외 인 항 원 십자가-프레 젠 테이 션에의 바인딩과 그물 관련 성능 저하 막 구획의 정화

요약

여기에 설명 된 메서드는 exogenous 항 바인딩과 그물 관련 저하 크로스-프레 젠 테이 션에 의해 처리 됩니다 세포질 구획의 정화에 대 한 수 있는 새로운 소포 격리 프로토콜입니다.

초록

수지상 세포 (Dc)는 고도의 처리 및 중요 한 조직 적합성 클래스 (MHC)에 따라 내 면된 외 인 항 원 제시의 나 분자 라고 크로스-프레 젠 테이 션 (CP). CP는 중요 한 역할 뿐만 아니라 순진한 CD8 자극⁺ T 세포와 CD8 메모리⁺ T 세포에 대 한 감염 및 self-acting의 비활성화에 뿐만 아니라 종양 면역 naïve T 세포 T 세포 아 또는 T 셀 삭제. CP의 중요 한 분자 메커니즘 해명 될 남아, 비록 축적 증거가 나타냅니다 exogenous 항 저하를 통해 떠다니고 그물 관련 (ERAD) 비 클래식에서 수출 후 endocytic 처리 됩니다. 구획입니다. 최근까지, 외 인 항 원 이외의 아무 특정 분자 마커 있었기 때문에 이러한 endocytic 구획의 characterizations을 제한 했다. 여기에 설명 된 메서드는 이러한 endocytic 구획의 정화에 대 한 수 있는 새로운 소포 격리 프로토콜입니다. 이 순화 microsome 사용 하 여, 우리 재구성 ERAD 같은 전송, ubiquitination, 및 처리는 외 인 항 원에 체 외에, 유비퀴틴-프로테아좀 시스템 수출이 후 외 인 항 원 처리 제안 세포질 구획입니다. 이 프로토콜은 CP의 분자 메커니즘을 명확 하 게 다른 세포 유형에 더 적용할 수 있습니다.

서문

MHC I 분자 cytosol¹에서 유비퀴틴-프로테아좀 시스템에 의해 처리 되는 내 인 성 항에서 파생 하는 짧은 항 원 펩 티 드와 모든 nucleated 세포의 표면에 표현 된다. 처리 후, 항 원 펩 티 드 펩 티 드 운송업 자 탭에 의해 바인딩과 그물 (응급실) 루멘으로 이송 됩니다. ER의 루멘에서 일련의 특정 보호자 펩 티 드 로드 하 고 올바른 접는 MHC의 나 복잡 한 지원 합니다. 분자의이 시리즈는 펩 티 드 로드 복잡 한 (PLC), 응급실 펩 티 드 나²MHC에 적재에 대 한 중앙 구획을 나타내는 이라고 합니다. 후에 펩 티 드, 로드는 MHC I 분자 세포 표면에 수송 하 고 핵심적인 역할을 담당할 적응 면역 시스템에 자기 마커, 그리고 수는 CD8⁺ 세포 독성 T 세포 (Ctl) 암 세포 또는 전염 성 요원을 항 원에 의해 ³비 각자 단백질 펩 티 드.

항 원 제시 세포 (APC), 외 인 항에서 항 원 펩 티 드에서는 또한 내가^4,5,6,,78 통해 CP, 주로 수행 MHC 시 제시 의해 Dc^9,,1011. CP는 필수⁺ T 순진한 CD8의 활성화를 위한 둘 다 세포와 CD8 메모리⁺ T 세포의 비활성화에 의해 안티 전염 성 및 안티-종양 Ctl^12,13, 그리고 면역 관용의 유지 보수에 자기 행동 naïve T 세포^14,15. 그러나 CP CP의 분자 기계 장치는 아직 자세히 설명 될 적합 한 면역 계통에 많은 중요 한 역할을 재생 합니다. CP의 이전 연구 밝혔다 exogenous 항 모두 응급실에는 endosome 현지 했다 ERAD, ERAD 같은 처리 및 펩 티 드^{16 로드에 대 한 응급실에 외 인 항 원은 endosome에서 이송은 제안 처리} . 그러나, 축적 증거가 나타냅니다 응급실에서 아닙니다 그러나 오히려 응급실 (그림 1)^{17,18의 독특한 기능을가지고 아닌 클래식 endocytic 구획 밖으로 CP의 펩 티 드 로드 수행 ,19,,2021}. Aminopeptidase의 높은 활동에 의해 항 원 펩 티 드 선구자의 저하를 방지 하려면²² cytosol, 처리 및 CP에서 로드 하는 펩 티 드에이 아닌 클래식 endocytic 구획 (그림 1)의 인접 지역에서 발생 합니다. 이러한 endocytic 구획의 characterizations 논란이 있지만, 이외에 외 인 항 원이이 구획에 없는 기존 특정 분자 있다.

