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摘要

本协议描述了在少量回收的缓冲液中的氧水平的稳定, 以及在淹没的急性海马切片中记录活动依赖性突触可塑性的方法学方面。

摘要

尽管自1951年以来, 脑切片的实验已经开始使用, 但问题仍然存在, 这就降低了在执行场电位或胞内记录时对突触传输调制进行稳定和成功分析的可能性。这篇手稿描述的方法学方面, 可能有助于改善实验条件的维护急性脑切片和记录场兴奋性突触后电位在一个商业可用的淹没室与流出-carbogenation 单位。外流 carbogenation 有助于稳定氧气水平的实验, 依靠回收的小缓冲水库, 以提高成本效益的药物实验。此外, 该手稿还有代表性的实验, 考察不同的 carbogenation 模式和刺激范式对突触传递的活动依赖性突触可塑性的影响。

引言

在 1951年, 第一次报告的急性脑切片实验进行了1。在 1971年, 在成功的体外录音从梨皮层2,3和发现海马神经元是相互连接横向沿 septotemporal 轴海马4, 其中一个第一个体外海马神经元活动的记录实现了5。神经或 neurostructural 参数的相似性神经元在体内和体外条件仍然是一些辩论的主题6, 但在 1975年, Schwartzkroin7表示, 基神经元的性质是保持在体外和高频刺激 (即,后背) 的传入在海马形成诱导一个长期的促进突触潜能8。神经元活动的电生理记录在体外极大地扩展了活动依赖性突触可塑性的细胞机制的研究910在1973年被极乐发现et al.11在体内实验中用家兔。

研究神经元活动或信号通路的脑切片, 特别是在急性海马切片, 现在是一个标准的工具。然而, 令人惊讶的是,在试管中的实验还没有标准化, 这证明了在急性海马切片的制备和维持方面仍然存在着多种方法。里德et al.(1988)12回顾了在不同类型的切片室中维持急性脑切片的方法学挑战, 以及沐浴培养基、pH 值、温度和氧水平的选择。由于体外切片记录设置的 custom-made 元素, 这些参数在记录室中仍然难以控制。可以找到的出版物, 可能有助于克服一些方法上的挑战, 并描述了新类型的淹没切片室, 如间质 3D microperfusion 系统13, 一个室的层流和氧气增强提供14, 一个具有计算机温度控制的系统15, 以及一个多记录系统16。由于这些房间不易建造, 大多数科学家依赖于商业上可用的切片室。这些室可以安装在显微镜系统, 从而允许的电生理和荧光成像的结合17,18,19。由于这些腔室保持脑切片淹没在人工脑脊液 (aCSF), 高流速的缓冲液的解决方案需要保持, 增加了药物应用的费用。为此, 我们已经采用了一个循环再灌注系统与流出-carbogenation, 提供足够的稳定性, 以长期记录的现场电位在一个浸没的切片室使用相对较小的 aCSF 体积。此外, 我们总结了如何使用这个实验 carbogenation/灌注系统影响的结果, 活动相关的突触可塑性10和如何抑制真核伸长 factor-2 激酶 (eEF2K) 调节突触传输20。

研究方案

这些动物是按照中国上海复旦大学脑科学研究所和医学神经生物学国家重点实验室的既定动物保育标准和程序进行维护的。

1. 溶液制备

注意: 请参见材料表。

  1. 准备切片缓冲区 (修改后的 Gey 的解决方案):92 毫米氯化钠, 2.5 毫米氯化钾, 1.25 毫米 NaH2PO4, 30 mm NaHCO3, 25 mm 葡萄糖, 20 mm HEPES, 3 mm Na+-丙酮酸, 10 mm MgSO4, 0.5 mm CaCl2。
  2. 将 pH 值调整到 7.6, 使用1米氢氧化钠而不 carbogenation。
  3. 将缓冲区存储在4° c。
    注: 滴定澄清混浊液体。渗透是 305-310 mOsm。卡波金21包含5% 的二氧化碳和95% 的氧气。
  4. 通过稀释不含碳酸氢盐和葡萄糖的 aCSF 的10x 储存液来制备 aCSF, 给出最后的成分: 124 毫米氯化钠, 2.5 毫米氯化钾, 2.5 mm CaCl2, 2 mm 氯化镁2, 和 1.25 mm 的2PO4。
  5. 添加碳酸氢钠和葡萄糖达到10毫米葡萄糖和 26 mm NaHCO3。
  6. Carbogenate 的 aCSF 通过一个穿孔的硅管, 并在添加 NaHCO3后立即阻止其结束。
  7. 测量 ph 值而 carbogenating (ph 值 7.3-7.4)。
    注意: 通过更改 NaHCO3的数量, 可以稍微调整缓冲区容量。由于所产生的 ph 值是温度依赖性的, 因此必须在工作温度 (例如, 30 ° c) 时检查所产生的 ph 值而 carbogenating。

