АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Метод, описанный здесь — это новый Протокол изоляции везикул, который позволяет для очистки сотовой отсеков, где Экзогенные антигены обрабатываются эндоплазматического ретикулума связаны деградация в кросс презентации.

Аннотация

Дендритные клетки (DCs) весьма способны обработки и представления интернализированных Экзогенные антигены класса гистосовместимости (MHC) я молекулы также известный как крест презентация (CP). CP играет важную роль не только в стимуляции наивно CD8+ T памяти CD8 клетки и+ T-клеток для инфекционных и опухоли иммунитета, но и в инактивации автоматической наивно T клетки Т-клеток анергия или удаления Т-клеток. Хотя критические молекулярный механизм CP предстоит быть выяснены, накапливая свидетельствуют, что Экзогенные антигены обрабатываются через эндоплазматического ретикулума связаны деградация (ERAD) после экспорта из Неклассические endocytic отсеков. До недавнего времени, характеристики этих endocytic отсеков были ограничены, потому что там было без конкретных молекулярных маркеров помимо Экзогенные антигены. Метод, описанный здесь — это новый Протокол изоляции везикул, который позволяет для очистки этих endocytic отсеков. Используя этот очищенный микросомы, мы восстановленный ERAD-как транспорт, ubiquitination и обработки экзогенных антигена в пробирке, предполагая, что убиквитин протеасом системы обработки экзогенных антигена после экспорта из этого Сотовый отсек. Этот протокол может применяться в других типах клеток для уточнения молекулярный механизм CP.

Введение

MHC I молекулы выражаются на поверхности всех ядерных клеток, с короткие антигенные пептиды, производный от эндогенные антигены, которые обрабатываются системой убиквитин протеасом в цитозоль1. После обработки, антигенные пептиды переносятся в эндоплазматический ретикулум (ER) просвета пептида перевозчика крана. В просвете ER ряд конкретных сопровождающих помочь загрузки пептидной и правильный складывающиеся MHC I комплекс. Эта серия молекул называется загрузки пептидной комплекс (PLC), указав, что ER является центральный отсек для пептида, загрузки на MHC2. После загрузки, пептид MHC I молекулы переносятся на поверхности клеток и играть ключевую роль в адаптивной иммунной системы как самостоятельной маркеры и позволяет CD8+ цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL) для выявления раковых клеток или инфекционные агенты по антигенной пептиды от белков несамоуправляющихся3.

В антиген представляющих клеток (APC), антигенные пептиды из Экзогенные антигены, также представлены на MHC4,5,6,,78 через CP, который осуществляется главным образом по DCs9,10,11. CP имеет важное значение как для активации наивно CD8+ T памяти CD8 и клетки+ T клеток в борьбе с инфекционными и анти опухолевых ЦТЛ12,13и в поддержании иммунной толерантности путем инактивации из автоматическими наивные Т-клеток14,15. CP играет много важных ролей в адаптивной иммунной системы, однако молекулярных механизмов CP еще должны быть подробно описаны. Предыдущие исследования CP показали, что Экзогенные антигены были локализованы в ER и endosome и были обработаны ERAD, предполагая, что Экзогенные антигены транспортируются от endosome ER для обработки ERAD-как и пептида загрузки16 . Однако накапливая данные свидетельствуют, что загрузки пептидной CP осуществляется не в ER, но скорее в неклассической endocytic отсеках, которые также имеют отличительные черты ER (рис. 1)17,18 ,19,,2021. Чтобы избежать деградации антигенные пептиды прекурсоров, высокой активности aminopeptidase22 в цитозоле, обработки и пептида, погрузка в CP происходит в области проксимальных этих Неклассические endocytic отсеков (рис. 1). Хотя характеристики этих endocytic отсеками являются спорными, есть нет существующих конкретных молекул помимо Экзогенные антигены в этом отсеке.

