Enregistrement de la plasticité synaptique dans des tranches d’hippocampe aiguës maintenues dans un petit volume recyclage - Perfusion- et système de chambre de Submersion-type

Résumé

Ce protocole décrit la stabilisation du niveau d’oxygène dans un petit volume de tampon recyclé et aspects méthodologiques de la plasticité synaptique activité dépendante d’enregistrement dans des tranches d’hippocampe aiguës immergés.

Résumé

Même si les expériences sur des tranches de cerveau ont été utilisés depuis 1951, problèmes subsistent qui réduisent la probabilité de réaliser une analyse stable et réussie de la modulation de la transmission synaptique lors d’enregistrements intracellulaires ou potentiel sur le terrain. Ce manuscrit décrit des aspects méthodologiques qui peuvent être utiles à l’amélioration des conditions expérimentales pour l’entretien des tranches de cerveau aiguë et d’enregistrement des potentiels postsynaptiques excitateurs de champ dans une chambre de disponible dans le commerce de l’immersion avec une unité de sortie-carbogenation. La sortie-carbogenation aide à stabiliser le niveau d’oxygène dans les expériences qui s’appuient sur le recyclage d’un réservoir tampon petit pour améliorer le rapport coût-efficacité des expériences de la drogue. En outre, le manuscrit présente des expériences représentatives qui examinent les effets de modes différents carbogenation et paradigmes de la stimulation sur l’activité dépendante de la plasticité synaptique de la transmission synaptique.

Introduction

En 1951, les expériences de tranche cérébrale aiguë première signalés étaient menées¹. En 1971, après avoir réussi in vitro des enregistrements de piriform cortex^2,3 et la découverte que les neurones de l’hippocampe sont interconnectés transversalement le long de l’axe de septotemporal de l’hippocampe⁴, un de la premiers enregistrements in vitro de l’activité neuronale hippocampique a atteint⁵. La similitude des paramètres neurophysiologiques ou neurostructural de neurones dans des conditions in vivo et in vitro sont toujours l’objet d’un débat⁶, mais en 1975, Schwartzkroin⁷ a indiqué que la basale Propriétés des neurones sont maintenues in vitro et cette stimulation haute fréquence (c.-à-d., tétanisation) des afférents à la formation hippocampique induit une facilitation de longue durée des potentiels synaptiques⁸. Enregistrement de l’activité neuronale électrophysiologiques in vitro considérablement élargi l’étude des mécanismes cellulaires de la plasticité synaptique activité dépendante^9,10, qui avait été découvert en 1973 par Bliss et al. ¹¹ in vivo des expériences avec les lapins.

L’étude de l’activité neuronale ou tranches de cerveau, en particulier dans des tranches d’hippocampe aiguës, les voies de signalisation est maintenant un outil standard. Cependant, étonnamment, des expériences in vitro doivent encore être normalisées, comme en témoignent les multiples approches qui existent encore pour la préparation et l’entretien des tranches d’hippocampe aiguës. Reid et al. (1988) ¹² a examiné les défis méthodologiques pour l’entretien des tranches de cerveau aiguë dans différents types de chambres de tranche et les choix de niveau moyen, pH, température et oxygène de baignade. Ces paramètres sont encore difficiles à contrôler dans la chambre d’enregistrement en raison des éléments sur mesure de in vitro tranche-enregistrement des configurations. Publications peuvent être consultées qu’aide à surmonter les défis méthodologiques et qui décrive nouveaux types de chambres de tranche de submersion, comme un interstitiel microperfusion 3D système¹³, une chambre avec une hotte à flux laminaire et oxygène fournir un système multichambre enregistrement¹⁶¹⁴et un système de contrôle informatisé température¹⁵. Étant donné que ces chambres ne sont pas faciles à construire, la plupart des scientifiques s’appuient sur chambres tranche disponible dans le commerce. Ces chambres peuvent être montés sur un système de microscope, ce qui permet la combinaison d’électrophysiologie et de fluorescence imaging^17,18,19. Étant donné que ces chambres de garder les tranches de cerveau immergés dans le liquide céphalorachidien artificiel (aCSF), un débit élevé de la solution tampon doit être maintenue, augmentant les frais de demande de drogue. À cette fin, nous avons incorporé un système de perfusion recyclage avec écoulement-carbogenation qui offre une stabilité suffisante pour l’enregistrement de longue durée des potentiels de champ dans une chambre de tranche de submersion à l’aide d’un volume relativement petit fsca. En outre, nous avons résumé comment l’utilisation de ce système expérimental carbogenation/perfusion affecte le résultat de l’activité-dépendant de la plasticité synaptique¹⁰ et comment l’inhibition de l’élongation eucaryote facteur-2 kinase (eEF2K) module synaptique transmission²⁰.

