Gravação de plasticidade sináptica em fatias Hippocampal agudas, mantidas em um pequeno volume reciclagem - perfusão- e sistema de câmara de submersão-tipo

Resumo

Este protocolo descreve a estabilização do nível de oxigênio em um pequeno volume de tampão reciclado e aspectos metodológicos da plasticidade sináptica dependente de atividade de gravação em fatias hippocampal agudas submersas.

Resumo

Apesar de experiências com fatias do cérebro têm sido utilizados desde 1951, subsistem problemas que reduzem a probabilidade de alcançar uma análise estável e bem sucedida da modulação da transmissão sináptica ao realizar gravações de campo potencial ou intracelular. Este manuscrito descreve aspectos metodológicos que podem ser úteis na melhoria das condições experimentais para a manutenção de fatias cerebral aguda e para gravação de potenciais pós-sinápticos excitatórios do campo em uma câmara de submersão comercialmente disponível com uma unidade de saída-carbogenation. O efluxo-carbogenation ajuda a estabilizar o nível de oxigênio em experimentos que contam com a reciclagem de um reservatório pequeno buffer para melhorar o custo-eficácia das experiências de drogas. Além disso, o manuscrito apresenta experimentos representativos que examinam os efeitos da estimulação paradigmas e modos diferentes de carbogenation sobre a plasticidade sináptica dependente da atividade de transmissão sináptica.

Introdução

Em 1951, os experimentos de fatia cerebral aguda primeiro-relatado foram realizados¹. Em 1971, após a bem sucedida em vitro gravações da piriform córtex^2,3 e a descoberta de que os neurônios hippocampal estão interligados transversalmente ao longo do eixo septotemporal do hipocampo⁴, dentre as primeiras gravações em vitro da atividade neuronal hippocampal foi alcançado⁵. A similaridade de parâmetros neurofisiológicos ou neurostructural de neurônios sob condições in vivo e in vitro são ainda objecto de algum debate⁶, mas em 1975, Schwartzkroin⁷ , indicou que o basal Propriedades dos neurônios são mantidas em vitro e que a estimulação de alta-frequência (ou seja, Tetanização) de afferents na formação hippocampal induz uma facilitação de longa duração dos potenciais sinápticos⁸. Eletrofisiológicos de gravação de atividade neuronal em vitro , expandiu o estudo dos mecanismos celulares de plasticidade sináptica dependente de atividade^9,10, que havia sido descoberto em 1973 por Bliss et al. ¹¹ no in vivo de experiências com coelhos.

O estudo da atividade neuronal ou sinalização de percursos em fatias do cérebro e especialmente em fatias hippocampal agudas, é agora uma ferramenta padrão. No entanto, surpreendentemente, experimentos em vitro ainda precisam ser padronizada, como evidenciado por várias abordagens que ainda existem para a preparação e manutenção de fatias hippocampal agudas. Reid et al . (1988) ¹² revista os desafios metodológicos para a manutenção de fatias de cérebro aguda em diferentes tipos de câmaras de fatia e as escolhas de banhar o nível médio, pH, temperatura e oxigênio. Esses parâmetros são ainda difíceis de controlar na câmara devido aos elementos feitos sob medidas na vitro fatia-gravação configurações de gravação. Publicações podem ser encontradas que pode ajuda para superar alguns dos desafios metodológicos e que descrevem novos tipos de câmaras de fatia de submersão, tais como um sistema de microperfusion 3D intersticial¹³, uma câmara com maior fluxo laminar e oxigênio fornecer um sistema de gravação multi-câmara¹⁶, um sistema com controle de temperatura computadorizado¹⁵e¹⁴. Uma vez que estas câmaras não são fáceis de construir, a maioria dos cientistas dependem de câmaras fatia comercialmente disponível. Estas câmaras podem ser montadas em um sistema do microscópio, permitindo assim a combinação de eletrofisiologia e fluorescência de imagem^17,18,19. Uma vez que estas câmaras mantém as fatias de cérebro submergidas no líquido cefalorraquidiano artificial (aCSF), uma taxa de fluxo elevada da solução-tampão precisa ser mantida, aumentando a despesa da aplicação da droga. Para este fim, nós incorporamos um sistema de reciclagem da perfusão com vazão-carbogenation que fornece a estabilidade suficiente para a gravação de longo prazo dos potenciais de campo em uma câmara de fatia de submersão usando um volume relativamente pequeno aCSF. Além disso, estamos resumidos como o uso deste sistema experimental carbogenation/perfusão afeta o resultado de plasticidade sináptica dependente de atividade¹⁰ e como inibição da quinase de 2-fator de alongamento eucariótico (eEF2K) modula sináptica transmissão de²⁰.