ERAD является сотовой путь, который специально удаляет смятых протеинов от ER. В ERAD пути смятых протеинов retrogradely транспортируются через мембраны ER в цитоплазму и обработаны убиквитин протеасом системы23,24,25. Когда большие молекулы, такие как белки, транспортируются через липидный бислой, эти молекулы проходят через молекулярные аппарат, под названием translocon, как Sec61 комплекс и Дерлена комплекс в ER26и том комплекс и Тим комплекс в Митохондрии27. При экзогенно Добавлено антигены перевозятся через мембрану ER, они должны проникнуть липидного бислоя в комплексе с translocons, например Sec61 комплекс. Метод, описанный здесь очищенного целевых везикул, используя эти мембраны проникновение молекул как маркеры для endocytic отсеков.

Метод, описанный здесь-это новый протокол очистки пузырек с помощью DC-подобных клеток линии DC2.428 и биотинилированным овальбумина (Бова) как экзогенные антигена. Endocytic отсеках были очищены по стрептавидина (SA)-магнитные шарики с помощью мембраны проникая Бова как производитель. В этом очищенная микросомы, некоторые экзогенно добавлены Бова до сих пор сохранились в мембраны фракций, но были перевезены в наружной части микросомы, а затем убиквитинированных и обрабатываются в vitro29. Это очищенный микросомы содержатся не только endocytic отсек специфических белков, но и ER-резидентов белков для ERAD и пептида, Загрузка комплекса; предположить, что отсеке сотовой перспективных endocytic отсек для CP29. Этот протокол не зависит от вида Экзогенные антигены и применяется также для других подмножеств DC и другие типы клеток, макрофагов, лимфоцитов и эндотелиальных клеток, уточнить точный молекулярный механизм DCs для опытным CP.

протокол

1. рост клетки и добавлением Экзогенные антигены

  1. подготовить Бова, с помощью биотин белка маркировки комплект после производитель ' протокол s.
    Примечание: Обычно, Бова содержит биотина 2 М на 1 М OVA среднем.
  2. Клетки растут DC2.4 в RPMI 1640 с 2 мм L-глютамином, пируват натрия 1 мм, 0,1 мм заменимые аминокислоты, 100 ед/мл пенициллин стрептомицином, 2-меркаптоэтанол 55 мм, 10 мм HEPES (рН 7,5) и 10% плода телячьей сыворотки (далее RPMI) при 37 ° C в 5 % CO 2 в увлажненные инкубатора (далее без упоминания, клетки инкубируют в это условие). Это также можно использовать с 10% плода телячьей сыворотки, 3,7 г/Л NaHCO 3 (далее DMEM) вместо RPMI DMEM.
  3. В день до очистки, разбить ячейки на RPMI до 1 x 10 5 клеток/мл в пластине культуры ткани. Избегайте клеток в состоянии вырожденная. DC2.4 клетки могут весьма включать Экзогенные антигены до полу вырожденная государства, но быстро теряют способность после достижения состояния чрезмерного притока.
  4. Перед DC2.4 клетки полу вырожденная, добавить 250 мкг/мл Бова для 1 х 10 6 клеток/мл и проинкубируйте 2-4 ч.
    Примечание: Во время вниз по течению экспериментов, все буферы и реагенты хранятся при температуре 4 ° C Если не указано иное.