ERAD는 세포질 통로, 특히 응급실에서 misfolded 단백질을 제거 하는. ERAD 경로에 misfolded 단백질 retrogradely ER 막 세포질을 통해 운반 되며 유비퀴틴-프로테아좀 시스템^23,,2425처리. 큰 분자, 단백질, 등 지질 bilayer를 통해 수송 된다,이 분자를 통과에 복잡 한 복잡 한 Sec61 및 Derlin ER²⁶, 그리고 복잡 한 톰에 복잡 한 팀 같은 translocon 라는 분자 장치는 미토 콘 드리 아²⁷ 것 추가 항 ER 막 통해 수송 된다, 그들은 translocons, Sec61 복합 등으로 복잡 한 지질 bilayer를 관통 하 게 해야 합니다. 여기 설명 하는 방법을 endocytic 구획에 대 한 표식으로이 막 관통 분자를 이용 하 여 타겟된 기를 정화.

여기에 설명 된 방법은 외 인 항 원으로는 DC 같은 셀 선 DC2.4²⁸ 와 biotinylated ovalbumin (bOVA)를 사용 하 여 새로운 기 정화 프로토콜입니다. Endocytic 구획 streptavidin (SA)에 의해 순화 되었다-자석 구슬 메이커로 막 관통 bOVA를 사용 하 여. 이 순화 microsome 일부 것 추가 bOVA 여전히 막 분수에 보존 되었다 하지만 microsome, 및 다음 ubiquitinated의 외부에 이송 되었고 처리²⁹ 생체 외에서. 이 순화 microsome endocytic 구획 특정 단백질 뿐만 아니라 ER-상주 단백질 ERAD 및 펩 티 드 복잡 한; 로드 포함 세포질 구획 CP²⁹에 대 한 예비 endocytic 구획 제안. 이 프로토콜은 exogenous 항 원의 종류에 따라 그리고 다른 DC 하위 집합 및 다른 세포 유형, 대 식 세포, B 세포, 내 피 세포, 등 실력 CP에 대 한 Dc의 정확한 분자 메커니즘을 명확 하 게 적용 됩니다.

프로토콜

1. 성장 세포와 외 인 항 원 추가

biotin 단백질 라벨을 사용 하 여

1. 준비 bOVA 키트 제조 업체에 따라 ' s 프로토콜.
   참고: 일반적으로, bOVA 포함 2 M biotin 1 M OVA 당 평균.
2. 성장 DC2.4 셀 RPMI-1640 2mm L-글루타민, 1mm 나트륨 pyruvate, 0.1 m m 불필요 한 아미노산, 100 U/mL 페니실린-스, 55 m m 2-mercaptoethanol, 10 mM HEPES (pH 7.5), 및 5에서 37 ° C에서 10% 태아 종 아리 혈 청 (여기서 부터는 RPMI)와 보충 습도 인큐베이터에서 % CO ₂ (이 언급 없이 세포는 인 큐베이 팅이 조건에서). 그것은 또한 DMEM 10% 태아 종 아리 혈 청 RPMI 대신 NaHCO ₃ (여기서 부터는 DMEM) 3.7 g/L 보충을 사용 하 여.
3. 주 정화, 전에 분할 RPMI의 셀 사용 하 여 조직 문화 접시에 1 x 10 ⁵ 셀/ml. Confluent 상태에서 세포를 유지 하지 마십시오. DC2.4 셀 매우 반 confluent 상태로까지 외 인 항 원을 통합할 수 있지만 빠르게 오버 합칠 상태에 도달 후 능력을 잃고.
4. DC2.4 전에 세포는 반 confluent 1 x 10 ⁶ 셀/ml bOVA의 250 µ g/mL을 추가 하 고 2-4 헤에 대 한 품 어
   참고: 다운스트림 실험 동안 모든 버퍼 및 시 약 보관 4 ° C에서 달리 명시 하지 않는 한.