2. 急性海马切片的制备

注意: 请参见材料表。

  1. 将切片保持网格放入一个用于急性脑切片的孵化室中, 用 aCSF 填充腔, carbogenate (4-6 升/小时), 在28-30 ° c 时至少为 30 min22 。
  2. 把手术器械冷却到2-4 ° c。
  3. 放置一个玻璃烧杯充满冷和 carbogenated 切片缓冲 (2-4 ° c), 保持在一个冰/水混合物, 附近的 vibratome。
  4. 麻醉鼠或小鼠, 直到角膜反射消失 (30-50 秒) 使用异氟醚, 采取500µL 到2升玻璃罐或12.5 µL 到50毫升管。
  5. 使用在《马修斯et al.的出版物中详细描述和可视化的方法隔离大脑(2011)23和远et al.(2014)24。
  6. 在解剖小脑和分离半球之前, 将大脑降温至2-4 ° c, ice-cold 切片缓冲 (至少2分钟)。
  7. 使用冷手术刀片解剖在每个半球的背缘25的一个70角度的背部皮质块, 从腹侧和海马的中间部分获得横向切片, 如图 1C所示和E。
  8. 用一个冷的牙科水泥刮刀, 转移一个半球到一块滤纸, 以简要干燥创建的表面 (1-2 s)。
  9. 在 ice-cold 切片平台上用快作用的胶粘胶将两个半球用新的切割表面装入;让半球尾端面对刀片式服务器 (图 1D)。
  10. 将切片平台放入 vibratome 的冷却室中, 并将该腔室与切片缓冲 (2-4 ° c) 填充。Carbogenate 使用穿孔硅管。
  11. 使用适当的 vibratome 设置 (例如,刀片前进速度: 1.2 毫米/秒, 刀片振幅: 1 mm) 切割350µm 切片。
  12. 用两个注射套管 (#62; 28 克) 将海马的形成从 subiculum 和嗅皮层分离出来, 作为剪刀。
  13. 使用巴斯德吸管从先前准备的孵化室的切片保持网格中除去气泡。
  14. 将具有一定透明度的切片从孵化室的网格上的切片平台转移到 pyramidale 层。避免任何折叠, 伸展, 重叠, 和浮动的吸 aCSF 和切片到一个大嘴巴斯德吸管。
    注: 整个过程 (步骤 2.5-2.14) 可以采取5-10 分钟;因此, 在4° c 的情况下, 检查缓冲液的温度以保持它的时间是很重要的。
  15. 孵育在30° c 的切片在孵化室至少 1.5-2 小时, 并提供卡波金在4-6 升/小时。
    注意: 调整卡波金的流速以在孵化器中循环缓冲, 但防止切片漂浮。

3. Carbogenation 对小型水库 aCSF 循环的改造

  1. 将3路管道连接器添加到回收系统的流出 (图 2B)。
  2. 将3路管接头的中间臂与卡波金的电源管连接起来, 并使用气流指示器 (3-4 升/小时、图 2D和图 4C) 调节流量。
  3. 添加第二个3路管接头到回收系统的流入。将中间臂与内圈加热器的管子相连, 将上臂与一根薄薄的硅管 (10 厘米长) 和下臂连接到流入管 (低通过滤器;图 4C)。
  4. 将管机放在一个薄的硅管上 (外径: 2 毫米), 在该管的位置上, 由蠕动泵产生的 aCSF 在切片室中的脉动最小。
    注: 流出-carbogenation (流出-碳水化合物) 的改性降低了 carbogenation 水平对 aCSF 储层容积、aCSF 回收率和小 aCSF 油藏内相对管位的敏感性 (#60; 50 毫升;图 3)。对于低通滤波器, 在稀薄的硅管中一定量的空气减少了 aCSF 流的脉动;因此, 该管应填补大部分与空气。

