Grabación de la plasticidad sináptica en rebanadas Hippocampal agudas mantenidas en un pequeño volumen reciclado - perfusión- y sistema de cámara de tipo inmersión

Resumen

Este protocolo describe la estabilización del nivel de oxígeno en un pequeño volumen de tampón reciclado y aspectos metodológicos de la plasticidad sináptica dependiente de actividad de la grabación en rebanadas hippocampal agudas sumergidas.

Resumen

Aunque los experimentos en rebanadas de cerebro han estado en uso desde 1951, siguen existiendo problemas que reducen la probabilidad de lograr un análisis acertado y estable de la modulación de la transmisión sináptica al realizar grabaciones intracelulares o potenciales del campo. Este manuscrito describe aspectos metodológicos que pueden ser útiles en la mejora de las condiciones experimentales para el mantenimiento de rebanadas cerebrales agudas y para la grabación de potenciales postsinápticos excitatorios de campo en una cámara de inmersión disponibles en el mercado con una unidad de salida carbogenation. La carbogenation de la salida ayuda a estabilizar el nivel de oxígeno en los experimentos que se basan en el reciclaje de un depósito tampón pequeño para mejorar la rentabilidad de experimentos con drogas. Además, el manuscrito presenta experimentos representativos que examinan los efectos de la carbogenation diferentes modos y paradigmas de estimulación de la plasticidad sináptica dependiente de actividad de la transmisión sináptica.

Introducción

En 1951, los experimentos de rebanada cerebral aguda registrados primero fueron realizados¹. En 1971, después de éxito en vitro las grabaciones de la corteza piriforme^2,3 y el descubrimiento que las neuronas hippocampal están interconectadas transversalmente en el eje septotemporal del hipocampo⁴, uno de los primeras grabaciones en vitro de la actividad neuronal hippocampal fue alcanzado⁵. La similitud de los parámetros neurofisiológicos o neurostructural de las neuronas bajo condiciones en vivo y en vitro son todavía objeto de un debate⁶, pero en 1975, Schwartzkroin⁷ indica que la basal propiedades de las neuronas se mantienen en vitro y esa estimulación de alta frecuencia (es decir, tetanization) de aferentes en la formación hipocampal induce una facilitación de larga duración de los potenciales sinápticos⁸. Electrofisiológica de la actividad neuronal en vitro ampliado en gran medida el estudio de los mecanismos celulares de la plasticidad sináptica dependiente de actividad^9,10, que había sido descubierto en 1973 por Bliss et al. ¹¹ en vivo experimentos con conejos.

El estudio de la actividad neuronal o la señalización de vías en rebanadas de cerebro y especialmente en rebanadas hippocampal agudas, es ahora una herramienta estándar. Sin embargo, sorprendentemente, en vitro experimentos han estar estandarizados, como lo demuestran los múltiples enfoques que existen para la preparación y mantenimiento de rebanadas hippocampal agudas. Reid et al. (1988) ¹² repasa los desafíos metodológicos para el mantenimiento de rebanadas cerebrales agudas en diferentes tipos de cámaras de la rebanada y las opciones de baño nivel medio, pH, temperatura y oxígeno. Estos parámetros son todavía difíciles de controlar en la cámara de grabación debido a los elementos por encargo en vitro rebanada-grabación configuraciones. Pueden encontrar publicaciones que podría ayudar a superar algunos de los retos metodológicos y describen nuevos tipos de cámaras de rebanada de inmersión, como un sistema intersticial microperfusion 3D del¹³, una cámara con mejor flujo laminar y oxígeno de la fuente¹⁴, un sistema con control de temperatura computarizado¹⁵y un sistema de grabación multi cámara¹⁶. Ya que estas cámaras no son fáciles de construir, mayoría de los científicos se basan en cámaras de corte disponibles en el mercado. Estas cámaras pueden montarse en un sistema de microscopio, permitiendo la combinación de electrofisiología y de fluorescencia de imagen^17,18,19. Puesto que estas cámaras guardar las rebanadas de cerebro sumergidas en líquido cefalorraquídeo artificial (aCSF), un alto flujo de la solución tampón debe mantenerse, aumentar el gasto de uso de la droga. Para ello, hemos incorporado un sistema de perfusión reciclaje con carbogenation de salida que proporciona la estabilidad suficiente para la grabación a largo plazo de los potenciales de campo en una cámara de corte de inmersión usando un volumen relativamente pequeño de la aCSF. Además, resumimos cómo el uso de este sistema experimental carbogenation/perfusión afecta el resultado de la plasticidad sináptica dependiente de actividad¹⁰ y cómo la inhibición de la cinasa del factor 2 de elongación eucariotas (eEF2K) modula sináptica transmisión²⁰.

