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要約

このプロトコルでは、再生バッファーの量が少ないと水中急性海馬スライスにおける活性依存性シナプス可塑性を記録の方法論的側面の酸素レベルの安定化について説明します。

要約

脳スライスの実験は 1951 年以来使用されている、にもかかわらず、フィールドや潜在的な細胞内の録音を実行するとき、シナプス伝達の変調の安定した、成功した分析を達成するための確率を低減問題が残っています。この原稿は、急性脳スライスの維持のため、市販の水没商工会議所における興奮性シナプス後電位を記録するための実験条件の改善に役立つ可能性のある方法論的側面をについて説明します流出 carbogenation 付け。流出 carbogenation は、薬物実験のコスト効率を高めるために小さなバッファー貯留層の循環依存の実験で酸素レベルを安定させるのに役立ちます。さらに、原稿はシナプス伝達の活動依存的シナプス可塑性に及ぼす異なる carbogenation モードと刺激パラダイムを調べる代表的な実験を紹介します。

概要

1951 年に初めて報告した急性期脳スライス実験は実施1.梨状皮質2,3海馬ニューロンが海馬の4、1 つの septotemporal 軸に沿って横相互接続されて検出から成功体外録音後の 1971 年に、海馬神経活動の最初の in vitroの録音は達成5だった生体内および生体外での条件の下でニューロンの神経生理学的または neurostructural パラメーターの類似性はまだいくつかの討論の6件名が、1975 年に Schwartzkroin7ことが示された基底神経細胞の特性は体外で維持され、その高周波刺激 (すなわちtetanization) 海馬における求心性神経のシナプス電位8の長期的な円滑化を誘導します。記録神経活動の電気生理学的体外大幅拡大活動依存的シナプス可塑性9,10至福によって 1973 年に発見されていた細胞のメカニズムの研究ら11 生体内で実験ウサギ。

神経細胞の活動やシグナル伝達経路脳スライスで、特に急性海馬スライスの研究は今標準的なツールです。しかし、驚いたことに、体外実験があるまだ標準化される準備や急性海馬スライスのメンテナンスのために存在する複数のアプローチによっても明らかなようリードら(1988 年)12は、急性脳スライス スライス チャンバーの種類と入浴中、pH、温度、酸素のレベルの選択肢でのメンテナンスの方法論的課題を検討しました。これらのパラメーターは、まだスライス記録のセットアップの in vitroのカスタムメイドの要素のための記録室の制御が困難です。可能性があります問題の克服にいくつかの方法論的課題と説明水没スライス チェンバース、間質性の 3 D microperfusion システム13、強化された層流と酸素室などの新しいタイプの出版物を見つけることができます。14、コンピューター化された温度コントロール15システム、マルチチャンバ記録システム16を供給します。これらの部屋は簡単に構築できないので、ほとんどの科学者は市販のスライスの部屋に依存します。これらの部屋は、こうして電気生理学および蛍光イメージングの17,18,19の組み合わせを可能にする顕微鏡システムにマウントできます。以来、これらの部屋は、人工髄液 (アプライド) に沈んで脳スライスを維持、新薬承認申請の費用を増加緩衝液の流量を維持する必要があります。このため、流出 carbogenation 比較的小さいアプライド ボリュームを使用して浸漬スライス チャンバー内電位長時間記録の十分な安定性を提供するリサイクル灌流システムを組み込みました。さらに、我々 は活動依存的シナプス可塑性10の結果に影響を与えるこの実験的 carbogenation/灌流システムを使用し、どの真核伸長因子 2 キナーゼ (eEF2K) の抑制を調節するシナプスを要約伝送20。