2. Microsomes의 준비

1. 새 50 mL 원뿔 관으로 조직 접시에서 부드러운 pipetting으로 DC2.4 세포를 수확.
2. 5 분, 4 ° C 1000 x g에서 원심 분리기와 포부에 의해 bOVA와 매체를 조심 스럽게 제거.
3. DC2.4 셀 1000 x g 5 분, 4 ° C에서 원심 분리 하 여 PBS 버퍼 (1.37 m m NaCl, 8.1 m 나 ₂ HPO ₄, 2.68 m KCl, 1.47 m m KH ₂ 포 ₄ m m)의 40 mL로 두 번 세척 하 고 상쾌한 포부에 의해 때마다 삭제.
4. Resuspend 단계 2.3에서 1-2에서에서 펠 릿 mL (문화 매체의 1/20-1/10 볼륨) 프로 테아 제 억제 물 칵테일 및 전송 resuspended DC2.4의 1/1000 양으로 균질 매체 (0.25 M 자당, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES-NaOH [pH 7.4])의 세포에 얼음 처럼 차가운 Dounce 균질 화기.
5. 차가운 Dounce 균질 화기와 10-20 스트로크에 의해 resuspended DC2.4 세포를 부드럽게 중단.
   참고: 중단 단계 동안 Dounce 균질 화기는 냉각 얼음에
6. 새 15 mL 원뿔 튜브 셀 중단 중지 전송.
7. 10 ml 총 8-9 mL 균질 매체를 추가 하 고 원뿔 튜브 2000 g x 4에서 10 분 원심 ° c.
8. 새 15 mL 원뿔 튜브 손상 되지 않은 세포와 핵, 제거 하는 상쾌한 전송 및 2000 g x 4에서 10 분 동안 다시 원뿔 튜브 원심 ° c.
9. 새로운 ultracentrifugation 튜브와 g x 100000 및 4에서 45 분 동안 원심 분리기에는 상쾌한 전송 ° c.
10. 는 상쾌한 발음 하 고 다운스트림 실험 microsome 분수를 만들기 위해 여러 번 위아래 솔루션 pipetting으로 펠 릿 프로 테아 제 억제 물 칵테일의 1/1000 양으로 균질 매체의 1-2 mL에 신중 하 게 resuspend.
11. 새 5 mL 둥근 바닥 관으로 microsome 분수 전송.
    참고:이 단계 후에 그것은 제조 업체에 따르면 iodixanol 밀도 그라데이션 원심 분리에 의해 객관적인 microsomes을 풍부 하 게 ' s 프로토콜, 일반적인 microsomes를 제거 하려면. 외 인 항 원에 대 한 피크 분수 및 수집한 다음 정화 (3 단계)의 다음 단계로 들어서는.

