纯化膜隔间跨演示文稿中的外源抗原内质网关联降解

摘要

这里介绍的方法是一种新的囊泡隔离协议，允许纯化细胞的车厢外源性抗原处理由内质网关联退化跨演示文稿中的地方。

摘要

树突状细胞 (Dc) 是高度能够处理和后主要组织相容性类 (MHC) 的内化外源抗原呈递我分子也被称为跨演示文稿 (CP)。CP 扮演重要的角色，不仅在天真 CD8 的刺激⁺ T 细胞和 CD8 记忆⁺ T 细胞的传染性，而且在自立式灭活肿瘤免疫 t 细胞的 T 细胞无能或 T 细胞删除。虽然 CP 的关键分子机制仍有待澄清，越来越多的证据表明外源抗原进行处理通过内质网关联降解 (ERAD) 后从非古典出口内吞隔间。直到最近，刻画这些细胞内吞的车厢都有限，因为有没有除了外源性抗原的特异分子标记。这里介绍的方法是一种新的囊泡隔离协议，允许纯化这些细胞内吞的车厢。我们使用此纯化的微粒，重组 ERAD 像运输、 泛素化和处理的外源性抗原体外，暗示泛素-蛋白酶体系统后从这出口加工外源性抗原细胞的隔间。该协议可以进一步应用于其他细胞类型以澄清 CP 的分子机制。

引言

MHC 我用内源性抗原，由泛素-蛋白酶体系统在胞浆¹处理短抗原肽表达上所有的有核细胞表面的分子。经处理后，抗原肽被送入内质网 (ER) 腔通过肽转运蛋白水龙头。在 ER 腔，一系列特定的分子伴侣的协助肽加载和正确折叠的 MHC I 复合。这一系列的分子称为肽加载复杂 (PLC)，指示 ER 车厢中部为肽加载在 MHC²。后加载，多肽 MHC 我分子被运送到细胞表面，在发挥关键作用自适应免疫系统自我标记，以及使 CD8⁺细胞毒性 T 淋巴细胞 (Ctl) 来检测癌细胞或传染性病原体的抗原从非自我蛋白质³肽。

在抗原提呈细胞 (APC)，从外源抗原的抗原肽也出示 MHC 我^{4，，56，7，8} 通过CP，其中主要进行由 DCs^9，，1011。CP 是必不可少的两个为激活天真 CD8⁺ T 细胞和 CD8 记忆⁺ T 细胞抗感染和抗肿瘤 Ctl^12，13，和在维持免疫耐受的失活自署理幼稚 T 细胞^14，15。CP 许多重要作用中自适应的免疫系统，然而 CP 的分子机制尚未予以详细说明。以前对 CP 的研究揭示了外源性抗原被本地化在急诊室和内体和通过 ERAD，暗示外源抗原从内体运到 ERAD 样加工和肽加载^{16 ER 进行处理}.然而，越来越多的证据表明 CP 的肽加载进行不在急诊室，而在于非经典的内吞车厢，也有特色的 ER (图 1)^{17，18 ，19，，2021}。通过来避免退化的抗原肽前体肽氨基肽酶活性较高²²胞液、 加工和多肽在 CP 中加载发生在近端地区的这些非经典的内吞车厢 (图 1)。虽然这些细胞内吞的车厢的刻画是有争议的没有现有的特定分子，除了这个包间的外源性抗原。

ERAD 是细胞通路，专门从急诊室中移除错误折叠的蛋白质。ERAD 通路中错误折叠的蛋白是逆行通过对细胞质 ER 膜运输和处理由泛素-蛋白酶体系统^23，，2425。大分子，比如蛋白质，运输时通过脂质双分子层，这些分子通过分子的装置称为解，如 Sec61 复杂和德林在 ER²⁶，和汤姆复杂复杂和蒂姆在复杂线粒体²⁷。当外部添加抗原是通过内质网膜，他们必须穿透脂质双分子层中复杂的 translocons，例如 Sec61 复杂。这里介绍的方法通过利用这些膜穿透的分子标志物在细胞内吞的隔间作为纯化有针对性的囊泡。