Protocole

Les animaux ont été maintenus selon les normes établies de protection des animaux et les procédures des instituts des sciences cérébrales et état clé laboratoire de médecine neurobiologie de Fudan University, Shanghai, Chine.

1. préparation de la solution

Remarque : Consultez la Table des matières.

1. Préparer le tranchage tampon (solution de mis à jour le Gey) : 92 mM NaCl, KCl, 1,25 mM NaH₂PO₄, 30 mM NaHCO₃, 2,5 mM glucose 25 mM, 20 mM HEPES, 3 mM Na⁺-pyruvate et 10 mM MgSO₄0,5 mM CaCl₂.
2. Ajuster le pH à 7,6 à l’aide de 1 NaOH M sans carbogenation.
3. Stocker le tampon à 4 ° C.
   Remarque : Le titrage clarifie le liquide trouble. L’osmolalité est 305-310 mOsm. La carbogen²¹ contient 5 % de dioxyde de carbone et 95 % d’oxygène.
4. Préparer le FSCA en diluant un 10 x solution de réserve du FSCA qui ne contient-elle pas de bicarbonate et glucose, ce qui donne une composition finale de : 124 mM NaCl, KCl 2,5 mM, 2,5 mM CaCl₂, 2 mM MgCl₂et 1,25 mM KH₂PO₄.
5. Ajouter le bicarbonate et le glucose pour atteindre 10 mM glucose et 26 mM NaHCO₃.
6. Carbogenate l’aCSF à travers un tube de silicone perforée avec une fin bloqué immédiatement après l’ajout du NaHCO₃.
7. Mesurer le pH tandis que carbogenating (pH 7,3 à 7,4).
   Remarque : La capacité de la mémoire tampon peut être ajustée légèrement en modifiant la quantité de NaHCO₃. Étant donné que le pH qui en résulte est dépendante de la température, il est nécessaire de vérifier le pH qui en résulte tout en carbogenating à la température de travail (par exemple, 30 ° C).

2. préparation de tranches d’hippocampe aiguës

Remarque : Consultez la Table des matières.

