外因性の抗原クロス プレゼンテーション内の小胞体関連分解膜コンパートメントの精製

要約

ここで説明する方法は、外因性の抗原クロス プレゼンテーションで小胞体関連分解によって処理される細胞コンパートメントの浄化は、新しい小胞の分離プロトコルです。

要約

樹状細胞 (Dc) は、主要組織適合抗原 (MHC) クラスに内面化された外因性抗原の提示や画像処理能力が高く、私分子として知られているクロス プレゼンテーション (CP)。CP は⁺ T ナイーブ CD8 の刺激だけでなく、重要な役割を果たしている細胞とメモリー CD8⁺ T 細胞の感染と動圧の不活性化にも腫瘍免疫ナイーブ T 細胞、T 細胞アネルギーや T 細胞削除。CP の重要な分子機構になって、蓄積された証拠を示すことが外因性の抗原は小胞体関連分解 (ERAD) 非古典からエクスポート後エンドサイトーシスを介して処理されます。コンパートメント。最近まで、外因性の抗原以外の特定の分子マーカーがなかったので、これらのエンドサイトーシスのコンパートメントの特徴は限られていた。ここで説明する方法は、これらのエンドサイトーシスのコンパートメントの浄化では、新しい小胞の分離プロトコルです。この精製微粒体を使用して、我々 再構成 ERAD のようなトランスポート、ユビキチン化、および外因性抗原の体外、処理ユビキチン-プロテアソーム システムがこれからの輸出後外因性抗原を処理することを示唆しています。細胞内コンパートメント。このプロトコルは、CP の分子機構を明らかにする他の細胞型にさらに適用できます。

概要

MHC 私分子すべての有核細胞の表面に細胞質¹ユビキチン-プロテアソーム システムによって処理される内因性抗原由来抗原ペプチドを発現しています。処理後、抗原ペプチドは、ペプチド輸送体タップで小胞体 (ER) の内腔に運ばれます。小胞体内腔に特定シャペロンのシリーズは、ペプチドの読み込みと、フォールディング MHC I の複合体を支援します。分子のこのシリーズは、小胞体、ペプチドを MHC に私²の読み込みのため中央のコンパートメントであることを示すペプチド負荷複合体 (PLC) と呼ばれます。読み込み、ペプチッド MHC 後私分子細胞表面に運ばれ、キーとして役割を果たす適応免疫系の自己のマーカー、および CD8 を有効に⁺細胞傷害性 T リンパ球 (Ctl) がん細胞や感染性病原体を検出する抗原によって³非自己蛋白質由来ペプチド。

抗原提示細胞 (APC)、外因性の抗原の抗原性ペプチドもいる^4,5,6,7,8 経由でCP、主に運ばれる私 MHC に提示で Dc^9,10,11。CP が不可欠であるナイーブ CD8⁺ T の活性化のための両方セルとメモリ CD8 の不活化による⁺ T 細胞の免疫寛容の維持、抗感染症、抗腫瘍 Ctl^12,13に自己演技ナイーブ T 細胞^14,15。CP は、CP の分子メカニズムがまだ詳細に記載する適応免疫系の多くの重要な役割を果たしています。外因性の抗原が小胞体と、エンドソームの両方にローカライズされ、外因性の抗原がエンドソームから ERAD のような処理とペプチド^{16 の読み込みの小胞体に輸送されることを示唆している、ERAD で処理された CP の以前の研究で明らかに}.しかし、蓄積された証拠は、小胞体ではなく、ER (図 1)^{17,18 の特徴がまたある非古典的エンドサイトーシス コンパートメントではなく CP のペプチド読み込みの実施を示します ,,1920,21}。アミノペプチダーゼの高活性で抗原ペプチド前駆体の劣化を避けるためにこれらの非古典的エンドサイトーシス コンパートメント (図 1) の近位領域に細胞質、処理およびペプチドの CP で読み込みで²²が発生します。これらのエンドサイトーシスのコンパートメントのキャラクタリゼーションが物議を醸すが、この区画で外因性の抗原以外の既存の特定の分子があります。

ERAD です具体的には小胞体からタンパク質を除去する細胞経路です。ERAD 経路の誤って折りたたまれたタンパク質は細胞質に小胞体膜を経由、ユビキチン-プロテアソーム システム^23,24,25によって処理される逆行性。これらの分子が通過 Sec61 複合体とデルリン²⁶ER と複雑なトムの複雑なティムなど、透過装置を複合体と呼ばれる分子装置、タンパク質などの大きな分子は脂質二重膜を輸送の際、ミトコンドリア²⁷。外追加抗原は、小胞体膜を通じて転送されます、彼らは Sec61 複合体などの translocons との複合体の脂質二重膜を貫通する必要があります。ここで説明する方法は、エンドサイトーシスのコンパートメントのためのマーカーとしてこれらの膜貫通分子を利用してターゲットを絞った小胞を精製しました。