プロトコル

動物は、動物のケアの確立された標準と脳科学研究所と状態キー研究所の医療神経生物学の復旦大学、上海、中国の手順に従って維持されました。

1. ソリューションの準備

注: は、材料の表を参照してください。

  1. (変更された Gey ソリューション) のスライスのバッファーを準備: 92 mM の NaCl、KCl、1.25 mM NaH2PO4、30 mM NaHCO3、2.5 mM 25 mM グルコース、20 mM HEPES、3 mM Na+-ピルビン酸、10 mM MgSO4、および 0.5 mM CaCl2。
  2. 7.6 carbogenation なし 1 M NaOH を使用してに pH を調整します。
  3. 4 ° C でバッファーを保存します。
    注: 滴定濁った液体を明らかにします。浸透圧は、305 310 mOsm です。カーボゲン ・21には、5% の二酸化炭素と 95% の酸素が含まれています。
  4. 希釈原液重炭酸、ブドウ糖が含まれていないアプライドの x 10 の最終組成物を与えることで、アプライドの準備: 124 mM の NaCl、2.5 mM KCl、2.5 mM CaCl2、2 mM MgCl2、および 1.25 mM KH2PO4。
  5. 重炭酸塩と 10 mM グルコースと 26 mM NaHCO3に到達するためにグルコースを追加します。
  6. Carbogenate NaHCO3を追加した直後にブロックされた端と穴あきシリコン チューブを通してアプライド。
  7. Carbogenating (pH 7.3 7.4) しながら pH を測定します。
    注意: バッファー容量は、NaHCO3の量を変えることによって少し調整できます。結果 pH は温度に依存するので動作温度 (例えば、 30 ° C) で carbogenating しながら結果の pH をチェックする必要は。

2. 急性海馬スライスの準備

注: は、材料の表を参照してください。

  1. 急性脳スライスのインキュベーション室にスライスを保持メッシュを配置、アプライド、28-30 ° C で少なくとも 30 分22 carbogenate (4-6 L/h) とチャンバー
  2. 2-4 ° c. の下に手術器具をクールします。
  3. 寒さとバッファー (2-4 ° C)、vibratome の近くの氷/水混合物の維持をスライス carbogenated ガラス ビーカーを置きます。
  4. ラットやマウスの麻酔まで角膜反射が消える (30-50 s) 500 μ L を勘案し 2 L ガラス瓶または 50 mL のチューブに 12.5 μ L イソフルランを使用します。
  5. 説明し、マティスらの著書・論文で詳細に可視化法を用いた脳を分離します。(2011 年)23 日宗門ら(2014)24。
  6. 小脳の解剖と半球を分ける前に (少なくとも 2 分) の冷たいスライス バッファーに 2-4 ° C まで脳を冷やします。
  7. 図 1Cに示すように腹と海馬の中間部分から横スライスを取得するのに各半球の25の背側縁に沿って 70 ° の角度で背側皮質の部分を解剖するのに冷たい外科ブレードを使用します。E。
  8. 冷たい歯科用セメントへらで、フィルター ペーパーで簡潔に作成された表面 (1 〜 2 秒) を乾燥する部分に半球を転送します。
  9. 速効性の接着剤; を使用して冷たいスライス プラットフォームで新鮮なカット面をもつ 2 つの半球をマウントします。半球顔かみそりの刃 (図 1D) の尾の端を持っています。
  10. スライスのプラットフォームを vibratome の冷却室に置き、スライスのバッファー (2-4 ° C) とその部屋を埋めます。Carbogenate 穴あきシリコン チューブを使用しています。
  11. 適切な vibratome 設定を使用して 350 μ m のスライス カット (例えば、ブレード前方速度: 1.2 mm/s、ブレード振幅: 1 mm)。
  12. Subiculum と 2 つの注入カニューレを使用して嗅皮質から海馬を分離 (> 28 G) はさみとして。
  13. パスツール ピペットを使用して事前に準備された培養室のスライスを保持メッシュから泡を削除します。
  14. スライス スライスのプラットフォームから地層属三角骨にいくつかの透明性は、インキュベーション室のメッシュに転送します。任意の折りたたみ、ストレッチ、重複、および大きな口パスツール ピペットにアプライドとスライスを吸引によって浮動を回避します。
    メモ: 全体の手順 (手順 2.5 2.14) がかかる 5-10 分。したがって、4 ° C で維持するために時間をかけて緩衝液の温度をチェックすることが重要です。
  15. インキュベーション室に少なくとも 1.5-2 時間 30 ° C でスライスをインキュベートし、4-6 L/h でカーボゲン ・を提供します。
    注: は、インキュベーター内のバッファーを循環するが、浮遊からのスライスを防ぐカーボゲン ・流量を調整します。