2. Подготовка микросом

  1. урожая DC2.4 клеток, нежный дозирование из ткани пластины в новой 50 мл Конические трубки.
  2. Центрифуг в 1000 x g за 5 мин., 4 ° C и тщательно удалить носитель с Бова стремлением.
  3. Мыть DC2.4 клетки дважды с 40 мл буфера (1.37 мм NaCl, 8,1 мм Na 2 HPO 4, 2.68 мм KCl, 1.47 мм х 2 PO 4) PBS центрифугированием на 1000 x g за 5 мин., 4 ° C и удалить супернатант каждый раз путем аспирации.
  4. Ресуспензируйте гранул на шаге 2.3 в 1-2 мл (1/20-1/10 объема питательной среды) гомогенизации среды (0,25 М сахарозы, 1 мм ЭДТА, 10 HEPES-NaOH [рН 7,4]) с объемом 1/1000 коктейли ингибитор протеазы и передачи ресуспензированы DC2.4 клеток в ледяной Dounce гомогенизатора.
    5. Мягко
  5. нарушить ресуспензированы DC2.4 клеток на 10-20 ударов с ледяной гомогенизатор Dounce.
    Примечание: Во время шага нарушения, Dounce гомогенизатор охлаждается на льду
  6. Передать новой 15 мл Конические трубки подвеска клеток нарушена.
  7. Добавить средне гомогенизации 8-9 мл по 10 мл общее и центрифуги Конические трубки для 10 мин на 2000 x g и 4 ° C.
  8. Передача супернатант новой 15 мл Конические трубки для удаления непрерывной клетки и ядер и центрифуги Конические трубки снова за 10 мин на 2000 x g и 4 ° C.
  9. Передачи супернатант в новой ultracentrifugation трубки и центрифуги для 45 мин на 100,000 x g и 4 ° C.
  10. Аспирационная супернатант и Ресуспензируйте гранулы тщательно в 1-2 мл гомогенизации среды с объемом 1/1000 коктейлей ингибитора протеазы, закупорить решение вверх и вниз несколько раз, чтобы сделать малую микросомы по течению экспериментов.
  11. Передачи микросомы фракция в новый раунд внизу 5-мл трубку.
    Примечание: После этого шага, это позволяет обогатить объективных микросом, iodixanol плотность градиентного центрифугирования по заявлению производителя ' протокол s, чтобы удалить неспецифической микросом. Пик фракций для Экзогенные антигены собираются и затем подвергается следующим шагом очистки (шаг 3).

3. Очистка микросом с Бова переживает ERAD

  1. Добавить 1/100 объем свежего SA-магнитные бусы на долю микросомы шаг 2.11 в 5 мл круглая труба внизу.
    Примечание: Перед этот шаг, это можно предварительно очистить микросомы фракции путем управления магнитные бусы для уменьшения загрязнений неспецифической микросом.
  2. Нежно хорошо перемешать и вращать круглым дном трубки медленно, в течение 30 мин на 4 ° C.
  3. Добавить 2-3 мл среды гомогенизации в 4 мл всего в трубу круглым дном и осторожно перемешайте.
  4. Труба круглая снизу на магнитного стенд и проинкубируйте втечение 10 мин при 4 ° C. Так как бусы, обязан пузырьки притягиваются к магниту, коричневый микро бусы постепенно накапливаются к стенке трубки, ближайший к магниту.
  5. С трубки оставшихся в магнитного стенд, тщательно отбросить supernatants путем аспирации для удаления несвязанных везикулы.
  6. Мыть, магнитные бусы, привязанного к везикулы дважды с 5 мл гомогенизации среды с магнитной стоять 10 мин при температуре 4 ° C и удалить супернатант каждый раз тщательно стремлением.
    Примечание: Без магнитного стенд, очищение, centrifugations на 2000 x g за 10 мин., 4 ° C также доступен.
  7. Ресуспензируйте магнитные бусы, привязанного к везикулы тщательно в 100 мкл гомогенизации среде с дозирование раствора вверх и вниз несколько раз.
  8. Передачи ресуспензированы везикулы в новой Микропробирка как очищенная микросомы для вниз по течению экспериментов.
    Примечание: Как правило, 50 мкл микросомы фракция 5-20 мкг белков от 1 x 10-7 клетки могут быть выделены.