ここで説明する方法は、外因性抗原として DC のような細胞ライン DC2.4²⁸とビオチン化アルブミン (bOVA) を使用して新しい小胞浄化プロトコルです。エンドサイトーシスのコンパートメントにより精製されたストレプトアビジン (SA)-磁気ビーズ メーカーとして膜貫通ボーヴァを使用します。この精製のミクロゾームで外因 bOVA 膜画分でまだ維持されたが、ミクロソームとし、ユビキチンの外側に運搬・処理を追加いくつかの in vitro²⁹。この精製ミクロゾーム ERAD とペプチド複合体での読み込みのエンドサイトーシスのコンパートメントに固有のタンパク質だけでなく、小胞体のタンパク質に含まれるCP²⁹将来エンドサイトーシス コンパートメントを細胞内コンパートメントには示唆しています。このプロトコルは、外因性の抗原の種類に依存しない、また他 DC サブセットおよび他の細胞型、マクロファージ、B 細胞、内皮細胞など熟練した CP の Dc の正確な分子機構を明らかにするために適当。

プロトコル

1 細胞の成長および外因性抗原添加

ビオチンはタンパク質ラベリングを使用して

1. 準備 bOVA キット次の製造元 ' s プロトコル。
   。 注: 通常、bOVA 含まれています 1 M OVA あたり 2 M ビオチン平均します
。
2. 55 mM 2-メルカプトエタノール、10 mM HEPES (pH 7.5) と 5 の 37 ° C で 10% ウシ胎仔血清 (以下 RPMI) 100 U/mL ペニシリン-ストレプトマイシン 0.1 mM 必須でないアミノ酸 2 mM L グルタミン 1 mM ピルビン酸ナトリウム添加 RPMI 1640 年に成長 DC2.4 細胞加湿のインキュベーターで % CO ₂ (以下、言及せず細胞に孵化するこの条件で)。10% 牛胎児血清、3.7 g/L NaHCO ₃ (以下 DMEM) RPMI 代わりに DMEM を使用する可能です
。
3. A 浄化、前日 RPMI 1 × 10 ⁵ セル/ml 培養プレートに、セルを分割しました。コンフルエントの状態で細胞を保つことは避けてください。DC2.4 細胞ことができます高半コンフルエントの状態まで外因性の抗原を組み込むが急速に過剰合流状態に到達した後の能力を失う
。
4. 前に、DC2.4 細胞は半合流、1 x 10 ⁶ セル/mL の bOVA の 250 μ g/mL を追加し、2-4 h. インキュベート
   注意: 下流の実験の間にすべてのバッファーと試薬が保管 4 ° C で特に明記しない限り
。

2。ミクロソームの準備

1. 新しい 50 mL の円錐管に組織プレートから穏やかなピペッティングによる DC2.4 細胞を収穫します
。
2. 1,000 x g で 4 ° C、5 分間遠心吸引により bOVA の中を慎重に取り外します.
3. 40 mL の PBS バッファー (1.37 mM NaCl、8.1 mM Na ₂ HPO ₄、2.68 ミリメートル KCl、1.47 mM KH ₂ PO ₄) 5 分、4 ° C の 1,000 × g で遠心分離によって、2 回 DC2.4 細胞を洗浄し、吸引するたびに上澄みを廃棄します
。 手順 2.3 で 1-2 でペレットを再懸濁します
4. mL (1/20-1/10 培地量) プロテアーゼ阻害剤のカクテルと転送再懸濁 DC2.4 の 1/1,000 ボリュームと均質化媒体 (0.25 M ショ糖, 1 mM EDTA、10 mM HEPES NaOH [Ph7.4]) の細胞に、冷たい Dounce ホモジナイザー
。
5. 中断再懸濁 DC2.4 細胞優しく冷たい Dounce ホモジナイザーと 10-20 ストロークで
   。 注: 停止手順の間に氷で冷却は Dounce ホモジナイザー
6. セル中断の懸濁液を新しい 15 mL の円錐管に転送します
。
7. 10 mL 合計に 8-9 mL 均質媒体を追加し、2,000 g x と 4 で 10 分の円錐形の管を遠心分離機 ° C
8. 上清を新しい 15 mL の円錐管を切れ目のない細胞や核を削除するに転送し、g x 2,000 と 4 で 10 分間のために再度円錐管を遠心分離機 ° C
9. 新しい遠心チューブに 100,000 g x と 4 の 45 分の遠心上清を転送 ° C
10. 、上清を吸引し、ピペッティングを上下に数回下流実験用微粒体の一部分をするソリューションによってプロテアーゼ阻害剤カクテルの 1/1,000 ボリュームと均質媒体の 1-2 mL で慎重にペレットを再懸濁します
。
11. は、新しい 5 mL 丸底チューブに微粒体の一部分を移す
    。 注: この手順の後ことはメーカーによれば iodixanol 密度勾配遠心による客観的ミクロソームを豊かに ' s プロトコル、非特異的ミクロソームを削除します。外因性の抗原のピーク画分を収集し、浄化 (ステップ 3) の次のステップを受ける
。