3. 変更、アプライドの Carbogenation の小さな貯水池のリサイクル

  1. リサイクル システム (図 2B) の流出に 3 ウェイ チューブ コネクタを追加します。
  2. カーボゲン ・供給管と 3 ウェイ チューブ コネクタの中間の腕を接続し、エアフロー メーター (図 2Dと図 4C3-4 L/h) と流量を調節します。
  3. リサイクル システムの流入に 2 番目の 3 ウェイ チューブ コネクタを追加します。中間の腕を貯水池 (低域通過フィルターから流入管インライン ヒーター、薄いシリコン チューブ (10 cm) にアッパー アームとロアアームに直面する管に接続します。図 4C)。
  4. 薄いシリコン チューブにチューブ絞りを配置 (OD: 2 mm) 蠕動ポンプによって生成されたスライス チャンバーでアプライドの脈動が、最低は管に沿って位置に。
    注: 流出-carbogenation (流出-炭水化物) 変更はアプライド貯水池、リサイクル率、アプライドのボリュームに carbogenation レベルの感受性を減らすと小さなアプライド貯水池内に相対的なチューブを配置 (< 50 mL。図 3)。低域通過フィルターに関する薄膜シリコン チューブで空気量削減アプライドの流れの脈動したがって、空気とほとんどチューブを満たす必要があります。