1. Placez un maillage tenue de tranche dans une chambre d’incubation pour obtenir des tranches cérébrale aiguë, emplit la chambre FSCA et carbogenate (4-6 L/h) au moins 30 min²² à 28-30 ° C.
2. Refroidir les instruments chirurgicaux jusqu'à 2-4 ° C.
3. Placer un bécher en verre rempli de froid et carbogenated tampon (2-4 ° C), maintenu dans un mélange d’eau et de glace, près le vibratome de tranchage.
4. Anesthésier des rats ou des souris jusqu'à ce que les réflexes cornéens disparaissent (30-50 s) l’isoflurane en prenant 500 µL dans un bocal de verre de 2 L ou 12,5 µL dans un tube de 50 mL.
5. Isoler le cerveau à l’aide d’une méthode décrite et visualisées en détail dans les publications de Mathis et al. (2011) ²³ et Yuanxiang et al. (2014) ²⁴.
6. Refroidir le cerveau jusqu'à 2-4 ° C dans un tampon de tranchage glacé (pendant au moins 2 min) avant de disséquer le cervelet et séparant les hémisphères.
7. Utilisez une lame chirurgicale froide pour disséquer un morceau du cortex dorsal à un angle de 70° sur le bord dorsal de chaque hémisphère²⁵ pour obtenir des tranches transversales de la ventrale et la partie intermédiaire de l’hippocampe, comme illustré à la Figure 1C et E.
8. Avec une spatule de ciment dentaire froid, transmettre un hémisphère à un morceau de papier filtre brièvement sécher la surface créée (1-2 s).
9. Monter les deux hémisphères avec surfaces fraîchement coupées sur la plate-forme de tranchage glacée à l’aide de colle à action rapide ; a l’extrémité caudale du visage hémisphères la lame de rasoir (Figure 1D).
10. Placez la plateforme tranchage dans la chambre de refroidissement d’un vibratome et remplir cette chambre avec le tampon de tranchage (2-4 ° C). Carbogenate à l’aide d’un tube de silicone perforé.
11. Couper 350 µm tranches à l’aide de paramètres vibratome adéquat (par exemple, vitesse d’avancement lame : 1,2 mm/s, amplitude de la lame : 1 mm).
12. Isoler la formation hippocampique du subiculum et le cortex entorhinal, à l’aide de deux canules d’injection (> 28 G) comme des ciseaux.
13. Retirer les bulles de la maille de tranche-tenue de la chambre d’incubation préalablement préparée à l’aide d’une pipette Pasteur.
14. Transférer les tranches qui ont une transparence à la pyramidale de la strate de la plate-forme de tranchage sur le maillage de la chambre d’incubation. Éviter tout pliage, étirements, qui se chevauchent et flottant en aspirant le FSCA et la tranche dans une pipette Pasteur de grande bouche.
    Remarque : L’ensemble de la procédure (étape 2.5-2.14) peut prendre 5-10 min ; par conséquent, il est important de vérifier la température de la solution tampon au fil du temps à le maintenir à 4 ° C.
15. Incuber les tranches à 30 ° C pendant au moins 1,5 à 2 h dans la chambre d’incubation et de fournir des carbogen pour 4-6 L/h.
    Remarque : Réglez la vitesse d’écoulement de la carbogen à faire circuler la mémoire tampon dans l’incubateur, mais éviter les tranches flottantes.

3. les modifications de la Carbogenation pour le FSCA recyclage de petits réservoirs

1. Ajouter un connecteur 3 voies tube à la sortie du système recyclage (Figure 2B).
2. Connecter le bras central du connecteur 3 voies tube avec un tube d’alimentation de carbogen et de réguler le débit avec un compteur de débit d’air (3-4 L/h, Figure 2D et Figure 4C).
3. Ajouter un second connecteur de tube de 3 voies à l’entrée du système de recyclage. Connecter le bras moyen au tube face à l’appareil de chauffage en ligne, le haut du bras dans un tube mince de silicium (10 cm de longueur) et le bras inférieur dans le tube d’entrée du réservoir (filtre passe-bas ; Figure 4 ( C).
4. Placer un presse-citron tube sur un tube de silicium mince (OD : 2 mm) à une position le long du tube où la pulsation de l’aCSF dans la chambre de tranche, produite par la pompe péristaltique, est à son minimum.
   Remarque : L’exode-carbogenation (sortie-carb.) modification réduit la sensibilité du niveau carbogenation au volume du réservoir aCSF, le FSCA taux, de recyclage et tube relative des postes au sein de l’aCSF petits réservoirs (< 50 mL ; La figure 3). Concernant le filtre passe-bas, une certaine quantité d’air dans le tube en silicone mince réduit la pulsation de l’écoulement de l’aCSF ; ainsi, le tube doit être rempli pour la plupart à l’air.