这里介绍的方法是一种新的使用作为外源性抗原的树突状细胞线 DC2.4²⁸和生物素化的卵清蛋白 （宝物） 的囊泡净化协议。内吞的车厢进行纯化的链霉亲和 (SA)-磁珠作为制造商使用膜穿透宝物。在这纯净的微粒，一些外部添加宝物仍保持膜组分中但被运到外面的微粒体，然后泛素化和处理体外²⁹。这纯净的微粒体载不仅吞隔间特异性蛋白二村居民蛋白质 ERAD 和肽加载复杂;建议细胞隔间 CP²⁹前瞻性吞车厢。本议定书依赖外源性抗原，这种并不是也适用于其他 DC 亚群和其他细胞类型，如巨噬细胞、 B 细胞和内皮细胞，以澄清精通 CP DCs 的精确分子机制。

研究方案

1.生长细胞与外源性抗原另外

1. 准备宝物使用生物素蛋白标记试剂盒随着制造商 ' s 协议。
   注意: 通常，宝物平均包含 2 M 生物素每 1 M OVA。
2. 成长 DC2.4 细胞在 RPMI 1640 辅以 2 毫米 L-谷氨酰胺、 丙酮酸钠 1 毫米、 0.1 毫米非必需氨基酸，100 U/mL 青霉素-链霉素、 2-巯基乙醇 55 毫米，10 毫米复 (pH 7.5)，10%胎牛血清 (以下简称 RPMI) 在 37 ° C 在 5%CO ₂ 在湿的孵化器 （以下简称未提及，细胞孵育在这种情况）。它也是可以使用辅以 3.7 g/L 碳酸氢钠 ₃ (以下简称 DMEM) 代替 RPMI 10%胎牛血清的 DMEM。
3. 提纯前, 一天，细胞分成 RPMI 细胞培养板 1 × 10 ⁵ 细胞/毫升。避免将存放在汇合状态细胞。DC2.4 细胞可以高度纳入外源性抗原直到半汇合的国家，但迅速达到过度汇合状态后失去能力。
4. 前 DC2.4 细胞半汇合，添加 250 微克/毫升的宝物为 1 x 10 ⁶ 细胞/毫升，孵育 2 4 h.
   注: 下游在试验期间，所有缓冲区及试剂均都保持 4 ° C 除非另有说明。

2。微粒的制备

1. 收获 DC2.4 细胞吹打温柔从组织板成一种新型的 50 毫升锥形管。
2. 在 1,000 x g 离心 5 分钟，4 ° C 和小心取出宝物的介质由志向。
3. 洗 DC2.4 细胞两次 40 毫升的 PBS 缓冲 (1.37 mM NaCl，8.1 毫米 Na ₂ HPO ₄，2.68 毫米 KCl，1.47 毫米 KH ₂ PO ₄) 在 1 5 分钟，4 ° C，x 000g 离心，弃上清每次吸入。
4. 重悬颗粒在步骤 2.3 在 1-2 毫升 （1/20-1/10 体积的培养基） 的均质介质 （0.25 M 蔗糖，1 毫米乙二胺四乙酸，10 毫米复-氢氧化钠 [pH 7.4]） 与 1/1,000 容量的蛋白酶抑制剂的鸡尾酒和转让再悬浮 DC2.4 细胞移植冰冷的 Dounce 均质机。
5. 破坏悬浮的 DC2.4 细胞轻轻由 10-20 笔画用冰冷的 Dounce 均质机。
   注意: 在中断步骤中，Dounce 均质机在冰上冷却
6. 转移到新的 15 毫升锥形管中细胞破坏悬浮。
7. 8 9 毫升同质化培养基添加 10 毫升总和离心 10 分钟 x g 2000 及 4 的锥形管 ° C.
8. 将上清液转移到新的 15 毫升锥形管，若要删除连续的细胞和细胞核，和离心机的锥形管再 10 分钟 x g 2000 及 4 ° C.
9. 上清液转移到新的离心管和离心机 45 分钟在 100000 x g 及 4 ° C.
10. 吸出上清液和悬小球仔细在 1-2 毫升的均质介质与 1/1,000 容量的蛋白酶抑制剂的鸡尾酒吹打数次，使下游实验的微粒分数解决方案。
11. 将微粒体部分转移到新 5 毫升圆底管。
    注: 此步骤完成后，有可能通过努力丰富客观微粒碘密度梯度离心法根据制造商 ' s 协议，删除非特定微粒体。对外源性抗原的峰值分数是收集，然后遭受净化 （步骤 3） 的下一步。