4. Анализ микросом очищенный

  1. Ресуспензируйте магнитной бусины, обязан везикулы от шаг 3,8 на 100-200 мкл буфера TNE (20 мм трис-HCl рН 7,4, 150 мм NaCl, ЭДТА 0,5 М, 1% Nonidet P-40) объемом 1/1000 коктейлей ингибитор протеазы Вместо того, чтобы средний гомогенизации.
  2. Передачи lysate от шаг 4.1 новый 1,5 мл микропробирок.
  3. Определить концентрацию белка шаг 4.2, используя набор пробирного BCA на производителя ' протокол s.
    Примечание: Как правило, 5-10 мкл lysate шаге 4.2 является достаточно, чтобы определить концентрацию белка.
  4. Передача lysate от шага 4.2 (2 мкг белка для Серебряные пятная и 10 мкг белка для западный blotting) в новый пробирок.
  5. Поставить пробирок на блоке тепла на 95 ° C и кипения белков в 1 x SDS гель загрузки буфера (100 мм трис-HCl pH 6.8, 200 мм Дитиотреитол, SDS 4%, 0,2% бромфеноловый синий, 20% глицерина) для 5 минут
  6. Центрифуга для пробирок Эппендорф, для 10 минут, 21 500 x g и 4 ° C. собирать supernatants в новые пробирок для удаления нерастворимых фракций.
  7. Анализа решена белков в шаге 4.6 (2 мкг), Стандартная SD-страница.
  8. Визуализация белка полосы серебром, окрашивание с помощью Серебряные пятная комплекта после производителя ' протокол s.
  9. Анализ решена белков в шаге 4.6 (10 мкг) стандартные SD-страницы и Западный blotting. Используйте реагент (SA-ПХ) на производителя ' s протокол и визуализировать, флюорография.

5. В пробирке Восстановление ERAD Ubiquitination Бова с использованием очищенного микросом

микросом (5-10 мкг белка)
  1. передачи, очищенного от шаг 3,8 объемом 50% ретикулоцитов lysate (RL), 1 x буфер реакции (50 мм трис рН 7,4, 3 мм АТФ, 0.5 мм MgCl 2) и 0: 2 вечера с тегами Флаг убиквитин в новом микропробирок. Окончательный объем этого эксперимента является 20-40 мкл.
  2. Инкубировать Микропробирка 2 ч при 37 ° с.
    Примечание: Если количество убиквитинированных Бова шаге 5.12 слишком мал для обнаружения Западный blotting, добавить 10 мкм MG132 или 2 мкм lactacystin подавлять обработки убиквитинированных Бова, протеасом.
  3. Остановить реакции, поместив Микропробирка на ДВС.
  4. Решить микросом, добавив 500 мкл TNE буфер объемом 1/1000 коктейлей ингибитора протеазы.
  5. Центрифуг Микропробирка 10 мин на 21,500 x g и 4 ° C. собирать supernatants в новой Микропробирка для удаления нерастворимых фракций, которые содержат Бова убиквитинированных в DC2.4 перед в vitro ubiquitination assay.
  6. Передача супернатант новой Микропробирка и добавить 1/100 объем новых SA-магнитные бусы (обычно 5 мкл для 500 мкл supernatants).
  7. Осторожно перемешать и вращать Микропробирка медленно, в течение 30 мин в 4 ° C.
  8. Центрифуга Микропробирка 10 мин на 21 500 x g и 4 ° C. Discard супернатант стремлением восстановить Бова и убиквитинированных Бова связаны с SA-магнитные бусы.
  9. Мыть дважды собранных SA-магнитные бусы с 1 мл буфера TNE центрифугированием на 10 минут, 21 500 x g и 4 ° C. удалить супернатант каждый раз путем аспирации.
  10. Варить SA-магнитные шарики в 1 x гель SDS загрузки буфера для 5 мин при 95 ° C на тепло блок решить очищенные белки SA-магнитные бусы.
  11. Центрифуга Микропробирка 10 мин на 21 500 x g и 4 ° C. собирать supernatants в новой Микропробирка для удаления нерастворимых фракций.
  12. Анализ SA-магнитные бусы, связаны с белками стандартные SD-страницы и Западный blotting. Использование антител (анти флаг, анти multi-Ub и анти мыши IgG-ПХ) и реагента (SA-ПХ) составляет производителя ' протокол s и визуализированное флюорография.

Результаты

Для выяснения молекулярный механизм CP, это необходимо для выявления клеточных отсеков, где Экзогенные антигены пройти ERAD-как транспорта и обработки. Хотя замечания immunofluorescent микроскопии или электронной микроскопии выявлены сотовой отсек, где Экзогенные антигены нак?...

Обсуждение

В предыдущих исследованиях CP включены Экзогенные антигены накопленных в запретной зоне конце endosome или ER immunofluorescent микроскопии16,30,,3132. Предполагается, что ERAD-как транспорта и обработки Экзогенные антигены осуществля?...