Protocolo

Los animales fueron mantenidos según las normas de cuidado de los animales y los procedimientos de los institutos de ciencia del cerebro y el estado clave de laboratorio médico Neurobiología de la Universidad de Fudan, Shanghai, China.

1. preparación de la solución

Nota: Consulte la tabla de materiales.

1. Preparar el buffer de corte (solución de Gey modificado): 92 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1.25 mM NaH₂PO₄, 30 mM NaHCO₃, 25 mM de glucosa, 20 mM HEPES, 3 mM Na⁺-piruvato, 10 mM MgSO₄y 0,5 mM de CaCl₂.
2. Ajustar el pH a 7,6 con 1 M NaOH sin carbogenation.
3. Almacenar el buffer a 4 ° C.
   Nota: La valoración clarifica el líquido nublado. La osmolalidad es 305-310 mOsm. El carbogen²¹ contiene 5% de dióxido de carbono y el 95% de oxígeno.
4. Preparar la aCSF diluyendo un 10 x solución de aCSF que no contienen bicarbonato y glucosa, dando una composición final: 124 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 2,5 mM CaCl₂, 2 mM de MgCl₂y 1,25 mM KH₂PO₄.
5. Añadir bicarbonato y glucosa para llegar a 10 mM glucosa y 26 mM NaHCO₃.
6. Carbogenate la aCSF a través de un tubo de silicona perforada con un extremo bloqueado inmediatamente después de agregar el NaHCO₃.
7. Medir el pH mientras que carbogenating (pH 7.3-7.4).
   Nota: La capacidad tampón puede ajustarse ligeramente alterando la cantidad de NaHCO₃. Puesto que el pH resultante depende de la temperatura, es necesario comprobar el pH resultante mientras carbogenating en la temperatura de trabajo (por ejemplo, 30 ° C).

2. preparación de rebanadas Hippocampal agudas

Nota: Consulte la tabla de materiales.

1. Coloque una malla de retención de rebanada en una cámara de incubación para rebanadas de cerebro agudo, llene la cámara con la aCSF y carbogenate (4-6 L/h) para por lo menos 30 min²² a 28-30 ° C.
2. Enfriar los instrumentos quirúrgicos hasta 2-4 ° C.
3. Coloque un vaso de vidrio llenado de agua fría y carbogenated corte tampón (2-4 ° C), en una mezcla de hielo y agua, cerca el vibratome.
4. Anestesiar las ratas o los ratones hasta que desaparezcan de los reflejos corneales (30-50 s) utilizando isoflurano teniendo 500 μL en un frasco de vidrio de 2 L o 12.5 μL en un tubo de 50 mL.
5. Aislar el cerebro usando un método descrito y visualizar en detalle en las publicaciones de Mathis et al. (2011) ²³ y Yuanxiang et al. (2014) ²⁴.
6. Enfriar el cerebro hasta 2-4 ° C en un búfer de corte helado (para al menos 2 minutos) antes de cerebelo de disección y separación de los hemisferios.
7. Utilice una hoja quirúrgica fría para diseccionar un pedazo de la corteza dorsal en un ángulo de 70° en el borde dorsal de cada hemisferio²⁵ para obtener rodajas transversales de la ventral y la parte intermedia del hipocampo, como se muestra en la figura 1C y E.
8. Con una espátula de cemento dental frío, transferencia de un hemisferio a un pedazo de papel de filtro para secar brevemente la superficie creada (s 1-2).
9. Monte los dos hemisferios con superficies recién cortadas sobre la plataforma helada de corte con pegamento adhesivo de acción rápida; tienen el extremo caudal de la cara de hemisferios la hoja de afeitar (figura 1D).
10. Coloque la plataforma de corte en la cámara de refrigeración de un vibratome y llenar esa cámara con el tampón de corte (2-4 ° C). Carbogenate utilizando un tubo de silicona perforada.
11. Cortar rodajas de μm 350 vibratome adecuados parámetros (por ejemplo, velocidad de avance hoja: 1,2 mm/s, amplitud de la lámina: 1 mm).
12. Aislar la formación hipocampal del subiculum y las cortezas entorrinal mediante dos cánulas de inyección (> 28 G) como tijeras.
13. Quite las burbujas de la malla de retención de rebanada de la cámara de incubación previamente preparados, utilizando una pipeta Pasteur.
14. La transferencia de los sectores que tienen cierta transparencia en el pyramidale del estrato de la plataforma de corte de la malla de la cámara de incubación. Evitar cualquier plegable, estiramiento, superposición y flotante por aCSF y la rebanada de aspiración con una pipeta Pasteur de boca grande.
    Nota: Todo el procedimiento (paso 2.5-2.14) puede tomar 5-10 min; por lo tanto, es importante comprobar la temperatura de la solución tampón en el tiempo para mantener a 4 ° C.
15. Incubar las rebanadas a 30 ° C al menos 1.5-2 h en la sala de incubación y proporcionar carbogen en 4-6 L/h.
    Nota: Ajuste el caudal de carbogen circular el búfer en la incubadora, pero evitar que las rodajas flotando.