3。宝物的微粒净化术 ERAD

1. 添加 1/100 卷的新鲜 SA 磁珠步 2.11 在 5 毫升的微粒分数圆底管。
   注意: 在此步骤中之前, 有可能预先通过控制磁性微球，以减少非特定微粒污染物清除微粒分数。
2. 轻轻拌匀，旋转圆底管慢慢为 30 分钟，在 4 ° C.
3. 2-3 毫升的均质介质 4 毫升总成圆底管加上轻轻拌匀。
4. 将圆底管放在磁性表座和孵育 10 分钟在 4 ° c。由于绑定到囊泡的珠子都被磁铁吸引，棕色微珠便会逐渐积聚到管壁靠近磁铁。
5. 与管剩余的磁性的立场，认真上清液通过放弃愿望要删除未绑定的囊泡。
6. 洗磁珠绑定到两次用 5 毫升的均质介质囊泡的磁站 10 分钟在 4 ° C，弃上清，每次通过仔细的愿望。
   注: 无磁性的支架，通过在 2,000 x g 10 分钟洗涤净化 4 ° C 也是可用。
7. 重悬磁珠绑定到 100 µ L 均质介质中仔细囊泡吹打数次解决方案。
8. 中，再悬浮小泡将转入新的微管作为纯化微粒体下游实验。
   注意: 通常情况下，包含 5-20 微克蛋白质从 1 × 10 ⁷ 细胞的 50 µ L 微粒分数可以是孤立。

4。分析纯化微粒

1. 重磁悬珠绑定到囊泡从加强开展自评、 缓冲区的 100-200 微升 3.8 (20 毫米三 HCl pH 7.4，150 毫米氯化钠，0.5 M EDTA 1%Nonidet P-40) 与 1/1,000 容量的蛋白酶抑制剂的鸡尾酒而不是同质化介质。
2. 转移裂解步骤 4.1 到新 1.5 毫升捩。
3. 通过使用 BCA 试剂按制造商确定蛋白质浓度的步骤 4.2 ' s 协议。
   注意: 通常情况下，5-10 µ L 裂解液从步 4.2 就足以确定蛋白质浓度。
4. 转入裂解步骤 4.2 （的银染蛋白 2 微克和 10 微克的蛋白质印迹） 从新微细管。
5. 微细管放在 95 ° C 和煮蛋白 1 x SDS 凝胶加载缓冲区中的加热块 (100 毫米三 HCl pH 6.8，200 毫米醇，4%的 SDS，0.2%溴酚蓝，20%的甘油) 5 分钟
6. 离心 10 分钟 x g 21,500 和 4 微细管 ° C.收集上清液到新微细管来删除不溶性小数。
7. 分析步骤 4.6 （2 微克） 的标准 SD 页的解决的蛋白质。
8. 可视化蛋白条带的银染采用银染技术工具包之后制造商 ' s 协议。
9. 分析步骤 4.6 （10 微克） 的标准 SD 页和蛋白印迹的解决的蛋白质。按制造商使用试剂 (SA-HRP) ' s 协议和透视的照相机通过可视化。