4.Enregistrement des réponses synaptiques dans une chambre de tranche de Submersion

Remarque : Consultez la Table des matières.

1. Réchauffez la solution FSCA dans un bain d’eau à environ 28-30 ° C (cela permettra d’éviter la formation de bulles dans la chambre d’enregistrement).
2. Démarrer le système de recyclage (4 à 5 mL/min) et activer le chauffage inline pour équilibrer le système pendant au moins 1 h.
3. Faire tremper un petit morceau de papier et une maille en nylon fixés sur un fil de platine en forme de U dans la chambre de tranche de submersion pendant quelques minutes (Figure 4) de nettoyage pour lentilles.
4. Enlever le fil de platine en forme de U.
5. Eteignez le recyclage et déposer une tranche sur le papier de nettoyage pour lentilles.
6. Placer immédiatement le maillage tenue de tranche sur le dessus de la tranche, mettre en marche la pompe et laisser la tranche équilibrer pendant 30 min sans plongeant l’objectif dans le fsca.
7. Remplir la micropipette de borosilicate (c.-à-d., l’électrode d’enregistrement) avec aCSF (Astuce de résistance : rempli de MΩ 1-2, 1/3 avec aCSF) et fixez-le dans le porte-pipette.
8. Vérifier l’isolation de l’électrode de stimulation métal en le plaçant dans NaHCO₃ solution (> 40 mM). Connecter l’électrode au pôle négatif d’un générateur de tension DC (1-2 V, pôle positif : fil d’argent ou de platine) et d’observer la formation de bulles à la pointe sous le microscope à dissection (> grossissement x 60).
9. La référence fils dans la chambre de tranche et placer l’électrode de stimulation de tungstène d’isolation époxy testés dans le support de manipulateur.
10. Ajouter une deuxième électrode de référence à la chambre et branchez-le sur la prise de référence de la tête de l’électrode d’enregistrement (Figure 4A).
11. Dans le logiciel de commande d’amplificateur, cliquez sur la case « mode zéro pince » et procéder en double-cliquant sur la case « liste de gain de sortie ». Choisir un gain de « 100 », double-cliquez sur la « passe-haut filtre zone de liste (Bessel), » choisissez « 0,1 Hz », puis double-cliquez sur la « passe-bas filtre zone de liste (AC) » pour choisir « 3kHz. »
12. Dans le logiciel d’enregistrement, cliquez sur le sur « Acquire | Ouvrir le protocole ». Choisissez un protocole qui dispose de paramètres permettant de stimulations épisodiques et la numérisation des potentiels amplifiés à 10-20 kHz pour 50 à 100 ms et qui déclenche automatiquement un isolateur stimulus 10 ms après le début d’un enregistrement épisodique.
13. Placez la stimulation et les électrodes d’enregistrement en ligne, parallèlement à la strate pyramidale, par exemple (Figure 4B et 5).
14. Cliquez sur « acquérir | Modifier le protocole » et choisissez l’onglet « déclencheur » (dans la fenêtre pop-up). Cliquez sur la case « source de détente » et choisissez « barre d’espace » comme la source de commande. Cliquez sur le bouton « OK ». Cliquez sur le bouton « enregistrer » pour démarrer l’acquisition et de noter la fenêtre pop-up avec un bouton de déclenchement.
15. Dans le logiciel d’isolateur stimulus, cliquez sur la case « contrôle de la tension » et inscrivez « 0 ». Cliquez sur le bouton « Télécharger ». Cliquez sur la fenêtre « logiciel d’enregistrement », puis appuyez sur la barre d’espace. Répétez ce cycle en saisissant séquentiellement des valeurs de 1 à 8, par exemple, à 1 pas de mV dans la boîte de « contrôle de la tension ».
16. La force de stimulation en corrélation avec les valeurs de fEPSP-pente et déterminer l’intensité de stimulation nécessaire pour obtenir 40 % de la fEPSP-pente maximale. Cliquez sur la « boîte de contrôle de la tension » et entrez la valeur déterminée. Cliquez sur le bouton « Télécharger ».
    Remarque : Un isolateur stimulus sert à appliquer la tension brève ou des impulsions de courant aux tissus du cerveau. Les impulsions biphasiques peuvent avoir 100 µs par phase.
17. Dans le logiciel d’enregistrement, cliquez sur le bouton arrêter, puis le menu « Acquérir ». Cliquez sur « Modifier le protocole » et choisissez l’onglet « déclencheur » dans la fenêtre pop-up. Cliquez sur la zone source de détente et a choisi le « horloge interne » comme la source de commande. Cliquez sur le bouton « OK ». Cliquez sur le bouton d’enregistrement qui commence l’enregistrement automatique des potentiels de champ toutes les 30 s, par exemple. Cliquez sur le bouton « stop » après 30 à 60 min.
18. Cliquez sur le menu « Acquérir », cliquez sur « Open Protocol », choisissez le protocole désiré de l’induction de la plasticité synaptique et cliquez sur le bouton « OK ». Cliquez sur le bouton « enregistrer » pour activer automatiquement la stimulation haute fréquence et l’enregistrement. Cliquez sur le bouton « stop ».
    Remarque : Dans le cas d’études relatives à la plasticité synaptique, appliquer un des paradigmes induction standard pour la potentialisation à long terme ou à long terme dépression après l’enregistrement de base prolongée. Des exemples représentatifs de la modulation résultante de la transmission synaptique sont illustrés dans la Figure 7 et Figure 8.
19. Dans le logiciel d’enregistrement, cliquez sur « Acquire | Ouvrir le protocole » et choisissez le même protocole comme au point 4.12. Cliquez sur le bouton « OK », puis cliquez sur « Enregistrer ». Garder d’exécuter automatiquement les enregistrements de domaine potentiels pour 2-4 h, par exemple. Cliquez sur le bouton « stop » pour terminer l’enregistrement.
20. Dans le cas d’études pharmaceutiques, appliquer la pâte directement le FSCA réservoir si l’administration permanente composée est souhaitée (Figure 6).