3. BOVA와 Microsomes의 정화를 받고 ERAD

microsome 분수의 단계 2.11 5 mL

1. 신선한의 추가 1/100 볼륨 SA 자석 구슬 원형 하단 튜브.
   참고:이 단계를 하기 전에 그것은 미리 microsome 분수를 줄이기 위해 일반적인 microsomes의 오염 제어 자석 구슬에 의해 취소.
2. 부드럽게 잘 혼합 하 고 4 시 30 분 동안 천천히 라운드 하단 튜브를 회전 ° c.
3. 라운드 하단 튜브에 총 4 mL에 균질 매체의 2-3 mL를 추가 하 고 부드럽게 잘 섞어.
4. 라운드 하단 튜브 마그네틱 스탠드에 놓고 4 ° c.에서 10 분 동안 품 어 이후는 소포에 바인딩된 구슬 자석에 끌리는, 갈색 마이크로 구슬 점차적으로 자석에 가장 가까운 튜브 벽에 축적 됩니다.
5. 튜브와 함께 신중 하 게 언바운드 소포를 제거 하는 열망에 의해 여 supernatants를 버리고 마그네틱 스탠드에 남아.
6. 자석 구슬 자석에 의해 균질 매체의 5 mL로 두 번 소포에 바인딩된 워시 4 ° C에서 10 분 서 하 고 신중 하 게 열망 하 여는 상쾌한 때마다 삭제.
   참고: 마그네틱 스탠드, 10 분, 2000 x g에서 centrifugations에 의해 정화 없이 4 ° C는 또한 사용할 수.
7. 자석 구슬 몇 번 위아래로 솔루션 pipetting 100 µ L 균질 매체에 신중 하 게 소포를 준수할 resuspend.
8. 다운스트림 실험에 대 한 정화 microsome로 새로운 microtube에 resuspended 소포 전송.
   참고: 일반적으로, 1 x 10 ⁷ 셀에서 5-20 µ g 단백질을 포함 하는 50 µ L microsome 분수 고립 될 수 있다.

4. 순화 Microsomes의 분석

1. Resuspend 자석 구슬에서 소포에 바인딩된 TNE 버퍼의 100-200 µ L 3.8 단계 (20 mM Tris HCl pH 7.4, 150 m m NaCl, 0.5 M EDTA, 1% Nonidet P-40) 프로 테아 제 억제 물 칵테일의 1/1000 볼륨 균질 매체 대신.
2. 는 lysate에서 전송 단계 4.1 새로운 1.5 mL microtube.
3. 제조 업체 당 BCA 분석 결과 키트를 사용 하 여 단계 4.2의 단백질 농도 결정 ' s 프로토콜.
   참고: 일반적으로 5-10 µ L 단계 4.2에서에서 lysate 단백질 농도 결정 하기 위해 충분 하다.
4. 는 lysate에서 전송할 단계 (실버 얼룩에 대 한 단백질의 2 µ g 및 서쪽에 게 더 럽 히기를 위한 단백질의 10 µ g) 4.2 새로운 microtubes.
5. SDS 겔-로딩 버퍼 x 1에서 95 ° C와 종 단백질에서 열 블록에 있는 microtubes를 넣어 (100 mM Tris HCl pH 6.8, 200 m m dithiothreitol, 4 %SDS, 0.2 %bromophenol 블루, 20% 글리세롤) 5 분에 대 한
6. 21500 g x 4에서 10 분 동안 microtubes 원심 ° C. 불용 성 부분을 제거 하는 새로운 microtubes에 있는 supernatants 수집.
7. 단계 4.6 (2 µ g) 표준 SD-페이지에서 해결된 단백질 분석.
8. 시각화 실버 얼룩은 얼룩을 사용 하 여 단백질 밴드 키트 제조 업체에 따라 ' s 프로토콜.
9. 표준 SD-페이지와 서 부 럽 4.6 (10 µ g) 단계에서 확인 된 단백질 분석. 시 약 (SA-HRP)를 사용 하 여 제조 업체 당 ' s 프로토콜 및 fluorography에 의해 시각화.

5. 생체 외에서 BOVA 사용 하 여 정화 Microsomes의 ERAD Ubiquitination의 재구성

단계 3.8 reticulocyte lysate (RL)의 50% 볼륨으로 반응 버퍼 (50 mM Tris pH 7.4, 3mm ATP, 0.5 m m MgCl x 1에서에서