5。在体外重构的 ERAD 泛素化的宝物使用纯化微粒体

1. 转让纯化微粒 （5-10 微克的蛋白） 从 50%体积的网织红细胞裂解液 (RL)，在 x 反应缓冲区 (50 毫米三 pH 7.4，3 毫米 ATP，0.5 毫米氯化镁 1 步 3.8₂)，和 12:02 下午旗子标记泛素新的微管。这个实验的最终数量是 20-40 微升。
2. 孵育 2 h 37 微 ° C.
   注意: 如果步骤 5.12 中泛素化宝物量太小，免疫印迹法检测，添加 MG132 10 μ M 或随着由蛋白酶体抑制的泛素化宝物处理 2 μ M。
3. 阻止通过放置在冰上的微反应
4. 解决微粒体加入 500 µ L 开展自评、 缓冲区 1/1,000 量的蛋白酶抑制剂的鸡尾酒。
5. 微管离心机以离心 10 分钟 21,50x g 和 4 0 ° C.收集上清液到新的微管，要删除的不溶性的分数，包含在 DC2.4 前测定 体外 泛素化的泛素化宝物。
6. 将上清液转移到新的微管和添加新 SA-磁珠 （通常为 500 µ L 的上清液 5 μ） 的 1/100 卷。
7. 轻轻拌匀，慢慢为 30 分钟微圆管内旋转在 4 ° C.
8. 离心 10 分钟 x g 21,500 和 4 微 ° C.Discard 的渴望恢复的宝物和泛素化宝物上清绑定与 SA 磁珠。
9. 洗两次收集的 SA-磁珠与 1ml 上层缓冲液离心 10 分钟 x g 21,500 和 4 ° C.丢弃每次吸上清液。
10. 煮 1 x SDS 凝胶缓冲液 5 分钟在 95 ° C 加热块以 SA 磁珠解决纯化的蛋白对 SA-磁珠。
11. 离心 10 分钟 x g 21,500 和 4 微 ° C.收集上清液到新的微管，要删除的不溶性的分数。
12. 分析绑定到蛋白质的标准 SD 页和蛋白印迹 SA 磁珠。使用抗体 （抗旗、 反-多-Ub 和抗鼠 IgG HRP） 和试剂 （SA-辣根过氧化物酶） 是按制造商 ' s 协议和可视化的透视的照相机。

结果

为了阐明 CP 的分子机制，是有必要确定细胞的隔间，外源抗原在哪里接受 ERAD 样运输和加工。虽然通过免疫荧光显微镜或电子显微镜的观察确定外源抗原在那里积累^{16，17，，1819，细胞室 30，，31}

讨论

在以往研究中的 CP，注册外源抗原在禁区的晚体膜或 ER 通过免疫荧光显微镜^{16，30，，3132}积累。据估计在这些专业领域的 ER 或晚体膜进行 ERAD 样运输和加工的外源性抗原细胞室是由蔗糖或碘密度梯度离心法分离使用标识泛素化作为一种 ERAD 样处理标记的宝物。后刺激他们先天免疫，CP 效率显著提高，...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI 1640	gibco by life technologies	11875-093
Fetal bovine serum	Equitech bio	SFB30
Sodium pyruvate	gibco by life technologies	11360-070
MEM non-essential amino acids	gibco by life technologies	11140-050
HEPES	gibco by life technologies	15630-080
2-mercaptoethanol	gibco by life technologies	21985-023
L-glutamine	gibco by life technologies	25030-164
Penisicillin-Sreptomycin	gibco by life technologies	15140-122
DMEM	gibco by life technologies	12100-46
OVA	SIGMA	A5503
Biotin-protein labelling kit	Thermo Fisher Scientific	F6347
MG-132	Santa Cruz Biotechnology	201270
lactacystin	SIGMA	L6785
Dounce homogenizer	IUCHI	131703
protease inhibitor cocktails	SIGMA	P8340
iodixanol	Cosmo bio	1114542
SA-magnetic beads	New England Biolabs	201270
control magnetic beads	Chemagen	M-PVA012
magnetic stand	BD Biosciences	552311
BCA protein assay kit	Thermo Fisher Scientific	23225
silver staining kits	Cosmo bio	423413
Reticulocyte Lysate	Promega	1730714
Flag-tagged ubiquitin	SIGMA	U5382
anti-ovalbumin (OVA,mouse)	Antibody Shop	HYB 094-06
ant-multi-ubiquitin (mouse)	MBL	D058−3
anti-Flag (mouse)	SIGMA	F3165
trypsin	SIGMA	85450C