4。在浸没的切片室中记录突触反应

注意: 请参见材料表。

  1. 预热 aCSF 溶液在水浴到大约28-30 ° c (这将防止气泡形成在记录室)。
  2. 启动回收系统 (4-5 毫升/分钟), 并激活内联加热器, 平衡系统至少1小时。
  3. 打一小块镜片清洁纸和一个尼龙网格固定在 U 形的铂丝在浸没的切片室几分钟 (图 4)。
  4. 取下 U 形铂丝。
  5. 关闭回收, 并在镜头清洁纸上放置一个切片。
  6. 立即将切片保持网格放在切片的顶部, 打开泵, 让切片平衡30分钟, 而不将目标浸入 aCSF。
  7. 填充硼硅酸盐微 (即,记录电极) 与 aCSF (尖端电阻: 1-2 ω, 填充1/3 与 aCSF), 并将其装入吸管支架。
  8. 通过将金属刺激电极放入 NaHCO3溶液 (和 #62; 40 mM) 来检查其绝缘性。将电极连接到直流电压发生器的负极 (1-2 V, 正极: 银或铂线), 并观察在解剖显微镜 (和 #62; 60x 放大倍率) 下, 在尖端形成气泡。
  9. 将经测试的环氧绝缘钨刺激电极放在机械手支架和切片室中的参考线上。
  10. 将第二个参考电极添加到腔室, 并将其连接到记录电极的 headstage 的参考插座 (图 4a)。
  11. 在放大器控制软件, 点击 "零钳模式" 框, 并通过双击 "输出增益列表" 框进行。选择增益 "100", 双击 "高通滤波器列表框 (贝塞尔)", 选择 "0.1 Hz", 然后双击 "低通滤波器列表框 (AC)" 以选择 "3 赫"。
  12. 在录制软件中, 单击 "获取 |开放的协议。选择一个协议, 允许在10-20 赫50-100 毫秒的场景刺激和放大电位的数字化的设置, 并自动触发了一个在一幕式录音开始后, 一个激励隔离10毫秒。
  13. 将刺激和记录电极与地层 pyramidale 平行, 例如图 4B和图 5)。
  14. 点击 "获取 |编辑协议 ", 然后选择" 触发器 "选项卡 (在弹出窗口中)。点击 "触发源" 框, 选择 "空格键" 作为触发源。单击 "确定" 按钮。单击 "记录" 按钮开始获取, 并注意带有触发器按钮的弹出窗口。
  15. 在刺激隔离软件中, 点击 "电压控制" 框, 进入 "0"。单击 "下载" 按钮。单击 "录制软件" 窗口并按空格键。重复此循环, 按顺序输入值从1到 8, 例如, 在 "电压控制" 框中的 1 mV 步骤。
  16. 将激发强度与 fEPSP 斜率值进行关联, 并确定获得40% 的 fEPSP 斜率最大的激发强度。单击 "电压控制箱" 并输入确定的值。单击 "下载" 按钮。
    注: 刺激隔离器用于将短电压或电流脉冲应用于脑组织。双相脉冲可以有100µs 每个阶段。
  17. 在录制软件中, 单击 "停止" 按钮然后 "获取" 菜单。单击 "编辑协议", 然后在弹出窗口中选择 "触发器" 选项卡。单击 "触发器源" 框, 然后选择 "内部计时器" 作为触发器源。单击 "确定" 按钮。例如, 单击 "记录" 按钮, 每个三十年代开始自动记录字段电位。30-60 分钟后单击 "停止" 按钮。
  18. 点击 "获取" 菜单, 点击 "打开协议", 选择所需的突触可塑性感应协议, 然后点击 "OK" 按钮。点击 "记录" 按钮, 自动激活高频刺激和录音。单击 "停止" 按钮。
    注: 在与突触可塑性相关的研究中, 在长时间的基线记录之后, 应用一种标准的归纳范式来长期增强或长期抑郁。在图 7和图 8中描述了由此产生的突触传输调制的典型示例。
  19. 在录制软件中, 单击 "获取 |打开协议 "并选择与步骤4.12 中相同的协议。单击 "确定" 按钮, 然后单击 "录制"。例如, 保持自动运行2-4 小时的现场潜在录音。单击 "停止" 按钮以终止录制。
  20. 在药物研究的情况下, 如果需要永久性复合管理 (图 6), 直接将化合物应用于 aCSF 油藏。

5. 清理设置和提示

注: 请参阅下面的一般提示。

  1. 每周通过回收 10% H2O2来清洁系统, 不超过20分钟, 然后用去离子 H2o 进行清洗。
    注: 不推荐使用乙醇清洗。同样不建议在 H2O2中浸入参考线和目标。
  2. 在物镜或室周围的表面上用0.1 的 HCl 和水除去沉淀的盐。
  3. 在蒸馏水或0.1 的 HCl 中清洗卡波金起泡。
  4. 将切片孵化室浸泡在10% 小时2O2中, 每周5分钟, 然后用去离子 H2O 彻底冲洗孵化室。
  5. 在金属刺激电极的情况下, 每次实验后用去离子水冲洗刺激电极尖端, 用乙醇浸泡的棉球轻轻擦拭刺激电极尖端, 除去残留的组织。
  6. 通过对砂纸进行仔细的滑动, 去除尖端的绝缘层, 从而降低商业金属刺激电极的电阻。
  7. 通过用聚四氟乙烯管取代硅管, 减少从 aCSF 中回收卡波金的损失。
  8. 将记录电极和参考电极的银线保持在漂白剂中数天, 以形成氯化在金属丝表面上。