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Эта работа поддерживается Такасаки университет здравоохранения и социального обеспечения.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
RPMI 1640gibco by life technologies11875-093
Fetal bovine serumEquitech bioSFB30
Sodium pyruvategibco by life technologies11360-070
MEM non-essential amino acidsgibco by life technologies11140-050
HEPESgibco by life technologies15630-080
2-mercaptoethanolgibco by life technologies21985-023
L-glutaminegibco by life technologies25030-164
Penisicillin-Sreptomycingibco by life technologies15140-122
DMEMgibco by life technologies12100-46
OVASIGMAA5503
Biotin-protein labelling kitThermo Fisher ScientificF6347
MG-132 Santa Cruz Biotechnology201270
lactacystin SIGMAL6785
Dounce homogenizerIUCHI131703
protease inhibitor cocktails SIGMAP8340
iodixanol Cosmo bio1114542
SA-magnetic beads New England Biolabs201270
control magnetic beadsChemagenM-PVA012
magnetic standBD Biosciences552311
BCA protein assay kitThermo Fisher Scientific23225
silver staining kitsCosmo bio423413
Reticulocyte LysatePromega1730714
Flag-tagged ubiquitin SIGMAU5382
anti-ovalbumin (OVA,mouse)Antibody ShopHYB 094-06
ant-multi-ubiquitin (mouse)MBLD058−3
anti-Flag (mouse)SIGMAF3165
trypsinSIGMA85450C

