattiva e il cervelletto.
  9. Raccogliere il cervello e il midollo spinale in un tubo da 1,5 mL contenente 1,128 ml di PBS con il cocktail di digestione (dal punto 1.1).

3. Dissociazione delle cellule

  1. Tagliare finemente il cervello e il midollo spinale nel tubo da 1,5 ml (passo 2.9) in 1-2 mm 3 pezzi con forbici piccole ( figura 1 ).
  2. Incubare il tubo da 1,5 ml contenente i tessuti macinati per 30 minuti in un incubatoA 37 ° C con 5% di CO 2 .
    NOTA: Preparare il gradiente di densità a questo punto.
  3. Aggiungere 20 μl 0,5 M EDTA (soluzione di riserva), concentrazione finale 10 mM, al tubo da 1,5 mL per fermare la reazione enzimatica.
  4. Creare delicatamente una sospensione cellulare pipettando su e giù con una pipetta da 5 ml.
  5. Passare la sospensione cellulare attraverso una maglia di nylon (dimensioni di pori da 70 μm) in un tubo da 50 ml utilizzando lo stantuffo di una siringa da 10 ml.
  6. Lavare la maglia di nylon con 20 ml di 5% Fetal Bovine Serum (FBS) -PBS.
  7. Centrifugare per 7 minuti (300 xg) a temperatura ambiente (18 ° C). Scartare il surnatante aspirando e procedere alla fase successiva. Prestare particolare attenzione quando si rimuove il surnatante; Non disturbare il pellet, che può essere facilmente aspirato dalla pipetta aspirante.

4. Gradiente di densità

  1. Preparare una soluzione di scorta del mezzo di gradiente di densità aggiungendo la quantità appropriata di 10x PBS al mezzo di gradiente di densità.
    NOTA: Aggiunta di una parte di 10X PBS a nove parti di gradiente di densità.
  2. Diluire il medium di gradiente di densità di stock con 1x PBS per le diverse percentuali come descritto nella Tabella 1 .
  3. Riposizionare il pellet (dal punto 3.7) con 4 mL di 30% di gradiente di densità e trasferire in un tubo da 15 mL.
  4. Posizionare una pipetta Pasteur nel fondo del tubo da 15 ml e sottovalutare lentamente 4 mL di mezzo di gradiente di densità del 37%.
  5. Aggiungere 4 mL di media di gradiente di densità del 70%, come descritto in precedenza.
  6. Centrifugare il gradiente per 40 min (800 xg) a temperatura ambiente (18 ° C). Assicurarsi che la centrifuga si arresti con un minimo o nessun freno in modo che l'interfaccia non sia disturbata.
    NOTA: il tubo sarà stratificato. Le cellule stratificate all'interfaccia di gradiente di densità del 70% -37% sono le cellule immunitarie mononucleate (sottopopolazioni microglia e macrofagi); I livelli superiori sono detriti cellulari e mielina, rispettivamente ( Figura 2 ).
  7. Usando una pipetta di trasferimento, togliere delicatamente lo strato di mielina.
  8. Raccogliere 3-4 mL della interfaccia di gradiente di densità del 70-37% contenente le cellule di subpopulazioni del macrofage in un tubo pulito da 15 mL.
  9. Lavare le cellule 3x con PBS, volume totale di 15 ml. Assicurarsi che il mezzo di gradiente di densità contenente le cellule sia diluito almeno tre volte con PBS e centrifughi per 7 minuti (500 xg, 4 ° C) con il freno "on".
  10. Resuspendere il pellet cellulare con 1 ml di PBS per l'etichettatura delle cellule o per altri dosaggi funzionali.

5. Etichettatura cellulare per la citometria di flusso

  1. Trasferire le celle (punto 4.10) in un tubo di citometria a flusso.
  2. Aggiungere 1 μl di reagente per la macchiatura della cellula morta fissabile a ciascun campione di cellule ottenuto al punto 4.10. Incubare per 30 minuti in ghiaccio, protetto dalla luce.
  3. Lavare le cellule una volta con 2 ml di PBS e centrifugare per 5 min (300 xg, 4 ° C).
  4. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet di cellula con400 μl PBS 1% BSA, 0,1% azide.
  5. Aggiungere 1 μg di anticorpi CD16 / CD32 a 100 μL delle cellule per bloccare i recettori Fc. Incubare 10-15 min su ghiaccio, protetto dalla luce.
  6. Preparare la miscela anticorpale primaria in PBS 1% BSA, 0,1% azide o PBS 1% BSA, 0,1% azide, 0,25% saponin, per la permeabilizzazione delle cellule per la colorazione intracellulare.
  7. Aggiungere 100 μL di anticorpi primari mescolare (2x) e incubare per 30 minuti in ghiaccio, protetto dalla luce.
    NOTA: Tutti gli anticorpi devono essere titolati prima di condurre l'esperimento per garantire risultati ottimali.
  8. Lavare le cellule con 2 ml di PBS e centrifugare per 5 min (300 xg, 4 ° C). Ripetere questo passaggio tre volte.
  9. Aggiungere 100 μL di un anticorpo secondario se gli anticorpi primari non sono direttamente coniugati a un fluoroforo e incubare per 30 minuti in ghiaccio, protetti dalla luce.
  10. Lavare le cellule con 2 ml di PBS e centrifugare per 5 min a 300 xg a 4 ° C). Ripetere questo passaggio tre volte.
  11. Fissare ilCellule con 100 μl 1% PFA per 15 minuti a temperatura ambiente, protetti dalla luce.
    NOTA: Attenzione: il PFA è tossico. Usare in una cappa aspirante e indossare equipaggiamento protettivo personale.
  12. Lavare le cellule con 2 ml di PBS e centrifugare per 5 min a 300 xg a 4 ° C. Ripetere questo passaggio tre volte.
  13. Resuspendere il pellet cellulare con 200 μl di PBS e procedere all'acquisizione e all'analisi della citometria a flusso. Seguire la strategia di gating in Figura 3 .