4。水没スライス チャンバー内シナプス応答の記録

注: は、材料の表を参照してください。

  1. あらかじめ約 28-30 ° c に (これは、気泡の録音室を防止) 水浴のアプライド解決を暖めます。
  2. リサイクル システム (4-5 mL/分) を開始し、少なくとも 1 時間のためのシステムを平衡にインライン ヒーターをアクティブにします。
  3. レンズ クリーニング ペーパーと数分 (図 4) 水没スライス チャンバーで U 字白金線に固定ナイロン メッシュの小片を presoak します。
  4. U 字白金線を削除します。
  5. リサイクル電源、レンズ クリーニング ペーパーのスライスを配置します。
  6. すぐにスライスの上にスライスを保持メッシュを配置し、ポンプのスイッチ、目的をくずさず、アプライドに 30 分間平衡スライス。
  7. アプライドとホウケイ酸塩のマイクロ ピペット (すなわち、記録電極) を記入 (先端抵抗: 1 2 MΩ いっぱいアプライドで 1/3)、ピペット ホルダーにマウントします。
  8. NaHCO3ソリューションにそれを置くことによって金属刺激電極の絶縁体をチェック (> 40 mM)。DC 電圧のマイナス極に、電極を接続 (1-2 V、肯定的な棒: 銀やプラチナ ワイヤ)、解剖顕微鏡の下で先端に泡の形成を観察して (> 60 倍の倍率)。
  9. マニピュレーター ホルダー内テスト エポキシ絶縁タングステン刺激電極を置き、スライス チャンバーでワイヤを参照。
  10. 室に 2 番目参照電極を追加し、記録電極 (図 4A) のパッチアンプ用アダプターの参照のソケットに接続します。
  11. アンプ コントロール ソフトウェアの「ゼロ ・ クランプ」ボックスをクリックし、「出力ゲイン一覧」ボックスをダブルクリックして進みます。ゲインを選択「100」の"ハイパス フィルター リスト ボックスのダブルクリック (ベッセル)」「0.1 Hz"を選択し、"ローパス フィルター リスト ボックスをダブルクリック (AC)」「3 kHz」を選択するには
  12. レコーディング ソフトウェアでクリックしてで「取得 |プロトコルを開きます。"エピソードの録音の開始後 10 ms を刺激アイソレータ トリガー設定が自動的に間欠的刺激と 50-100 ms の 10-20 kHz で増幅された電位のデジタル化を可能にするプロトコルを選択します。
  13. ラインと属地層三角骨、たとえば (図 4および図 5) に平行に刺激と記録電極を配置します。
  14. クリックして"取得 |プロトコルを編集"し (ポップアップ ウィンドウ) の「トリガー」タブを選択します。トリガ ・ ソースとして「トリガ ・ ソース」ボックスと「スペースバー」を選択をクリックします。「OK」ボタンををクリックしてします。集録を開始し、トリガー ボタンでポップアップ ウィンドウを注意してください「レコード」ボタンをクリックします。
  15. 刺激アイソレータ ソフトウェアで「電圧制御」ボックスをクリックし、、"0"を入力してください。「ダウンロード」ボタンををクリックしてします。「ソフトウェアを記録」ウィンドウをクリックし、スペース バーを押します。「電圧制御」ボックスの 1 mV ステップには 1 から 8、たとえば、値を入力順にしてこのサイクルを繰り返します。
  16. FEPSP 勾配値と刺激強度の相関、fEPSP 斜面の 40% の最大値を得るために必要な刺激の強度を決定します。「電圧制御ボックス」をクリックし、、確定値を入力します。「ダウンロード」ボタンををクリックしてします。
    メモ: 刺激アイソレータは、脳組織に簡単な電圧または電流パルスを適用する使用されます。二相パルスは、フェーズごとに 100 μ 秒を持つことができます。
  17. レコーディング ソフトウェアで停止ボタンをクリックし、「獲得」メニューをクリックしてします。「プロトコルを編集」をクリックし、ポップアップ ウィンドウに"トリガー"タブを選択します。トリガ ・ ソースとしてトリガー ソース ボックスと「内部タイマー」を選択をクリックします。「OK」ボタンををクリックしてします。すべて 30 フィールド電位の自動記録を開始レコード ボタンをクリックしてたとえば s。30-60 分後に、"stop"ボタンをクリックします。
  18. 「取得」メニューをクリックし、「オープンなプロトコル、」をクリックして、シナプス可塑性の誘導が必要なプロトコルを選択し、"OK"ボタンをクリックしますします。高頻度刺激と記録を自動的にアクティブに「レコード」ボタンをクリックします。「停止」ボタンををクリックしてします。
    注: シナプス可塑性に関連する調査、場合長期増強や長期ベースライン録音後の長期不況の標準誘導パラダイムの一つを適用します。図 7と図 8にシナプス伝達の変調の代表例を示します。
  19. レコーディング ソフトウェアでクリックして"取得 |プロトコルを開き」、ステップ 4.12 のように同じプロトコルを選択します。"OK"ボタンをクリックし、「記録」をクリックたとえば、2-4 時間フィールドの潜在的な録音を自動的に実行してください。録音を終了する"stop"ボタンをクリックします。
  20. 化合物を適用医薬品研究の場合直接、アプライドに貯水池恒久的な化合物の管理がある場合希望 (図 6)。

5. セットアップとヒントをクリーニング

メモ: 以下の一般的なヒントをください。

  1. 毎週 10% H2O2脱イオン H2o. 洗浄後 20 分以上をリサイクルしてシステムをきれい
    注: エタノールはクリーニングのため推奨されません。同様に、参照線と H2O2で目的を浸すことは推奨していません。
  2. 対物レンズまたは 0.1 N HCl、水とチャンバ周囲の表面に沈殿した塩を削除します。
  3. 蒸留水または 0.1 N HCl でカーボゲン ・ バブラーを洗います。
  4. 10% H2O2 5 分でスライス培養室に週に一度を浸すし、脱イオン H2o ・ インキュベーション室を徹底的にリンス
  5. 金属刺激電極の場合各実験後脱イオン水で刺激電極先端部を洗うし、残留組織を除去し、エタノールに浸した綿球で刺激電極先端部を軽く拭きます。
  6. サンドペーパーで慎重な強打を先端の断熱材を削除することによって商業金属刺激電極の抵抗を減らします。
  7. ポリテトラフルオロ エチレン チューブとシリコン チューブを取り付け、チューブをリサイクルしながら、アプライドからカーボゲン ・の損失を減らします。
  8. 線材表面に塩化銀のフォームに漂白剤で数日間記録電極と参照電極の銀線を維持します。

結果

プロトコル セクションの男性 c57bl/6 マウスとラット (5-8 週間) の海馬 (図 1) の腹側と中間部分から急性海馬スライスの作製について述べる。スライサー プラットフォーム上半球の位置は、安定を保つのに役立ち、寒天やアガロースと安定化の必要性を削除します。灌流システム自体は液体の必要流量を与えるため高回転で作動、ペリスタルティ...