3。ボーヴァとミクロソームの浄化を受けて ERAD

ステップ 2.11 5 mL 中の微粒体の一部分に

1. 追加 1/100 新鮮な量 SA 磁気ビーズ ラウンド底部チューブ
   。 注: この手順の前にそれは事前非特異的ミクロソームの汚染を減らすために制御磁気ビーズによる微粒体の一部分を消去することです
。
2. 優しく混ぜるし、4 で 30 分間ゆっくりと丸底チューブを回転させて ° C
3. 丸底チューブに 4 mL 合計に均質媒体の 2-3 mL を追加し、そっと混ぜる
。
4. マグネット スタンドの丸底チューブを置き、4 ° C で 10 分間インキュベート小胞にバインドされているビーズは磁石に引き付けられる、ので茶色のマイクロ ビーズが磁石に最も近い管壁に徐々 に蓄積されます
。
5. チューブとマグネット スタンドに残って慎重に培養上清によって破棄非連結の小胞を削除する吸引
。
6. 磁気によって均質媒体の 5 mL で 2 回小胞にバインドされた磁気ビーズ洗浄 4 ° C で 10 分間立って、慎重に吸引のたびに滅菌蒸留水します
   。 注: 磁気スタンド、10 分間 2,000 × g で遠心により精製なし 4 ° C もあり
。
7. 100 μ L の均質化の中で慎重に小胞を上下に数回ソリューションをピペッティングによってバインドされる磁気ビーズを再懸濁します
。
8. は、下流の実験用精製微粒体として新しいチューブに再懸濁の小胞を転送します
   。 注: 通常、1 x 10 の ⁷ セルから 5-20 μ g 蛋白質を含んでいる 50 μ L ミクロゾーム画分に分離できます
。

4。精製ミクロソームの解析

磁気再懸濁します
1. ビーズから小胞にステップ 3.8 TNE バッファーの 100-200 μ L (20 mM トリス塩酸 pH 7.4 では、150 mM の NaCl、0.5 M の EDTA、1% ノニデット P-40) プロテアーゼ阻害剤カクテルの 1/1,000 ボリュームと均質媒体の代わりにします
。
2. ライセート手順 4.1 から新しい 1.5 mL のマイクロ チューブに転送します
。
3. は、メーカーごとの BCA アッセイ キットを使用してステップ 4.2 のタンパク質濃度を測定 ' s プロトコル
   。 注: 通常、5-10 μ L ステップ 4.2 から溶解液は、タンパク質の濃度を測定するのに十分です
。
4. ステップ 4.2 (銀製の汚損のための蛋白質の 2 μ g と西部にしみが付くことのための蛋白質の 10 μ g) から新しいチューブにライセートを転送します
。
5. X SDS ゲル読み込みバッファー 1 で 95 ° C そして沸騰のタンパク質で熱ブロック、チューブを入れて (100 mM トリス塩酸 pH 6.8, 200 mM 4 %sds ジチオトレイトール 0.2% ブロモフェノールの青、20% グリセロール) 5 分
6. G x 21,500 と 4 で 10 分間のチューブを遠心分離機 ° C は、不溶性画分を削除する新しいマイクロ チューブに培養上清を収集します
。
7. 4.6 (2 μ g) 標準的な SD ページの手順で解決の蛋白質を分析します
。
8. 可視化銀の銀染色などによる汚損でタンパク質のバンドが次のメーカー キット ' s プロトコル
。
9. は、標準的な SD のページおよび西部のしみが付くことによって 4.6 (10 μ g) の手順で解決の蛋白質を分析します。メーカーごとに試薬 (SA-HRP) を使用 ' s プロトコルし、透視によって視覚化
。

5。体外ボーヴァを使用して精製したミクロソームの ERAD ユビキチン化の再構成

1. 転送、精製ミクロゾーム (5-10 μ g のタンパク質) ステップ 3.8 網状赤血球ライセート (RL) の 50% のボリュームの反応バッファー (50 mM トリス pH 7.4 では、ATP、3 mM 0.5 mM MgCl x 1₂) と新しいチューブ 12:02 フラグ タグ ユビキチン。この実験の最終巻は 20-40 μ L.
2. 加温 37 で 2 時間チューブ ° C
   注: ウェスタンブロッテイングにより検出する手順 5.12 でユビキチン bOVA の量が小さすぎる場合は MG132 の 10 μ M またはプロテアソーム、ユビキチン bOVA の処理を抑制するラクタシスチンの 2 μ M 追加します
。
3. 氷にチューブを配置することによって反応を停止
4. プロテアーゼ阻害剤カクテルの 1/1,000 ボリュームを 500 μ L の TNE バッファーを追加して、ミクロソームを解決します
。
5. 21,50 で 10 分間遠心したマイクロ チューブg と 4 x 0 ° C は 体外 ユビキチン化アッセイ前に、DC2.4 でユビキチン ボーヴァを含む不溶性画分を削除する新しいチューブに培養上清を収集します
。
6. 上清を新しいチューブに転送し、新しい SA 磁気ビーズ (通常 500 μ L の培養上清を 5 μ L) の 1/100 ボリュームを追加します
。
7. 優しく混ぜるし、4 で 30 分間ゆっくりとチューブを回転 ° C
8. 21,500 g x と 4 で 10 分間のチューブを遠心分離機 ° c. 破棄ボーヴァとユビキチン ボーヴァを回復する吸引による SA 磁気ビーズのバインドします
。
9. 21,500 g x と 4 で 10 分間遠心分離によって収集 SA-磁性体ビーズ TNE バッファーの 1 mL を 2 回を洗う ° c. 破棄清吸引するたびにします
。
10. SA 磁気ビーズによって浄化された蛋白質を解決する熱ブロック 95 ° C で 5 分間 SDS ゲル x 1 の SA 磁気ビーズを沸騰します
。
11. G x 21,500 と 4 で 10 分間のチューブを遠心分離機 ° C は、不溶性画分を削除する新しいチューブに培養上清を収集します
。
12. は、標準的な SD のページおよび西部のしみが付くことによって、タンパク質に結合 SA 磁気ビーズを分析します。抗体 (抗フラグ、アンチ-マルチ-Ub と抗マウス IgG HRP) および試薬 (SA-HRP) の使用は、メーカーごと、' s プロトコル透視により可視化されたと
。

結果

CP の分子機構を解明するには、外因性の抗原が ERAD のようなトランスポートと処理を受ける細胞のコンパートメントを識別するために必要です。蛍光顕微鏡や電子顕微鏡による観察は、外因性の抗原は累積^{1918,16,17、}、^{、細胞内コンパートメントを識?...}

ディスカッション

CP の以前の研究で法人の外因性の抗原は蛍光顕微鏡観察^16,30,31,32後期エンドソーム小胞体の制限区域に蓄積。ERAD のようなトランスポートおよび外因性抗原の処理は ER または後期エンドソームのこれらの専門分野の運ばれている推定されて細胞内コンパートメントは蔗糖あるいは iodixanol 密度勾配...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI 1640	gibco by life technologies	11875-093
Fetal bovine serum	Equitech bio	SFB30
Sodium pyruvate	gibco by life technologies	11360-070
MEM non-essential amino acids	gibco by life technologies	11140-050
HEPES	gibco by life technologies	15630-080
2-mercaptoethanol	gibco by life technologies	21985-023
L-glutamine	gibco by life technologies	25030-164
Penisicillin-Sreptomycin	gibco by life technologies	15140-122
DMEM	gibco by life technologies	12100-46
OVA	SIGMA	A5503
Biotin-protein labelling kit	Thermo Fisher Scientific	F6347
MG-132	Santa Cruz Biotechnology	201270
lactacystin	SIGMA	L6785
Dounce homogenizer	IUCHI	131703
protease inhibitor cocktails	SIGMA	P8340
iodixanol	Cosmo bio	1114542
SA-magnetic beads	New England Biolabs	201270
control magnetic beads	Chemagen	M-PVA012
magnetic stand	BD Biosciences	552311
BCA protein assay kit	Thermo Fisher Scientific	23225
silver staining kits	Cosmo bio	423413
Reticulocyte Lysate	Promega	1730714
Flag-tagged ubiquitin	SIGMA	U5382
anti-ovalbumin (OVA,mouse)	Antibody Shop	HYB 094-06
ant-multi-ubiquitin (mouse)	MBL	D058−3
anti-Flag (mouse)	SIGMA	F3165
trypsin	SIGMA	85450C