结果

在 "协议" 部分, 我们描述了由雄性 C57BL/6 小鼠和雄性大鼠 (5-8 周) 的海马形成 (图 1) 的腹侧和中间部分的急性海马切片的制备。半球在切片机平台上的位置有助于保持它们的稳定, 并消除琼脂或琼脂糖对稳定的需要。灌注系统本身是基于在高转速下运行的蠕动泵, 以提供所需的液体流速。因此, 在泵的标准管迅速老化造成了一个很大的问题, 我们克服了...

讨论

虽然界面切片室表现出更强大的突触响应25,26,27,28, 淹没腔室为膜片钳记录和荧光提供了额外的便利成像.因此, 我们已经描述了几个方面的现场电位记录的急性海马切片使用商业浸没切片室, 可以很容易地扩展到成像的荧光探针在神经元17,18,

披露声明

提交人声明, 这项研究是在没有任何商业或财务关系的情况下进行的, 可被理解为潜在的利益冲突。

致谢

. 进行、分析、设计了实验并写了手稿。D.X. 和中共协助图准备和进行实验。这项工作得到了自然科学基金 (31320103906) 和111项目 (B16013) 对肺结核

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
Reagents required
NaClSinopharm Chemical Reagent, China10019318
KClSinopharm Chemical Reagent, China10016318
KH2PO4Sinopharm Chemical Reagent, China10017618
MgCl2·6H2OSinopharm Chemical Reagent, China10012818
CaCl2Sinopharm Chemical Reagent, China10005861
NaHCO3Sinopharm Chemical Reagent, China10018960
GlucoseSinopharm Chemical Reagent, China10010518
NaH2PO4Sinopharm Chemical Reagent, China20040718
HEPESSigmaH3375
Sodium pyruvateSigmaA4043
MgSO4Sinopharm Chemical Reagent, China20025118
NaOHSinopharm Chemical Reagent, China10019718
Tools and materials for dissection
DecapitatorsHarvard apparatus55-0012for rat decapitation
Bandage ScissorsSCHREIBER12-4227for mouse decapitation
double-edge bladeFlying Eagle, China74-C
IRIS ScissorsRWD, ChinaS12003-09
Bone RongeursRWD, ChinaS22002-14
SpoonHammacher HSN 152-13
dental cement spatulaHammacher HSN 016-15
dental double end excavatorBlacksmith Surgical, USABS-415-017
Vibrating MicrotomeLeica, GermanyVT1200S
surgical blade RWD, ChinaS31023-02
surgical holderRWD, ChinaS32007-14
Electrophysiology equipment and materials
Vertical Pipette PullerNarishige, JapanPC-10
Vibration isolation tableMeirits, JapanADZ-A0806
submerged type recording chamberWarner InstrumentsRC-26GLP
4 Axis MicromanipulatorSutter, USAMP-285, MP-225
Platinum WireWorld Precision InstrumentsPTP406
AmplifierMolecular Devices, USAMulticlamp 700B
Data Acquisition SystemMolecular Devices, USADigidata 1440A
Anaysis softwareMolecular Devices, USAClampex 10.2
Fluorescence MicroscopeNikon, JapanFN1
LED light sourceLumen Dynamics Group, CanadaX-cite 120LED
micropipettesHarvard apparatusGC150TFextracelluar recording
borosilicate micropipettesSutter, USABF150-86patch clamp
tungsten electrodeA-M Systems, USA575500
peristaltic pumpLonger, ChinaBT00-300T
tubes for peristaltic pumpISMATEC, Wertheim, GermanySC03091x inflow, ID: 1.02 mm
tubes for peristaltic pumpISMATEC, Wertheim, GermanySC03192x tubes for outflow, ID: 2.79 mm
CCD cameraPCO, Germanypco.edge sCMOS
lens cleaning paperKodak
50 mL conical centrifuge tubeThermo scientific339652
PrechamberWarner InstrumentsBSC-PC
Inline heaterWarner InstrumentsSF-28
Temperature ControllerWarner InstrumentsTC-324B

参考文献

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