Registrazione di plasticità sinaptica in fettine ippocampali Acute mantenuti in un piccolo volume riciclaggio - aspersione- e sistema di immersione-tipo camera

Riepilogo

Questo protocollo descrive la stabilizzazione del livello di ossigeno in un piccolo volume di tampone riciclato e aspetti metodologici della plasticità sinaptica attività-dipendente di registrazione in fettine ippocampali acute sommersi.

Abstract

Anche se gli esperimenti su fettine di cervello sono stati in uso fin dal 1951, permangono problemi che riducono la probabilità di realizzare un'analisi stabile e di successo della modulazione della trasmissione sinaptica durante l'esecuzione di registrazioni sul campo potenziale o intracellulare. Questo manoscritto descrive aspetti metodologici che potrebbero essere utili nel migliorare le condizioni sperimentali per la manutenzione delle fette del cervello acuto e per la registrazione di potenziali postsinaptici eccitatori di campo in una camera di immersione disponibili in commercio con un'unità di deflusso-carbogenation. Il deflusso-carbogenation aiuta a stabilizzare il livello di ossigeno negli esperimenti che si basano sul riciclaggio di un serbatoio di buffer di piccole dimensioni per migliorare l'efficienza dei costi degli esperimenti di droga. Inoltre, il manoscritto presenta esperimenti rappresentativi che esaminano gli effetti di carbogenation diverse modalità e paradigmi di stimolazione sulla plasticità sinaptica attività-dipendente della trasmissione sinaptica.

Introduzione

Nel 1951, gli esperimenti di fetta di primo-ha segnalato il cervello acuto erano condotti¹. Nel 1971, dopo il successo in vitro registrazioni da piriform corteccia^2,3 e la scoperta che i neuroni hippocampal sono interconnessi trasversalmente lungo l'asse di septotemporal di ippocampo⁴, uno del prime registrazioni in vitro dell'attività di un neurone hippocampal era raggiunto⁵. La somiglianza dei parametri neurofisiologici o neurostructural dei neuroni in condizioni in vivo e in vitro sono ancora oggetto di qualche dibattito⁶, ma nel 1975, Schwartzkroin⁷ ha indicato che il basale Proprietà dei neuroni vengono mantenuti in vitro e che la stimolazione ad alta frequenza (cioè, tetanization) delle afferenze nella formazione hippocampal induce una facilitazione di lunga durata di potenziali sinaptici⁸. Elettrofisiologici registrazione dell'attività neuronale in vitro notevolmente ampliato lo studio dei meccanismi cellulari di plasticità sinaptica attività-dipendente^9,10, che era stata scoperta nel 1973 da Bliss et al. ¹¹ in vivo gli esperimenti con i conigli.

Lo studio di attività neuronale o segnalazione percorsi nelle fette del cervello e soprattutto in fettine ippocampali acute, è ora uno strumento standard. Tuttavia, sorprendentemente, gli esperimenti in vitro hanno ancora essere standardizzati, come testimoniano i diversi approcci che ancora esistono per la preparazione e la manutenzione di fettine ippocampali acute. Reid et al. (1988) ¹² recensione le sfide metodologiche per la manutenzione delle fettine di cervello acuto in diversi tipi di fetta alloggiamenti e le scelte di livello medio, pH, temperatura e ossigeno di balneazione. Questi parametri sono ancora difficili da controllare nella camera di registrazione a causa di elementi su misura in vitro fetta-registrazione Setup. Pubblicazioni possono essere trovati che potrebbe contribuire a superare alcune delle sfide metodologiche e che descrivono nuovi tipi di alloggiamenti di fetta di sommersione, come un sistema interstiziale 3D microperfusion¹³, una camera con maggiore flusso laminare e ossigeno fornire un sistema di registrazione multi-camera¹⁶, un sistema con controllo di temperatura computerizzato¹⁵e¹⁴. Dal momento che queste camere non sono facili da costruire, maggior parte degli scienziati si basano su chambers fetta commercialmente disponibili. Questi alloggiamenti possono essere montati su un sistema di microscopio, consentendo in tal modo la combinazione di elettrofisiologia e fluorescenza imaging^17,18,19. Poiché questi alloggiamenti mantenere le fette di cervello immerse in liquido cerebrospinale artificiale (aCSF), un'alta portata della soluzione tampone deve essere mantenuto, aumentando la spesa dell'applicazione della droga. A tal fine, abbiamo incorporato un sistema di perfusione riciclaggio con deflusso-carbogenation che fornisce una stabilità sufficiente per la registrazione a lungo termine dei potenziali di campo in una camera di fetta di sommersione usando un volume relativamente piccolo aCSF. Inoltre, abbiamo riassunto come l'uso di questo sistema sperimentale carbogenation/aspersione influenza il risultato della plasticità sinaptica attività-dipendente¹⁰ e come inibizione della chinasi di allungamento eucariotico factor-2 (eEF2K) modula sinaptica trasmissione²⁰.

Protocollo

Gli animali sono stati mantenuti in conformità con le norme stabilite di cura degli animali e le procedure dei istituti di scienza del cervello e stato chiave laboratorio di medici Neurobiologia della Fudan University, Shanghai, Cina.

1. soluzione preparazione

Nota: Vedere la tabella dei materiali.

1. Preparare il tampone per affettare (soluzione di Gey modificate): 92 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1,25 mM NaH₂PO₄, 30 mM NaHCO₃, glucosio di 25 mM, 20 mM HEPES, 3mm Na⁺-piruvato, 10mm MgSO₄e 0,5 mM CaCl₂.
2. Regolare il pH a 7,6 utilizzando 1 M NaOH senza carbogenation.
3. Conservare il tampone a 4 ° C.
   Nota: La titolazione chiarisce il liquido torbido. L'osmolalità è 305-310 mOsm. Il carbogen²¹ contiene 5% di anidride carbonica e il 95% di ossigeno.
4. Preparare il aCSF diluendo un 10 x soluzione madre di aCSF che non contiene bicarbonato e glucosio, dando una composizione finale di: 124 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 2,5 mM CaCl₂, 2mm MgCl₂e 1,25 mM KH₂PO₄.
5. Aggiungere il bicarbonato e glucosio per raggiungere 10 mM glucosio e 26mm NaHCO₃.
6. Carbogenate aCSF attraverso un tubo di silicone perforato con un fine bloccato immediatamente dopo l'aggiunta di NaHCO₃.
7. Misurare il pH mentre carbogenating (pH 7,3-7,4).
   Nota: La capacità di buffer può essere regolato leggermente alterando la quantità di NaHCO₃. Poiché il pH risultante è temperatura-dipendente, è necessario controllare il pH risultante mentre carbogenating alla temperatura di esercizio (ad es., 30 ° C).

2. preparazione di fettine ippocampali Acute

Nota: Vedere la tabella dei materiali.

1. Posizionare una mesh di fetta-tenuta in una camera di incubazione per fette del cervello acuto, riempire la camera con aCSF e carbogenate (4-6 L/h) per almeno 30 min²² a 28-30 ° C.
2. Raffreddare gli strumenti chirurgici fino a 2-4 ° C.
3. Posizionare un bicchiere di vetro riempito con carbogenated affettare buffer (2-4 ° C), mantenuto in una miscela di ghiaccio/acqua, nei pressi del vibratome e fredda.
4. Anestetizzare ratti o topi fino a far scompaiono i riflessi corneali (30-50 s) utilizzando isoflurano prendendo 500 µ l in un barattolo di vetro 2L o 12,5 µ l in un tubo da 50 mL.
5. Isolare il cervello utilizzando un metodo descritto e visualizzato in dettaglio nelle pubblicazioni di Mathis et al. (2011) ²³ e Yuanxiang et al. (2014) ²⁴.
6. Raffreddare il cervello fino a 2-4 ° C in un buffer per affettare ghiacciato (per almeno 2 min) prima il cervelletto di dissezione e separazione degli emisferi.
7. Utilizzare una lama chirurgica fredda per sezionare un pezzo di corteccia dorsale ad un angolo di 70° lungo il bordo dorsale di ogni emisfero²⁵ per ottenere sezioni trasversali dalle ventrali e la parte intermedia dell'ippocampo, come illustrato nella Figura 1C ed E.
8. Con una spatola di freddo cemento dentale, trasferire un emisfero a un pezzo di carta da filtro asciugare brevemente la superficie creata (1-2 s).
9. Montare i due emisferi con superfici appena tagliate sulla piattaforma ghiacciata per affettare utilizzando colla adesiva ad azione rapida; hanno l'estremità caudale del viso emisferi la lama di rasoio (Figura 1D).
10. Posizionare la piattaforma per affettare nella camera di raffreddamento di un vibratomo e riempire quello alloggiamento con il buffer per affettare (2-4 ° C). Carbogenate utilizzando un tubo di silicone perforato.
11. Tagliare 350 µm fette utilizzando le impostazioni adeguate vibratome (ad es., velocità di avanzamento lama: 1,2 mm/s, ampiezza di lama: 1 mm).
12. Isolare la formazione hippocampal dal subiculum e le cortecce entorinale utilizzando due cannule di iniezione (> 28 G) come forbici.
13. Rimuovere le bolle dalla mesh fetta-tenuta della camera di incubazione precedentemente preparato usando una pipetta Pasteur.
14. Trasferire le fette che hanno certa trasparenza presso il corneum pyramidale dalla piattaforma per affettare sulle maglie della camera umida. Evitare qualsiasi pieghevole, stretching, sovrapposti e galleggianti aspirando aCSF e la fetta in una pipetta di Pasteur bocca grande.
    Nota: L'intera procedura (passo 2.5-2.14) può prendere 5-10 min; Pertanto, è importante controllare la temperatura della soluzione tampone nel tempo a mantenerla a 4 ° C.
15. Incubare le fette a 30 ° C per almeno 1,5-2 h nella camera di incubazione e fornire carbogen a 4-6 L/h.
    Nota: Regolare la portata di carbogen a circolare il buffer in incubatrice, ma evitare le fette dal galleggiante.

3. le modifiche di Carbogenation per il aCSF riciclaggio dei piccoli serbatoi

1. Aggiungere un connettore 3 vie tubo per il deflusso del sistema di riciclaggio (Figura 2B).
2. Collegare il braccio medio del connettore 3 vie tubo con un tubo di alimentazione di carbogen e regolare la portata con un misuratore massa aria (3-4 L/h, Figura 2D e Figura 4C).
3. Aggiungere un secondo connettore 3 vie tubo per l'afflusso del sistema di riciclaggio. Collegare il braccio medio al tubo di fronte la stufa in linea, parte superiore del braccio di un tubo sottile in silicone (10 cm di lunghezza) e abbassare il braccio per il tubo di afflusso dal serbatoio (filtro passa-basso; Figura 4 C).
4. Posizionare un strizzatubo su un tubo sottile in silicone (OD: 2 mm) in una posizione lungo il tubo dove la pulsazione della aCSF nella camera della fetta, generata dalla pompa peristaltica, è al suo minimo.
   Nota: Il deflusso-carbogenation (deflusso-carb.) modifica riduce la sensibilità del livello carbogenation al volume del serbatoio aCSF, aCSF tasso di riciclaggio, e relativo tubo posizioni all'interno di serbatoi di piccole aCSF (< 50 mL; Figura 3). Per quanto riguarda il filtro passa-basso, una certa quantità di aria nel tubo di silicio sottile riduce le pulsazioni del flusso aCSF; così, il tubo dovrebbe essere riempito per la maggior parte con aria.

4.Registrazione di risposte sinaptiche in una camera di fetta di sommersione

Nota: Vedere la tabella dei materiali.

1. Pre-riscaldare la soluzione aCSF in un bagno di acqua a circa 28-30 ° C (questo impedirà la formazione di bolle nella camera di registrazione).
2. Avviare il sistema di riciclaggio (4-5 mL/min) e attivare il riscaldatore inline per equilibrare il sistema per almeno 1 h.
3. PRESOAK un piccolo pezzo di lente pulizia carta e una maglia di nylon fissato su un filo di platino a forma di U, nella camera di fetta di sommersione per pochi minuti (Figura 4).
4. Rimuovere il filo di platino a forma di U.
5. Spegnere il riciclaggio e mettete una fetta sulla lente carta di pulizia.
6. Posizionare immediatamente la mesh di fetta-tenuta sopra la fetta, accendere la pompa e lasciare che la fetta equilibrare per 30 min senza immergendo l'obiettivo nel aCSF.
7. Riempire la micropipetta borosilicato (cioè, l'elettrodo di registrazione) con aCSF (resistenza di punta: 1-2 MΩ, riempito con aCSF 1/3) e montarlo nel supporto pipetta.
8. Verificare l'isolamento dell'elettrodo metallo stimolazione inserendolo nella soluzione di NaHCO₃ (> 40 mM). Collegare l'elettrodo al polo negativo di un generatore di tensione DC (1-2 V, polo positivo: filo d'argento o platino) e osservare la formazione di bolle sulla punta sotto un microscopio di dissezione (> ingrandimento 60x).
9. Il riferimento cavi nel vano di fetta e posizionare l'elettrodo di stimolazione di testata a resina epossidica-isolato tungsteno nel supporto manipolatore.
10. Aggiungere un secondo elettrodo di riferimento alla camera e collegarlo alla presa di riferimento del headstage dell'elettrodo di registrazione (Figura 4A).
11. L'amplificatore software di controllo, fare clic sulla casella "modalità zero morsetto" e procedere facendo doppio clic la casella "elenco di guadagno di output". Scegliere un guadagno di "100", fare doppio clic su "passa-alto filtro casella di riepilogo (Bessel)," scegliere "0,1 Hz" e fare doppio clic su "passa-basso filtro casella di riepilogo (AC)" per scegliere "3kHz."
12. Nel software di registrazione, fare clic sulla su "Acquire | Aprire il protocollo". Scegliere un protocollo che dispone di impostazioni che consentono per stimolazioni episodiche e la digitalizzazione dei potenziali amplificati a 10-20 kHz per 50-100 ms e che si innesca automaticamente un isolatore di stimolo 10 ms dopo l'inizio di una registrazione episodica.
13. Posizionare la stimolazione ed elettrodi di registrazione in linea e parallela il corneum pyramidale, ad esempio (Figura 4B e Figura 5).
14. Fare clic su "acquisire | Modificare il protocollo"e scegliere la scheda"trigger"(nella finestra pop-up). Fare clic sulla casella "fonte di innesco" e scegliere "barra spaziatrice" come la fonte di innesco. Fare clic sul pulsante "OK". Fare clic sul pulsante "record" per avviare l'acquisizione e notare la finestra popup con un pulsante di trigger.
15. Nel software di isolatore di stimolo, fare clic sulla casella "controllo tensione" e inserire "0". Clicca sul pulsante "Scarica". Fare clic sulla finestra "software di registrazione" e premere la barra spaziatrice. Ripetere questo ciclo immettendo valori in sequenza da 1 a 8, ad esempio, a passi di mV 1 nella casella "controllo di tensione".
16. Correlare l'intensità di stimolazione con valori fEPSP-pendio e determinare la forza di stimolazione necessaria per ottenere il 40% della fEPSP-pendenza massima. Fare clic sulla casella"controllo tensione" e immettere il valore determinato. Clicca sul pulsante "Scarica".
    Nota: Un isolatore di stimolo viene utilizzato per applicare tensione breve o impulsi di corrente al tessuto cerebrale. Gli impulsi bifasici possono avere 100 µs per fase.
17. Nel software di registrazione, fare clic sul pulsante stop e poi il menu di "Acquisire". Clicca su "Edit protocollo" e scegliere la scheda "grilletto" nella finestra pop-up. Fare clic sulla casella origine trigger e abbiamo scelto il "timer interno" come la fonte di innesco. Fare clic sul pulsante "OK". Fare clic sul pulsante record che inizia la registrazione automatica dei potenziali di campo ogni 30 s, per esempio. Fare clic sul pulsante "stop" dopo 30-60 min.
18. Fare clic sul menu "Acquisire", fare clic su "Open Protocol," Scegli il protocollo di induzione desiderata della plasticità sinaptica e fare clic sul pulsante "OK". Fare clic sul pulsante "Registra" per attivare automaticamente la stimolazione ad alta frequenza e la registrazione. Fare clic sul pulsante "stop".
    Nota: Nel caso di studi relativi alla plasticità sinaptica, applicare uno dei paradigmi induzione standard per potenziamento a lungo termine o la depressione a lungo termine dopo la registrazione prolungata della linea di base. Esempi rappresentativi della conseguente modulazione della trasmissione sinaptica sono raffigurati nella Figura 7 e Figura 8.
19. Nel software di registrazione, fare clic su "Acquire | Aprire il protocollo"e scegliere il protocollo stesso come descritto al punto 4.12. Fare clic sul pulsante "OK" e quindi fare clic su "Registra". Mantenere automaticamente in esecuzione le registrazioni potenziali del campo per 2-4 h, per esempio. Fare clic sul pulsante "stop" per terminare la registrazione.
20. Nel caso di studi farmaceutici, applicare il composto direttamente per il aCSF serbatoio se amministrazione permanente composto è desiderato (Figura 6).

5. pulizia del Setup e suggerimenti

Nota: Vedi sotto per i consigli generali.

1. Pulire ogni settimana il sistema di riciclaggio 10% H₂O₂ per non più di 20 minuti, seguito da lavaggio con deionizzata H₂O.
   Nota: Etanolo non è raccomandato per la pulizia. Non allo stesso modo si consiglia di immergere i fili di riferimento e obiettivo in H₂O₂.
2. Rimuovere il sale precipitato sulla superficie della lente dell'obiettivo o dintorni di camera con acqua e poi 0,1 N HCl.
3. Lavare la vasca di gorgogliamento di carbogen in acqua distillata o 0,1 N HCl.
4. Immergere la camera di incubazione fetta 10% H₂O₂ per 5 min una volta a settimana e poi risciacquare accuratamente la camera di incubazione con deionizzata H₂O.
5. In caso di elettrodi di stimolazione del metallo, risciacquare la punta dell'elettrodo stimolante con acqua deionizzata dopo ogni esperimento e strofinare delicatamente la punta dell'elettrodo stimolante con un batuffolo di cotone imbevuto con etanolo per rimuovere il tessuto residuo.
6. Ridurre la resistenza di elettrodi di stimolazione del metallo commerciale rimuovendo l'isolamento sulla punta attraverso un'attenta sfiora con carta vetrata.
7. Ridurre la perdita di carbogen dal aCSF mentre riciclaggio attraverso i tubi, sostituendo i tubi in silicone con tubi di politetrafluoroetilene.
8. Tenere i fili d'argento dell'elettrodo di registrazione e dell'elettrodo di riferimento in candeggina per diversi giorni per formare AgCl sulla superficie del filo.