3. las modificaciones de la Carbogenation de la aCSF reciclaje de pequeños embalses

1. Agregar un conector de 3 vías tubo a la salida del sistema de reciclaje (figura 2B).
2. Conectar el brazo medio del conector de 3 vías tubo con un tubo de suministro de carbogen y regular el caudal con un medidor de flujo de aire (3-4 L/h,D , figura 2y figura 4C).
3. Agregar un segundo conector de 3 vías tubo a la entrada del sistema de reciclaje. Conectar el brazo medio al tubo hacia el calentador en línea, el brazo a un tubo de silicona delgada (10 cm de longitud) y el brazo inferior del tubo de entrada de la reserva (filtro de paso bajo; Figura 4 C).
4. Coloque un exprimidor de tubo en un tubo de silicona delgada (OD: 2 mm) en una posición a lo largo del tubo donde la pulsación de la aCSF en la cámara de corte, generada por la bomba peristáltica, está en su mínimo.
   Nota: El carbogenation de salida (salida-carb.) modificación reduce la sensibilidad del nivel carbogenation para el volumen del embalse del aCSF, la aCSF tasa de reciclaje y tubo relativa posiciones dentro aCSF pequeños embalses (< 50 mL; Figura 3). Sobre el filtro de paso bajo, una cierta cantidad de aire en el tubo de silicona fino reduce la pulsación de la corriente de la aCSF; así, el tubo debe llenarse con aire.

4.Grabación de las respuestas sinápticas en una cámara de corte de inmersión

Nota: Consulte la tabla de materiales.

1. Precaliente la aCSF solución en un baño de agua a unos 28-30 ° C (Esto evitará la formación de burbujas en la cámara de grabación).
2. Iniciar el sistema de reciclaje (4-5 mL/min) y activar el calentador en línea para equilibrar el sistema durante al menos 1 h.
3. Remojo un pedazo pequeño de papel y una malla de nylon fijado en un alambre de platino en forma de U en la cámara de corte sumersión durante unos minutos (figura 4) de limpieza de lentes.
4. Quite el alambre de platino en forma de U.
5. Apague el reciclaje y coloque una rebanada en el papel de limpieza de lentes.
6. Inmediatamente Coloque la malla de retención de rebanada encima de la rebanada, encender la bomba y dejar el segmento equilibre durante 30 min sin el objetivo de inmersión en la aCSF.
7. La micropipeta de borosilicato (es decir, el electrodo de la grabación) se llenan de aCSF (punta de resistencia: 1-2 MΩ, llena 1/3 con aCSF) y montar en el soporte de pipeta.
8. Compruebe el aislante del electrodo de estimulación metal colocando en la solución de NaHCO₃ (> 40 mM). Conecte el electrodo al polo negativo de un generador de voltaje de DC (1-2 V, polo positivo: alambre de plata o platino) y observar la formación de burbujas en la punta de un microscopio de disección (> 60 aumentos).
9. Coloque el electrodo de estimulación probado tungsteno aislamiento de epoxi manipulador y la referencia de los cables en la cámara del sector.
10. Añada un segundo electrodo de referencia a la cámara y conéctela a la toma de referencia de la headstage del electrodo de la grabación (figura 4A).
11. En el software de control de amplificador, haga clic en la casilla de "modo cero abrazadera" y continuar haciendo doble clic en la casilla "output gain lista". Elegir una ganancia de "100", haga doble clic en el "paso alto filtro cuadro de lista (Bessel)," elegir "0.1 Hz" y haga doble clic en el "paso bajo filtro cuadro de lista (AC)" para elegir "3 kHz."
12. En el software de grabación, haga clic en el sobre "adquisición | Abrir protocolo." Elegir un protocolo que tiene posiciones permitiendo estímulos episódicos y la digitalización de potenciales amplificados en 10-20 kHz para 50-100 ms y desencadena automáticamente un aislador de estímulo 10 ms después del comienzo de una grabación episódica.
13. Coloque la estimulación y electrodos de registro en línea y paralelo al pyramidale del estrato, por ejemplo (figura 4B y figura 5).
14. Haga clic en "adquirir | Editar el protocolo"y elija la ficha"gatillo"(en la ventana emergente). Haga clic en la caja de "fuente del disparador" y elegir "barra espaciadora" como la fuente del disparador. Haga clic en el botón "OK". Haga clic en el botón "grabar" para iniciar la compra y observe la ventana emergente con un botón de disparo.
15. En el estímulo aislador software, haga clic en la casilla de "control de la tensión" y escriba "0". Haga clic en el botón "Descargar". Haga clic en la ventana "software de grabación" y presiona la barra espaciadora. Repita este ciclo introduciendo secuencialmente los valores de 1 a 8, por ejemplo, en pasos de 1 mV en la caja de "control de la tensión".
16. La fuerza del estímulo se correlacionan con valores de pendiente fEPSP y determinar la fuerza de la estimulación necesaria para obtener el 40% de la fEPSP-pendiente máxima. Haga clic en la "caja de control de voltaje" e introduzca el valor determinado. Haga clic en el botón "Descargar".
    Nota: Un aislador de estímulo se utiliza para aplicar tensión breve o pulsos de corriente para el tejido cerebral. Los pulsos bifásicos pueden tener 100 μs por fase.
17. En el software de grabación, haga clic en el botón stop y luego en el menú de "Adquirir". Haga clic en protocolo de"Editar" y seleccione la ficha "gatillo" en la ventana emergente. Haga clic en la caja de la fuente de disparo y eligió el "temporizador interno" como la fuente del disparador. Haga clic en el botón "OK". Haga clic en el botón de grabación que se inicia la grabación automática de los potenciales de campo cada 30 s, por ejemplo. Haga clic en el botón "stop" después de 30-60 min.
18. Haga clic en el menú de "Adquirir", haga clic en "Protocolo abierto", elija el protocolo de inducción deseado de plasticidad sináptica y haga clic en el botón "OK". Haga clic en el botón de "grabar" para activar automáticamente la alta frecuencia estimulación y registro. Haga clic en el botón "stop".
    Nota: En caso de estudios de plasticidad sináptica, aplicar uno de los paradigmas de inducción estándar para potenciación a largo plazo o depresión a largo plazo después de la grabación inicial prolongada. Ejemplos representativos de la modulación resultante de la transmisión sináptica se representan en la figura 7 y figura 8.
19. En el software de grabación, haga clic en "adquirir | Abra el protocolo"y seleccione el mismo protocolo como en el paso 4.12. Haga clic en el botón "Aceptar" y haga clic en "registro". Mantenga el funcionamiento automáticamente las grabaciones del campo potencial para 2-4 h, por ejemplo. Haga clic en el botón "stop" para finalizar la grabación.
20. En el caso de estudios farmacéuticos, aplique el compuesto directamente a la aCSF depósito si es permanente administración compuesta deseado (figura 6).

5. limpieza de la instalación y consejos

Nota: Ver abajo para consejos generales.

1. Limpiar el sistema semanal de reciclaje 10% H₂O₂ para no más de 20 min, seguido de lavado con desionizada H₂O.
   Nota: Etanol no se recomienda para la limpieza. Asimismo se recomienda no sumergir los cables de referencia y objetivo en H₂O₂.
2. Retire la sal precipitada en la superficie de la lente del objetivo o alrededores de cámara con 0.1 N HCl y agua.
3. Lave el borboteador carbogen en agua destilada o 0.1 N HCl.
4. Sumergir la cámara de incubación de la rebanada en el 10% H₂O₂ durante 5 minutos una vez por semana y luego enjuague bien la cámara de incubación con desionizada H₂O.
5. En caso de electrodos de estimulación metal, enjuague la punta del electrodo estimulante con agua desionizada después de cada experimento y suavemente Limpie la punta del electrodo estimulante con una bola de algodón empapada con etanol para eliminar tejido residual.
6. Reducir la resistencia de los electrodos de estimulación metal comercial eliminando el aislamiento en el extremo a través de un golpe cuidado con papel de lija.
7. Reducir la pérdida de carbogen de la aCSF reciclaje a través de los tubos mediante la sustitución de los tubos de silicona con tubos de politetrafluoretileno.
8. Mantenga los cables de plata de la grabación de electrodo y electrodo de referencia en lejía durante varios días para formar AgCl en la superficie del alambre.