1. 이전에 순화 microsomes (5-10 µ g 단백질) ₂), 그리고 새로운 microtube에 플래그 태그 유비퀴틴 오후 0 시 2 분. 이 실험의 최종 볼륨은 20-40 µ L.
2. 품 37에서 2 h microtube ° C.
   참고: 단계 5 월 12 일에서에서 ubiquitinated bOVA 양의 서쪽 blotting에 의해 감지 너무 작으면, 추가 10 µ M의 MG132 또는 proteasomes에 의해 ubiquitinated bOVA의 처리를 억제 하는 lactacystin의 2 µ M.
3. 얼음에 microtube 배치 하 여 반응을 중지
4. 는 microsomes 프로 테아 제 억제 물 칵테일의 1/1000 양으로 500 µ L TNE 버퍼를 추가 하 여 해결.
5. 21,50에서 10 분 원심 분리기는 microtubeg와 4 x는 0 ° c.에 생체 외에서 ubiquitination 분석 결과 전에 DC2.4에서 ubiquitinated bOVA 포함 하는 불용 성 부분을 제거 하는 새로운 microtube는 supernatants 수집.
6. 는 상쾌한 새로운 microtube 전송과 새로운 SA 자석 구슬 (일반적으로 5 µ L supernatants의 500 µ L에 대 한)의 1/100 볼륨 추가.
7. 부드럽게 잘 혼합 하 고 30 분 동안 천천히 microtube 4 회전 ° c.
8. Microtube 21500 g x 4에서 10 분 원심 ° C. 삭제 bOVA 및 ubiquitinated bOVA 열망 하 여 상쾌한 바운드 SA 자석 구슬.
9. TNE 버퍼의 1 mL와 함께 두 번 수집된 사 자석 구슬 21500 g x 4에서 10 분 동안 원심 분리 하 여 세척 ° C. 삭제 상쾌한 포부에 의해 각 시간.
10. SA 자성 구슬에 의해 순화 된 단백질을 해결 하기 위해 열 블록에 95 ° C에서 5 분에 대 한 버퍼를 로드 하는 SDS 젤 x 1에 SA 자석 구슬 종.
11. Microtube 21500 g x 4에서 10 분 원심 ° C에 불용 성 부분을 제거 하는 새로운 microtube는 supernatants 수집.
12. 분석 표준 SD-페이지 및 서쪽 더 럽 히는 단백질에 준수할 SA 자석 구슬. (안티, 안티-멀티-Ub, 깃발과 반대로 마우스 IgG HRP) 항 체 및 시 약 (SA-HRP)의 사용은 제조 업체 당 ' s 프로토콜 및 fluorography에 의해 시각.

결과

CP의 분자 메커니즘을 명료 하 게 그것은 exogenous 항 ERAD와 같은 전송 및 처리를 받아야 세포질 구획을 식별 하는 데 필요한. Immunofluorescent 현미경 또는 전자 현미경 관찰 어디 외 인 항 원^{16,,1718,19, 축적 된 세포질 구획을 확인 하는 동안 3...}

토론

CP의 이전 연구에서 통합된 외 인 항 원 immunofluorescent 현미경 검사 법^16,30,,3132에 의해 늦은 endosome 또는 응급실의 제한 된 영역에서 축적 된. 세포질 구획은 자당 또는 iodixanol 조밀도 기온 변화도 원심 분리를 사용 하 여 식별 되는 ERAD와 같은 전송 및 외 인 항 원 처리 수행 됩니다 응급실 또는 늦은 endoso...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI 1640	gibco by life technologies	11875-093
Fetal bovine serum	Equitech bio	SFB30
Sodium pyruvate	gibco by life technologies	11360-070
MEM non-essential amino acids	gibco by life technologies	11140-050
HEPES	gibco by life technologies	15630-080
2-mercaptoethanol	gibco by life technologies	21985-023
L-glutamine	gibco by life technologies	25030-164
Penisicillin-Sreptomycin	gibco by life technologies	15140-122
DMEM	gibco by life technologies	12100-46
OVA	SIGMA	A5503
Biotin-protein labelling kit	Thermo Fisher Scientific	F6347
MG-132	Santa Cruz Biotechnology	201270
lactacystin	SIGMA	L6785
Dounce homogenizer	IUCHI	131703
protease inhibitor cocktails	SIGMA	P8340
iodixanol	Cosmo bio	1114542
SA-magnetic beads	New England Biolabs	201270
control magnetic beads	Chemagen	M-PVA012
magnetic stand	BD Biosciences	552311
BCA protein assay kit	Thermo Fisher Scientific	23225
silver staining kits	Cosmo bio	423413
Reticulocyte Lysate	Promega	1730714
Flag-tagged ubiquitin	SIGMA	U5382
anti-ovalbumin (OVA,mouse)	Antibody Shop	HYB 094-06
ant-multi-ubiquitin (mouse)	MBL	D058−3
anti-Flag (mouse)	SIGMA	F3165
trypsin	SIGMA	85450C