Risultati

Nella sezione protocollo, abbiamo descritto la preparazione di fettine ippocampali acute dalla parte ventrale e intermedi della formazione hippocampal (Figura 1) del maschio C57BL/6 topi e ratti maschii di Wistar (5-8 settimane). La posizione degli emisferi sulla piattaforma affettatrice aiuta a tenerli stabili ed elimina la necessità di stabilizzazione con agar o dell'agarosi. Il sistema di perfusione stesso è basato su una pompa peristaltica operata su al...

Discussione

Anche se Colombo fetta interfaccia esibiscono più robusto Risposte sinaptiche^25,26,27,28, alloggiamenti di sommersione forniscono ulteriore comodità per la registrazione di patch-clamp e fluorescenza di imaging. Così, abbiamo descritto diversi aspetti di field recordings potenziali in fettine ippocampali acute utilizzando una camera di fetta di sommersione commerciale che può essere facilme...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents required
NaCl	Sinopharm Chemical Reagent, China	10019318
KCl	Sinopharm Chemical Reagent, China	10016318
KH2PO4	Sinopharm Chemical Reagent, China	10017618
MgCl2·6H2O	Sinopharm Chemical Reagent, China	10012818
CaCl2	Sinopharm Chemical Reagent, China	10005861
NaHCO3	Sinopharm Chemical Reagent, China	10018960
Glucose	Sinopharm Chemical Reagent, China	10010518
NaH2PO4	Sinopharm Chemical Reagent, China	20040718
HEPES	Sigma	H3375
Sodium pyruvate	Sigma	A4043
MgSO4	Sinopharm Chemical Reagent, China	20025118
NaOH	Sinopharm Chemical Reagent, China	10019718
Tools and materials for dissection
Decapitators	Harvard apparatus	55-0012	for rat decapitation
Bandage Scissors	SCHREIBER	12-4227	for mouse decapitation
double-edge blade	Flying Eagle, China	74-C
IRIS Scissors	RWD, China	S12003-09
Bone Rongeurs	RWD, China	S22002-14
Spoon	Hammacher	HSN 152-13
dental cement spatula	Hammacher	HSN 016-15
dental double end excavator	Blacksmith Surgical, USA	BS-415-017
Vibrating Microtome	Leica, Germany	VT1200S
surgical blade	RWD, China	S31023-02
surgical holder	RWD, China	S32007-14
Electrophysiology equipment and materials
Vertical Pipette Puller	Narishige, Japan	PC-10
Vibration isolation table	Meirits, Japan	ADZ-A0806
submerged type recording chamber	Warner Instruments	RC-26GLP
4 Axis Micromanipulator	Sutter, USA	MP-285, MP-225
Platinum Wire	World Precision Instruments	PTP406
Amplifier	Molecular Devices, USA	Multiclamp 700B
Data Acquisition System	Molecular Devices, USA	Digidata 1440A
Anaysis software	Molecular Devices, USA	Clampex 10.2
Fluorescence Microscope	Nikon, Japan	FN1
LED light source	Lumen Dynamics Group, Canada	X-cite 120LED
micropipettes	Harvard apparatus	GC150TF	extracelluar recording
borosilicate micropipettes	Sutter, USA	BF150-86	patch clamp
tungsten electrode	A-M Systems, USA	575500
peristaltic pump	Longer, China	BT00-300T
tubes for peristaltic pump	ISMATEC, Wertheim, Germany	SC0309	1x inflow, ID: 1.02 mm
tubes for peristaltic pump	ISMATEC, Wertheim, Germany	SC0319	2x tubes for outflow, ID: 2.79 mm
CCD camera	PCO, Germany	pco.edge sCMOS
lens cleaning paper	Kodak
50 mL conical centrifuge tube	Thermo scientific	339652
Prechamber	Warner Instruments	BSC-PC
Inline heater	Warner Instruments	SF-28
Temperature Controller	Warner Instruments	TC-324B