Resultados

En la sección de protocolo, nos describe la preparación de aguda rebanadas hippocampal de la parte intermedia y ventral de la formación hipocámpica (figura 1) de ratones C57BL/6 machos y ratas Wistar macho (5-8 semanas). La posición de los hemisferios en la plataforma de la máquina de cortar ayuda a mantener estable y elimina la necesidad de estabilización con agar o agarosa. El sistema de perfusión se basa en una bomba peristáltica en alta rotación...

Discusión

Aunque cámaras de rebanada de interfaz exhiben más sólidas respuestas sinápticas^25,26,27,28, cámaras de inmersión proporcionan comodidad adicional para la grabación de la abrazadera del remiendo y de la fluorescencia proyección de imagen. Así, hemos descrito algunos aspectos de posibles grabaciones de campo en rebanadas hippocampal agudas usando una cámara de corte de inmersión comer...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents required
NaCl	Sinopharm Chemical Reagent, China	10019318
KCl	Sinopharm Chemical Reagent, China	10016318
KH2PO4	Sinopharm Chemical Reagent, China	10017618
MgCl2·6H2O	Sinopharm Chemical Reagent, China	10012818
CaCl2	Sinopharm Chemical Reagent, China	10005861
NaHCO3	Sinopharm Chemical Reagent, China	10018960
Glucose	Sinopharm Chemical Reagent, China	10010518
NaH2PO4	Sinopharm Chemical Reagent, China	20040718
HEPES	Sigma	H3375
Sodium pyruvate	Sigma	A4043
MgSO4	Sinopharm Chemical Reagent, China	20025118
NaOH	Sinopharm Chemical Reagent, China	10019718
Tools and materials for dissection
Decapitators	Harvard apparatus	55-0012	for rat decapitation
Bandage Scissors	SCHREIBER	12-4227	for mouse decapitation
double-edge blade	Flying Eagle, China	74-C
IRIS Scissors	RWD, China	S12003-09
Bone Rongeurs	RWD, China	S22002-14
Spoon	Hammacher	HSN 152-13
dental cement spatula	Hammacher	HSN 016-15
dental double end excavator	Blacksmith Surgical, USA	BS-415-017
Vibrating Microtome	Leica, Germany	VT1200S
surgical blade	RWD, China	S31023-02
surgical holder	RWD, China	S32007-14
Electrophysiology equipment and materials
Vertical Pipette Puller	Narishige, Japan	PC-10
Vibration isolation table	Meirits, Japan	ADZ-A0806
submerged type recording chamber	Warner Instruments	RC-26GLP
4 Axis Micromanipulator	Sutter, USA	MP-285, MP-225
Platinum Wire	World Precision Instruments	PTP406
Amplifier	Molecular Devices, USA	Multiclamp 700B
Data Acquisition System	Molecular Devices, USA	Digidata 1440A
Anaysis software	Molecular Devices, USA	Clampex 10.2
Fluorescence Microscope	Nikon, Japan	FN1
LED light source	Lumen Dynamics Group, Canada	X-cite 120LED
micropipettes	Harvard apparatus	GC150TF	extracelluar recording
borosilicate micropipettes	Sutter, USA	BF150-86	patch clamp
tungsten electrode	A-M Systems, USA	575500
peristaltic pump	Longer, China	BT00-300T
tubes for peristaltic pump	ISMATEC, Wertheim, Germany	SC0309	1x inflow, ID: 1.02 mm
tubes for peristaltic pump	ISMATEC, Wertheim, Germany	SC0319	2x tubes for outflow, ID: 2.79 mm
CCD camera	PCO, Germany	pco.edge sCMOS
lens cleaning paper	Kodak
50 mL conical centrifuge tube	Thermo scientific	339652
Prechamber	Warner Instruments	BSC-PC
Inline heater	Warner Instruments	SF-28
Temperature Controller	Warner Instruments	TC-324B