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Risultati

Dopo la centrifugazione di gradiente di densità e la colorazione degli anticorpi, le cellule sono state acquisite su un citometro di flusso e analizzate utilizzando una strategia di gating morfologica come segue. Un primo cancello è stato definito nella zona di puntamento di Forward-Spattered-Area (FSC-A) rispetto alla Forward-Spattered-Height (FSC-H) per discriminare singole celle da dublets ( Figura 3A ). Le singole cellule sono state quindi gat...

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Discussione

È stato dimostrato che la microglia e l'MDM hanno funzioni e fenotipi diversi nel CNS e quindi l'identificazione e l'analisi di queste subpopulazioni macrofagi sono essenziali per meglio capire le malattie neurologiche 9 , 18 , 25 . L'analisi della citometria a flusso utilizzando due marcatori (CD11b e CD45) consente la distinzione tra ciascuna sottopopolazione ( Figura 3C ). Quest...

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Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dell'Agenzia Nazionale per la Recherche (ANR-12-MALZ-0003-02-P2X7RAD), l'Associazione Francia Alzheimer e Bpifrance. Il nostro laboratorio è anche supportato da Inserm, CNRS, Université Pierre et Marie Curie e il programma "Investigations d'avenir" ANR-10-IAIHU-06 (IHU-A-ICM). Vorremmo ringraziare l'assistenza della centrale CELIS per la coltura delle cellule.

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
5 month-old MiceJanvierC57BL/6J
Liberase TL Research GradeSigma-Aldrich5401020001Digestion enzyme
Deoxyribonuclease I from bovine pancreasSigma-AldrichDN25
PercollGE Healthcare Life Sciences17-0891-01Density gradient medium
Cell Strainer size 70 µm NylonCorning731751
Venofix 25 GBRAUN4056370
Piston syringe 10 mLTerumoSS+10ES1
Pasteur pipette 230 mmDustcher20420
1.5 mL tubeEppendorf0030 123.328
15 mL tubeTPP91015
50 mL tubeTPP91050
5 mL polystyrene round bottom tubeBD Falcon352054
D-PBS (1x) without Ca2+/Mg2+Thermo Fisher Scientific14190-094
D-PBS (10x) without Ca2+/Mg2+Thermo Fisher Scientific14200-067
Fetal bovine serumThermo Fisher Scientific10270-106
EDTASigma-AldrichE4884
Bovine Serum Albumin solution 30%Sigma-AldrichA7284
Paraformaldehyde 32% SolutionElectron Microscopy Sciences15714-SCaution -Toxic
SaponinSigma-AldrichS2002
Sodium AzideSigma-Aldrich47036
PerCPCy5.5 Rat anti-mouse CD11b (clone M1/70)eBioscience45-0112
Rat IgG2b K Isotype Control PerCP-Cyanine5.5eBioscience45-4031
BV421 Rat anti-mouse CD45 (clone 30-F11)BD Biosciences563890
BV421 Rat IgG2b, κ Isotype Control RUOBD Biosciences562603
Rabbit anti-mouse TMEM119 (clone28 - 3)Abcamab209064
AlexaFluor 647 Donkey anti-rabbit IgGLife TechnologiesA31573
Anti-Mouse CD16/CD32 PurifiedeBioscience14-0161Mouse Fc Block
Fixable Dead Cell Stain KitsInvitrogenL34969
Mouse CCR2 APC-conjugated AntibodyR&DFAB5538A
Rat IgG2B APC-conjugated Isotype ControlR&DIC013A
Mouse CX3CR1 PE-conjugated AntibodyR&DFAB5825P
Goat IgG PE-conjugated AntibodyR&DIC108P
CentrifugeEppendorf5804R
Cell analyzerBD BiosciencesBD FACSVERSE
Data Analysis SoftwareFlowJo LLCFlowJo
Fine scissorsF.S.T14090-11
Standard Pattern ForcepsF.S.T11000-13
Mayo ScissorsF.S.T14010-15
Dumont #5 ForcepsF.S.T11251-20

Riferimenti

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