5. nettoyage de l’installation et conseils

Remarque : Voir ci-dessous pour obtenir des conseils généraux.

1. Nettoyer le système chaque semaine en recyclant 10 % H₂O₂ pendant pas plus de 20 min, lavé avec désionisée H₂O.
   Remarque : L’éthanol n’est pas recommandé pour le nettoyage. De même, il n’est pas recommandé de plonger l’objectif en H₂O₂et les fils de référence.
2. Supprimer le sel précipité sur la surface de la lentille de l’objectif ou les environs de chambre avec 0,1 N HCl et ensuite de l’eau.
3. Laver le barboteur de carbogen dans l’eau distillée ou 0,1 N HCl.
4. Plonger la chambre d’incubation tranche à 10 % H₂O₂ pendant 5 minutes une fois par semaine et puis bien rincer la chambre d’incubation avec désionisée H₂O.
5. Dans le cas d’électrodes de stimulation metal, rincez l’électrode stimulant avec de l’eau désionisée après chaque expérience et essuyer doucement la pointe de l’électrode de stimulation avec un tampon d’ouate imbibé de l’éthanol pour éliminer le tissu résiduel.
6. Réduire la résistance des électrodes de stimulation métal commercial en enlevant l’isolation à la pointe grâce à un coup soigneusement avec papier de verre.
7. Réduire la perte de carbogen de l’aCSF tout en recyclage à travers les tubes de remplacement des tubes de silicium avec des tubes de polytétrafluoroéthylène.
8. Garder les fils d’argent de l’électrode de l’enregistrement et l’électrode de référence à l’eau de Javel pendant plusieurs jours à AgCl se forment à la surface de fil.