ディスカッション

インターフェイス スライス室より堅牢なシナプス応答25,26,27,28の展示物、水没室提供パッチ ・ クランプ記録および蛍光追加の利便性イメージング。したがって、我々 はフィールド ニューロン17,18、蛍光プローブのイメージングに簡単に拡張するこ...

開示事項

著者らは、調査した潜在的な利益相反として解釈される可能性が商業や金融関係の不在を宣言します。

謝辞

大戦実施、分析し実験を設計し、原稿を書いていた。D.X. と C.P. 図の準備を支援し、実験を行なった。この作品は、NSFC (31320103906) によって支えられたおよび結核 111 プロジェクト (B16013)

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Reagents required
NaClSinopharm Chemical Reagent, China10019318
KClSinopharm Chemical Reagent, China10016318
KH2PO4Sinopharm Chemical Reagent, China10017618
MgCl2·6H2OSinopharm Chemical Reagent, China10012818
CaCl2Sinopharm Chemical Reagent, China10005861
NaHCO3Sinopharm Chemical Reagent, China10018960
GlucoseSinopharm Chemical Reagent, China10010518
NaH2PO4Sinopharm Chemical Reagent, China20040718
HEPESSigmaH3375
Sodium pyruvateSigmaA4043
MgSO4Sinopharm Chemical Reagent, China20025118
NaOHSinopharm Chemical Reagent, China10019718
Tools and materials for dissection
DecapitatorsHarvard apparatus55-0012for rat decapitation
Bandage ScissorsSCHREIBER12-4227for mouse decapitation
double-edge bladeFlying Eagle, China74-C
IRIS ScissorsRWD, ChinaS12003-09
Bone RongeursRWD, ChinaS22002-14
SpoonHammacher HSN 152-13
dental cement spatulaHammacher HSN 016-15
dental double end excavatorBlacksmith Surgical, USABS-415-017
Vibrating MicrotomeLeica, GermanyVT1200S
surgical blade RWD, ChinaS31023-02
surgical holderRWD, ChinaS32007-14
Electrophysiology equipment and materials
Vertical Pipette PullerNarishige, JapanPC-10
Vibration isolation tableMeirits, JapanADZ-A0806
submerged type recording chamberWarner InstrumentsRC-26GLP
4 Axis MicromanipulatorSutter, USAMP-285, MP-225
Platinum WireWorld Precision InstrumentsPTP406
AmplifierMolecular Devices, USAMulticlamp 700B
Data Acquisition SystemMolecular Devices, USADigidata 1440A
Anaysis softwareMolecular Devices, USAClampex 10.2
Fluorescence MicroscopeNikon, JapanFN1
LED light sourceLumen Dynamics Group, CanadaX-cite 120LED
micropipettesHarvard apparatusGC150TFextracelluar recording
borosilicate micropipettesSutter, USABF150-86patch clamp
tungsten electrodeA-M Systems, USA575500
peristaltic pumpLonger, ChinaBT00-300T
tubes for peristaltic pumpISMATEC, Wertheim, GermanySC03091x inflow, ID: 1.02 mm
tubes for peristaltic pumpISMATEC, Wertheim, GermanySC03192x tubes for outflow, ID: 2.79 mm
CCD cameraPCO, Germanypco.edge sCMOS
lens cleaning paperKodak
50 mL conical centrifuge tubeThermo scientific339652
PrechamberWarner InstrumentsBSC-PC
Inline heaterWarner InstrumentsSF-28
Temperature ControllerWarner InstrumentsTC-324B

参考文献

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