Protocolo

Os animais foram mantidos em conformidade com os padrões estabelecidos de cuidados com animais e procedimentos dos institutos de ciência do cérebro e estado chave laboratório de médicos neurobiologia da Fudan University, Shanghai, China.

1. preparação da solução

Nota: Consulte a tabela de materiais.

1. Preparar o fatiamento buffer (solução do Gey modificado): 92 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH₂PO₄, 30mm NaHCO₃, glicose de 25 mM, 20 mM HEPES, 3mm at⁺-piruvato, 10 mM de MgSO₄e 0,5 mM CaCl₂.
2. Ajuste o pH para 7,6 usando 1 M NaOH, sem carbogenation.
3. Loja reserva em 4 ° C.
   Nota: A titulação esclarece o líquido turvo. A osmolalidade é 305-310 mOsm. A carbogen²¹ contém 5% de dióxido de carbono e 95% de oxigênio.
4. Preparar a aCSF diluindo um 10 x solução stock de aCSF que não contém bicarbonato e glicose, dando uma composição final de: 124 mM NaCl, KCl de 2,5 mM, 2,5 mM CaCl₂, 2 mM MgCl₂e 1,25 mM KH₂PO₄.
5. Adicione o bicarbonato e glicose para atingir 10 mM glicose e 26 mM NaHCO₃.
6. Carbogenate a aCSF através de um tubo de silicone perfurado com um fim bloqueado imediatamente após a adição do NaHCO₃.
7. Medir o pH enquanto carbogenating (pH 7.3-7.4).
   Nota: A capacidade do buffer pode ser ajustada ligeiramente alterando a quantidade de NaHCO₃. Desde que o pH resultante é dependente da temperatura, é necessário verificar o pH resultante enquanto carbogenating à temperatura de trabalho (por exemplo, 30 ° C).

2. preparação de fatias Hippocampal agudas

Nota: Consulte a tabela de materiais.

1. Coloque uma fatia-exploração malha em uma câmara de incubação para fatias de cérebro aguda, encha a câmara com aCSF e carbogenate (4-6 L/h) pelo menos 30 min²² a 28-30 ° C.
2. Legal os instrumentos cirúrgicos até 2-4 ° C.
3. Coloque num copo de vidro cheio de frio e carbogenated cortar o tampão (2-4 ° C), mantido em uma mistura de gelo/água, perto do vibratome.
4. ANESTHETIZE ratos ou camundongos, até os reflexos da córnea desaparecerem (30-50 s) utilizando isoflurano tendo 500 µ l em um frasco de vidro de 2 L ou 12,5 µ l em um tubo de 50 mL.
5. Isolar o cérebro usando um método descrito e visualizadas em detalhe nas publicações de Mathis et al . (2011) ²³ e Yuanxiang et al . (2014) ²⁴.
6. Esfrie o cérebro até 2-4 ° C em um buffer de fatiamento gelado (pelo menos 2 min) antes de dissecar o cerebelo e separar os hemisférios.
7. Use uma lâmina fria para dissecar um pedaço do córtex dorsal em um ângulo de 70° ao longo da borda dorsal de cada hemisfério²⁵ para obter fatias transversais do ventral e a parte intermediária do hipocampo, como mostrado na Figura 1C e E.
8. Com uma espátula de frio cimento dental, transferi um hemisfério para um pedaço de papel de filtro para secar rapidamente a superfície criada (1-2 s).
9. Montar os dois hemisférios com superfícies recém cortadas na plataforma gelada fatia usando colagem adesiva de ação rápida; tem extremidade caudal da face hemisférios a lâmina de barbear (Figura 1D).
10. Coloque a plataforma de corte na câmara de resfriamento de um vibratome e encher a câmara com o buffer de corte (2-4 ° C). Carbogenate usando um tubo de silicone perfurado.
11. Corte 350 µm fatias usando configurações de vibratome adequada (por exemplo, a velocidade para a frente da lâmina: 1,2 mm/s, amplitude da lâmina: 1 mm).
12. Isolar a formação hippocampal do subiculum e os córtices entorhinal usando duas cânulas de injeção (> 28 G) como uma tesoura.
13. Remova as bolhas de malha fatia-exploração da câmara de incubação previamente preparada com uma pipeta Pasteur.
14. Transfira as fatias que têm alguma transparência para o estrato pyramidale da plataforma de corte sobre a malha de câmara úmida. Evite qualquer dobradura, alongamento, sobreposição e flutuante por aspiração aCSF e a fatia para uma pipeta de Pasteur de boca grande.
    Nota: Todo o procedimento (etapa 2.5-2.14) pode levar 5-10 min; Portanto, é importante verificar a temperatura da solução-tampão ao longo do tempo para mantê-la a 4 ° C.
15. Incubar as fatias a 30 ° C, durante pelo menos 1,5 a 2 h em câmara úmida e fornecer carbogen a 4-6 L/h.
    Nota: Ajuste a taxa de fluxo da carbogen para circular o buffer na incubadora, mas impedir que as fatias flutuante.

3. modificações do Carbogenation para a aCSF reciclagem de pequenos reservatórios

1. Adicione um conector de 3 vias do tubo a saída do sistema de reciclagem (Figura 2B).
2. Una o braço meio do conector do tubo de 3 vias com um tubo de alimentação de carbogênio e regular a vazão com um medidor de fluxo de ar (3-4 L/h, Figura 2D e Figura 4C).
3. Adicione um segundo conector de tubo de 3 vias para a entrada do sistema de reciclagem. Una o braço médio ao tubo enfrentando o aquecedor embutido, parte superior do braço para um tubo de silicone fino (10 cm de comprimento) e o braço inferior para o tubo de entrada do reservatório (filtro passa-baixas; Figura 4 C).
4. Coloque um espremedor de tubo em um tubo de silicone fino (OD: 2 mm) em uma posição ao longo do tubo onde a pulsação da aCSF na câmara de fatia, gerada pela bomba peristáltica, é no seu mínimo.
   Nota: A vazão-carbogenation (saída-carb.) modificação reduz a sensibilidade do nível carbogenation para o volume do reservatório de aCSF, a aCSF taxa, de reciclagem e tubo relativo posições dentro aCSF pequenos reservatórios (< 50 mL; A Figura 3). Sobre o filtro passa-baixas, uma certa quantidade de ar no tubo de silicone fino reduz a pulsação do fluxo aCSF; assim, o tubo deve ser preenchido principalmente com ar.

4.Gravação de resposta sináptica em uma câmara de fatia de submersão

Nota: Consulte a tabela de materiais.

1. Pré-aquecer a solução aCSF num banho de água a cerca de 28-30 ° C (isto irá prevenir a formação de bolhas na câmara de gravação).
2. Inicie o sistema de reciclagem (4-5 mL/min) e ativar o aquecedor embutido para equilibrar o sistema pelo menos 1 h.
3. Limpou um pequeno pedaço de papel e uma malha de nylon fixada em um fio de platina em forma de U na câmara de fatia de submersão por alguns minutos (Figura 4) de limpeza da lente.
4. Retire o fio de platina em forma de U.
5. Desligue a reciclagem e coloque uma fatia sobre a papel da limpeza da lente.
6. Imediatamente, coloque a fatia-exploração malha em cima da fatia, ligar a bomba e deixe a fatia equilibrar por 30 min sem mergulhando a aCSF o objetivo.
7. Encha a micropipeta de borosilicato (ou seja, o eletrodo de gravação) com aCSF (resistência de ponta: cheio de 1-2 MΩ, 1/3 com aCSF) e montá-lo no suporte da pipeta.
8. Verifique a isolação do eletrodo estimulação metal, colocando-o em solução de NaHCO₃ (> 40 milímetros). Ligar o eletrodo ao polo negativo de um gerador de tensão DC (V 1-2, o polo positivo: fio de prata ou platina) e observar a formação de bolhas na ponta de um microscópio de dissecação (> 60 x ampliação).
9. Coloque o eletrodo de tungstênio de epóxi-isolados testados de estimulação no suporte de manipulador e a referência de fios da câmara de fatia.
10. Adicionar um segundo eletrodo de referência para a câmara e ligue-o à tomada de referência do headstage do eletrodo gravação(Figura 4).
11. No software de controle do amplificador, clique na caixa "modo zero braçadeira" e prossiga clicando duas vezes a caixa "lista de ganho de saída". Escolher um ganho de "100", clique duas vezes em "high pass filtro caixa de listagem (Bessel)," escolher "0,1 Hz" e clique duas vezes em "low pass filtro caixa de listagem (AC)" para escolher "3 kHz."
12. No software de gravação, clique em "adquirir | Abrir protocolo." Escolha um protocolo que possui configurações permitindo estímulos episódicos e a digitalização dos potenciais amplificados em 10-20 kHz para 50-100 ms e que automaticamente aciona um isolador de estímulo 10 ms após o início de uma gravação de episódica.
13. Coloque a estimulação e eletrodos de gravação em linha e em paralelo para o estrato pyramidale, por exemplo (Figura 4B e Figura 5).
14. Clique em "adquirir | Editar o protocolo"e escolha o separador"gatilho"(na janela pop-up). Clique sobre a caixa "fonte de gatilho" e escolha "barra de espaço", como a fonte de gatilho. Clique no botão "Okey". Clique no botão "gravar" para iniciar a aquisição e observe a janela pop-up com um botão de disparo.
15. No software do isolador de estímulo, clique na caixa "controle de tensão" e digite "0". Clique no botão "download". Clique na janela do "software de gravação" e pressione a barra de espaço. Repita este ciclo por sequencialmente inserindo valores de 1 a 8, por exemplo, em etapas de mV 1 na caixa "controle de tensão".
16. Correlacionar a força de estimulação com valores fEPSP-inclinação e determinar a intensidade do estímulo necessária para chegar a 40% da fEPSP-inclinação máxima. Clique na caixa de controle"tensão" e digite o valor determinado. Clique no botão "download".
    Nota: Um isolador de estímulo é usado para aplicar tensão breve ou pulsos de corrente ao tecido cerebral. Os pulsos de bifásico podem ter 100 µs por fase.
17. O software de gravação, clique no botão parar e, em seguida, no menu de "Adquirir". Clique em "Editar o protocolo" e escolhe a aba de "gatilho" na janela pop-up. Clique na caixa fonte de gatilho e escolheu o "timer interno" como fonte de gatilho. Clique no botão "Okey". Clique no botão gravar que inicia a gravação automática dos potenciais de campo cada 30 s, por exemplo. Clique no botão "stop" após 30-60 min.
18. Clique no menu "Adquirir", clique em "Protocolo aberto", escolha o protocolo de indução desejada de plasticidade sináptica e clique no botão "Okey". Clique no botão "gravar" para ativar automaticamente a estimulação de alta frequência e gravação. Clique no botão "stop".
    Nota: No caso de estudos relativos a plasticidade sináptica, aplica um dos paradigmas para a potenciação de longa duração ou depressão a longo prazo após a gravação de base prolongada indução padrão. Exemplos representativos de modulação resultante da transmissão sináptica estão representados na Figura 7 e Figura 8.
19. O software de gravação, clique em "adquirir | Abra o protocolo"e escolha o mesmo protocolo como na etapa 4.12. Clique no botão "Okey" e clique em "record". Mantenha automaticamente executando as gravações de campo potencial para 2-4 h, por exemplo. Clique no botão "stop" para finalizar a gravação.
20. No caso de estudos farmacêuticos, aplicar o composto diretamente para a aCSF reservatório se permanente administração composta é desejado (Figura 6).

5. a instalação e dicas de limpeza

Nota: Veja abaixo dicas gerais.

1. Limpar o sistema semanalmente por reciclagem 10% H₂O₂ por não mais de 20 min, seguido por lavagem com desionizada H₂O.
   Nota: O etanol não é recomendado para a limpeza. Da mesma forma não é recomendável para imergir os fios de referência e o objetivo em H₂O₂.
2. Remova o sal precipitado na superfície da lente objetiva ou arredores de câmara com 0.1 N HCl e, em seguida, a água.
3. Lave o borbulhador carbogen em água destilada ou 0.1 N HCl.
4. Mergulhe a câmara de incubação fatia em 10% H₂O₂ por 5 min uma vez por semana e em seguida, enxaguar cuidadosamente a incubadora com desionizada H₂O.
5. No caso de eletrodos de estimulação metal, lave a ponta do eletrodo estimulante com água desionizada após cada experimento e Limpe suavemente a ponta do eletrodo estimulante com uma bola de algodão embebida em álcool para remover o tecido residual.
6. Reduza a resistência de eletrodos de estimulação metal comercial removendo o isolamento na ponta através de um golpe cuidado com lixa.
7. Reduza a perda de carbogênio do aCSF enquanto reciclagem através dos tubos, substituindo os tubos de silicone com tubos de politetrafluoretileno.
8. Mantenha os fios de prata da gravação de eletrodo e eletrodo de referência em lixívia por vários dias para formar AgCl na superfície do fio.

Resultados

Na seção de protocolo, descrevemos a preparação de fatias hippocampal agudas da parte ventral e intermediário da formação hippocampal (Figura 1) de camundongos C57BL/6 machos e ratos machos Wistar (5-8 semanas). A posição dos hemisférios na plataforma de segmentação de dados ajuda a mantê-los estáveis e remove a necessidade de estabilização com ágar-ágar ou agarose. O próprio sistema de perfusão é baseado em uma bomba peristáltica, opera...

Discussão

Apesar de câmaras de fatia de interface apresentam mais robusta resposta sináptica^25,26,,^27,28, câmaras de submersão fornecem conveniência adicional para gravação de remendo-braçadeira e fluorescência imagem latente. Assim, descrevemos vários aspectos potenciais de gravações de campo em fatias hippocampal agudas utilizando uma câmara de fatia de submersão comercial que pode ser fa...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents required
NaCl	Sinopharm Chemical Reagent, China	10019318
KCl	Sinopharm Chemical Reagent, China	10016318
KH2PO4	Sinopharm Chemical Reagent, China	10017618
MgCl2·6H2O	Sinopharm Chemical Reagent, China	10012818
CaCl2	Sinopharm Chemical Reagent, China	10005861
NaHCO3	Sinopharm Chemical Reagent, China	10018960
Glucose	Sinopharm Chemical Reagent, China	10010518
NaH2PO4	Sinopharm Chemical Reagent, China	20040718
HEPES	Sigma	H3375
Sodium pyruvate	Sigma	A4043
MgSO4	Sinopharm Chemical Reagent, China	20025118
NaOH	Sinopharm Chemical Reagent, China	10019718
Tools and materials for dissection
Decapitators	Harvard apparatus	55-0012	for rat decapitation
Bandage Scissors	SCHREIBER	12-4227	for mouse decapitation
double-edge blade	Flying Eagle, China	74-C
IRIS Scissors	RWD, China	S12003-09
Bone Rongeurs	RWD, China	S22002-14
Spoon	Hammacher	HSN 152-13
dental cement spatula	Hammacher	HSN 016-15
dental double end excavator	Blacksmith Surgical, USA	BS-415-017
Vibrating Microtome	Leica, Germany	VT1200S
surgical blade	RWD, China	S31023-02
surgical holder	RWD, China	S32007-14
Electrophysiology equipment and materials
Vertical Pipette Puller	Narishige, Japan	PC-10
Vibration isolation table	Meirits, Japan	ADZ-A0806
submerged type recording chamber	Warner Instruments	RC-26GLP
4 Axis Micromanipulator	Sutter, USA	MP-285, MP-225
Platinum Wire	World Precision Instruments	PTP406
Amplifier	Molecular Devices, USA	Multiclamp 700B
Data Acquisition System	Molecular Devices, USA	Digidata 1440A
Anaysis software	Molecular Devices, USA	Clampex 10.2
Fluorescence Microscope	Nikon, Japan	FN1
LED light source	Lumen Dynamics Group, Canada	X-cite 120LED
micropipettes	Harvard apparatus	GC150TF	extracelluar recording
borosilicate micropipettes	Sutter, USA	BF150-86	patch clamp
tungsten electrode	A-M Systems, USA	575500
peristaltic pump	Longer, China	BT00-300T
tubes for peristaltic pump	ISMATEC, Wertheim, Germany	SC0309	1x inflow, ID: 1.02 mm
tubes for peristaltic pump	ISMATEC, Wertheim, Germany	SC0319	2x tubes for outflow, ID: 2.79 mm
CCD camera	PCO, Germany	pco.edge sCMOS
lens cleaning paper	Kodak
50 mL conical centrifuge tube	Thermo scientific	339652
Prechamber	Warner Instruments	BSC-PC
Inline heater	Warner Instruments	SF-28
Temperature Controller	Warner Instruments	TC-324B