Résultats

Dans la section protocole, nous décrit la préparation de tranches d’hippocampe aiguës de la partie ventrale et intermédiaire de la formation hippocampique (Figure 1) de souris C57BL/6 mâles et des rats Wistar mâles (5-8 semaines). La position des hémisphères sur la plate-forme de trancheuse contribue à garder stable et supprime la nécessité de stabilisation avec la gélose ou d’agarose. Le système de perfusion lui-même est basé sur une pompe...

Discussion

Bien que les chambres tranche interface pièce plus robuste réponses synaptiques^25,26,27,28, chambres de submersion assurent un confort supplémentaire pour l’enregistrement patch-clamp et fluorescence d’imagerie. Ainsi, nous avons décrit plusieurs aspects d’enregistrements possibles sur le terrain dans des tranches d’hippocampe aiguës en utilisant une chambre de tranche de submersio...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents required
NaCl	Sinopharm Chemical Reagent, China	10019318
KCl	Sinopharm Chemical Reagent, China	10016318
KH2PO4	Sinopharm Chemical Reagent, China	10017618
MgCl2·6H2O	Sinopharm Chemical Reagent, China	10012818
CaCl2	Sinopharm Chemical Reagent, China	10005861
NaHCO3	Sinopharm Chemical Reagent, China	10018960
Glucose	Sinopharm Chemical Reagent, China	10010518
NaH2PO4	Sinopharm Chemical Reagent, China	20040718
HEPES	Sigma	H3375
Sodium pyruvate	Sigma	A4043
MgSO4	Sinopharm Chemical Reagent, China	20025118
NaOH	Sinopharm Chemical Reagent, China	10019718
Tools and materials for dissection
Decapitators	Harvard apparatus	55-0012	for rat decapitation
Bandage Scissors	SCHREIBER	12-4227	for mouse decapitation
double-edge blade	Flying Eagle, China	74-C
IRIS Scissors	RWD, China	S12003-09
Bone Rongeurs	RWD, China	S22002-14
Spoon	Hammacher	HSN 152-13
dental cement spatula	Hammacher	HSN 016-15
dental double end excavator	Blacksmith Surgical, USA	BS-415-017
Vibrating Microtome	Leica, Germany	VT1200S
surgical blade	RWD, China	S31023-02
surgical holder	RWD, China	S32007-14
Electrophysiology equipment and materials
Vertical Pipette Puller	Narishige, Japan	PC-10
Vibration isolation table	Meirits, Japan	ADZ-A0806
submerged type recording chamber	Warner Instruments	RC-26GLP
4 Axis Micromanipulator	Sutter, USA	MP-285, MP-225
Platinum Wire	World Precision Instruments	PTP406
Amplifier	Molecular Devices, USA	Multiclamp 700B
Data Acquisition System	Molecular Devices, USA	Digidata 1440A
Anaysis software	Molecular Devices, USA	Clampex 10.2
Fluorescence Microscope	Nikon, Japan	FN1
LED light source	Lumen Dynamics Group, Canada	X-cite 120LED
micropipettes	Harvard apparatus	GC150TF	extracelluar recording
borosilicate micropipettes	Sutter, USA	BF150-86	patch clamp
tungsten electrode	A-M Systems, USA	575500
peristaltic pump	Longer, China	BT00-300T
tubes for peristaltic pump	ISMATEC, Wertheim, Germany	SC0309	1x inflow, ID: 1.02 mm
tubes for peristaltic pump	ISMATEC, Wertheim, Germany	SC0319	2x tubes for outflow, ID: 2.79 mm
CCD camera	PCO, Germany	pco.edge sCMOS
lens cleaning paper	Kodak
50 mL conical centrifuge tube	Thermo scientific	339652
Prechamber	Warner Instruments	BSC-PC
Inline heater	Warner Instruments	SF-28
Temperature Controller	Warner Instruments	TC-324B