Ссылки

  1. van Endert, P. Providing ligands for MHC class I molecules. Cell Mol Life Sci. 68 (9), 1467-1469 (2011).
  2. Janeway, C., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. . Immunobiology: The Immune System in Health and Disease. , (2001).
  3. McDevitt, H. O. Discovering the role of the major histocompatibility complex in the immune response. Annu Rev Immunol. 18 (1), 1-17 (2000).
  4. Bedoui, S., et al. Cross-presentation of viral and self antigens by skin-derived CD103+ dendritic cells. Nat Immunol. 10 (5), 488-495 (2009).
  5. Segura, E., Villadangos, J. A. Antigen presentation by dendritic cells in vivo. Curr Opin Immunol. 21 (1), 105-110 (2009).
  6. Cheong, C., et al. Microbial stimulation fully differentiates monocytes to DC-SIGN/CD209(+) dendritic cells for immune T cell areas. Cell. 143 (3), 416-429 (2010).
  7. Henri, S., et al. CD207+ CD103+ dermal dendritic cells cross-present keratinocyte-derived antigens irrespective of the presence of Langerhans cells. J Exp Med. 207 (2), 189-206 (2010).
  8. Shortman, K., Heath, W. R. The CD8+ dendritic cell subset. Immunol. Rev. 234 (1), 18-31 (2010).
  9. Carbone, F. R., Kurts, C., Bennett, S. R., Miller, J. F., Heath, W. R. Cross-presentation: a general mechanism for CTL immunity and tolerance. Immunol Today. 19 (8), 368-373 (1998).
  10. Nair-Gupta, P., Blander, J. M. An updated view of the intracellular mechanisms regulating cross-presentation. Front Immunol. , (2013).
  11. Joffre, O. P., Segura, E., Savina, A., Amigorena, S. Cross-presentation by dendritic cells. Nat Rev Immunol. 12 (8), 557-569 (2012).
  12. Kurts, C., et al. Constitutive class I-restricted exogenous presentation of self antigens in vivo. J Exp Med. 184 (3), 923-930 (1996).
  13. Kurts, C., Kosaka, H., Carbone, F. R., Miller, J. F., Heath, W. R. Class I-restricted cross-presentation of exogenous self-antigens leads to deletion of autoreactive CD8(+) T cells. J Exp Med. 186 (2), 239-245 (1997).
  14. Bonifaz, L., et al. Efficient targeting of protein antigen to the dendritic cell receptor DEC-205 in the steady state leads to antigen presentation on major histocompatibility complex class I products and peripheral CD8+ T cell tolerance. J Exp Med. 196 (12), 1627-1638 (2002).
  15. Heath, W. R., Carbone, F. R. Cross-presentation in viral immunity and self-tolerance. Nat Rev Immunol. 1 (2), 126-134 (2001).
  16. Imai, J., Hasegawa, H., Maruya, M., Koyasu, S., Yahara, I. Exogenous antigens are processed through the endoplasmic reticulum-associated degradation (ERAD) in cross-presentation by dendritic cells. Int Immunol. 17 (1), 45-53 (2005).
  17. Houde, M., et al. Phagosomes are competent organelles for antigen cross-presentation. Nature. 425 (6956), 402-406 (2003).
  18. Guermonprez, P., et al. ER-phagosome fusion defines an MHC class I cross-presentation compartment in dendritic cells. Nature. 425 (6956), 397-402 (2003).
  19. Burgdorf, S., Scholz, C., Kautz, A., Tampe, R., Kurts, C. Spatial and mechanistic separation of cross-presentation and endogenous antigen presentation. Nat Immunol. 9 (5), 558-566 (2008).
  20. Lizée, G., et al. Control of dendritic cell cross-presentation by the major histocompatibility complex class I cytoplasmic domain. Nat Immunol. 4 (11), 1065-1073 (2003).
  21. Basha, G., et al. A CD74-dependent MHC class I endolysosomal cross-presentation pathway. Nat Immunol. 13 (3), 237-245 (2012).
  22. Saveanu, L., Carroll, O., Hassainya, Y., van Endert, P. Complexity, contradictions, and conundrums: studying post-proteasomal proteolysis in HLA class I antigen presentation. Immunol Rev. 207 (1), 42-59 (2005).
  23. Wiertz, E. J., et al. Sec61-mediated transfer of a membrane protein from the endoplasmic reticulum to the proteasome for destruction. Nature. 384 (6608), 432-438 (1996).
  24. Hampton, R. Y. ER-associated degradation in protein quality control and cellular regulation. Curr Opin Cell Biol. 14 (4), 476-482 (2002).
  25. Tsai, B., Ye, Y., Rapoport, T. A. Retro-translocation of proteins from the endoplasmic reticulum into the cytosol. Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (4), 246-255 (2002).
  26. Nyathi, Y., Wilkinson, B. M., Pool, M. R. Co-translational targeting and translocation of proteins to the endoplasmic reticulum. Biochim Biophys Acta. 1833 (11), 2392-2402 (2013).
  27. Varabyova, A., Stojanovski, D., Chacinska, A. Mitochondrial protein homeostasis. IUBMB Life. 65 (3), 191-201 (2013).
  28. Shen, Z., Reznikoff, G., Dranoff, G., Rock, K. L. Cloned dendritic cells can present exogenous antigens on both MHC class I and class II molecules. J Immunol. 158 (6), 2723-2730 (1997).
  29. Imai, J., Otani, M., Sakai, T., Hatta, S. Purification of the subcellular compartment in which exogenous antigens undergo endoplasmic reticulum-associated degradation from dendritic cells. Heliyon. , (2016).
  30. Kovacsovics-Bankowski, M., Rock, K. L. A phagosome-to-cytosol pathway for exogenous antigens presented on MHC class I molecules. Science. 267 (5195), 243-246 (1995).
  31. Ackerman, A. L., Giodini, A., Cresswell, P. A role for the endoplasmic reticulum protein retro translocation machinery during cross presentation by dendritic cells. Immunity. 25 (4), 607-617 (2006).
  32. Ackerman, A. L., Kyritsis, C., Tampé, R., Cresswell, P. Early phagosomes in dendritic cells form a cellular compartment sufficient for cross presentation of exogenous antigens. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (22), 12889-12894 (2003).
  33. Saveanu, L., et al. IRAP identifies an endosomal compartment required for MHC class I cross-presentation. Science. 325 (5937), 213-217 (2009).
  34. Zehner, M., et al. The translocon protein Sec61 mediates antigen transport from endosomes in the cytosol for cross-presentation to CD8(+) T cells. Immunity. 42 (5), 850-863 (2015).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

126Itranslocon

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены