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Resumo

O método descrito aqui é um novo protocolo de isolamento de vesículas, que permite a purificação dos compartimentos celulares onde os antígenos exógenos são processados pelo retículo endoplasmático associado a degradação em cruz-apresentação.

Resumo

Células dendríticas (DCs) são altamente capazes de processar e apresentar antígenos exógenos interiorizados a classe principal de histocompatibilidade (MHC) moléculas também conhecido como Cruz-apresentação (CP). CP desempenha um papel importante não só na estimulação de ingênuo CD8+ T memória CD8 e células+ T células para infecciosas e imunidade de tumor, mas também na inativação de auto-agente ingênuo T células por células T anergy ou supressão de células T. Embora o mecanismo molecular crítico da CP continua a ser elucidado, acumula evidências indicam que antígenos exógenos são processados através de retículo endoplasmático associado degradação (ERAD) após a exportação do não-clássica endocítica compartimentos. Até recentemente, caracterizações desses compartimentos endocítica limitavam-se porque não havia nenhum marcadores moleculares específicos além de antígenos exógenos. O método descrito aqui é um novo protocolo de isolamento de vesículas, que permite a purificação desses compartimentos endocítica. Usando esta purificada do microsome, nós reconstituído a ERAD, como transporte, ubiquitination e processamento do antígeno exógeno em vitro, sugerindo que o sistema ubiquitina-Proteassoma processado o antígeno exógeno após exportação deste compartimento celular. Este protocolo pode ser mais aplicado a outros tipos de células para esclarecer o mecanismo molecular da CP.

Introdução

O MHC moléculas são expressas na superfície de todas as células nucleadas, com curtos peptídeos antigênicos derivados de antígenos endógenos, que são processados pelo sistema ubiquitina-Proteassoma no citosol1. Após o processamento, peptídeos antigênicos são transportados para o lúmen do retículo endoplasmático (ER) pelo transportador peptídeo TAP. No lúmen do ER, uma série de acompanhantes específicos auxiliar o carregamento do peptide e o dobramento correto do MHC complexo eu. Esta série de moléculas é chamado o complexo peptídeo-carregamento (PLC), indicando que o ER é um compartimento central para peptídeo carregando em cima do MHC eu2. Depois de peptídeo de carregamento, o MHC moléculas são transportadas à superfície da célula e desempenhar um papel fundamental no sistema imune adaptativo como marcadores auto e habilita o CD8+ linfócitos T citotóxicos (CTLs) para detectar células cancerosas ou agentes infecciosos por antigênica peptídeos de proteínas não-auto3.

Em células apresentadoras de (APC), peptídeos antigênicos de antígenos exógenos são também apresentados em MHC eu4,5,6,7,8 através do CP, que é realizada principalmente por DCs9,10,11. CP é essencial tanto para a ativação do ingênuo CD8+ T memória CD8 e células+ T células em anti-infecciosos e anti-tumoral CTLs12,13e na manutenção da tolerância imunológica pela inactivar de auto interino ingênuo T células14,15. O CP desempenha muitos papéis importantes no sistema imune adaptativo, porém os mecanismos moleculares de CP tem ainda que ser descrita em pormenor. Estudos anteriores de CP revelaram que antígenos exógenos foram localizados no pronto-socorro e o endossomo e foram processados por ERAD, sugerindo que antígenos exógenos são transportados desde o endossomo ao pronto-socorro para a ERAD, como processamento e peptídeo carregando16 . No entanto, acumula evidências indicam que o carregamento do peptide do CP é realizado, não no PS, mas sim em compartimentos endocítica não-clássica, que também têm características distintivas do ER (Figura 1)17,18 ,19,20,21. Para evitar a degradação dos precursores de peptídeo antigênico pela alta atividade de aminopeptidase22 no citosol, processamento e peptídeo carregando no CP ocorre na região proximal desses compartimentos endocítica não-clássica (Figura 1). Embora as caracterizações desses compartimentos endocítica são controversas, não há nenhuma molécula de específica existente além de antígenos exógenos neste compartimento.

ERAD é uma via celular, que especificamente remove proteínas misfolded da emergência. Na via da ERAD, misfolded proteínas retrogradely são transportadas através da membrana de ER para o citoplasma e processadas pelo sistema da ubiquitina-Proteassoma23,24,25. Quando as grandes moléculas, tais como proteínas, são transportadas através da bicamada lipídica, essas moléculas passam por um aparato molecular chamado um translocon, tais como o complexo de Sec61 e Derlin complexo em ER26e o complexo de Tom e Tim complexo na mitocôndrias,27. Quando adicionado exogenamente antígenos são transportados através da membrana de ER, eles devem penetrar a bicamada lipídica em complexo com translocons, tais como o complexo de Sec61. O método descrito aqui purificado da vesícula alvo utilizando estas moléculas de membrana-penetrante como marcadores para os compartimentos endocítica.

O método descrito aqui é um novo protocolo de purificação de vesículas usando o DC, como célula linha DC2.428 e biotinilado ovalbumina (bOVA) como um antígeno exógeno. Os compartimentos endocítica foram purificados por streptavidin (SA)-grânulos magnéticos usando o bOVA penetrar a membrana como um criador. Neste do microsome purificado, alguns adicionados exogenamente bOVA ainda foi preservado em frações de membrana, mas foram transportado para a parte externa do microsome e então ubiquitinated e processada em vitro29. Este microsome purificado contidos não só endocítica compartimento específico proteínas, mas também proteínas ER-residente para ERAD e o peptídeo carregamento complexo; sugerindo que o compartimento celular é o compartimento endocítica prospectivo para CP29. Este protocolo não é dependente do tipo de antígenos exógenos e também é aplicável para outros subconjuntos de DC e outros tipos de células, como macrófagos, células B e células endoteliais, para esclarecer o mecanismo molecular preciso de DCs para CP proficiente.

Protocolo

1. cultivo de células e adição de antígenos exógenos

  1. preparar bOVA usando uma rotulagem de biotina-proteína kit seguindo o fabricante ' protocolo s.
    Nota: Normalmente, bOVA contém biotina 2 M por 1 M de óvulos em média.
  2. DC2.4 crescer células em RPMI-1640 suplementado com 2 mM L-glutamina, piruvato de sódio 1 mM, aminoácidos não essenciais de 0,1 mM, 100 U/mL de penicilina-estreptomicina, 55 mM 2-Mercaptoetanol, 10 mM HEPES (pH 7,5) e soro fetal bezerro de 10% (doravante RPMI) a 37 ° C em 5 % CO 2 em uma incubadora umidificada (doravante sem menção, as células são incubadas a essa condição). Também é possível usar DMEM suplementado com 10% de soro fetal bezerro, 3,7 g/L NaHCO 3 (doravante DMEM) no lugar de RPMI.
  3. Um dia antes da purificação, dividir as células em RPMI a 1 x 10 5 células/mL em uma placa de cultura de tecido. Evite manter as células em um estado confluente. DC2.4 células podem altamente incorporar antígenos exógenos até um estado semi confluente, mas rapidamente perdem a capacidade depois de atingir um estado de excesso confluente.
  4. Antes do DC2.4 células são semi confluentes, adicionar 250 µ g/mL de bOVA para 1 x 10 6 células/mL e incubar durante 2-4 h.
    Nota: Durante a jusante experimentos, todos os buffers e os reagentes são mantidos a 4 ° C a menos que indicado de outra forma.

2. Preparação de Microsomes

  1. colher as DC2.4 células pipetando suave da placa de tecido em um novo tubo cónico de 50 mL.
  2. Centrifugar 1.000 x g por 5 min, 4 ° C e remova cuidadosamente o meio com bOVA por aspiração.
  3. Lavar as células DC2.4 duas vezes com 40 mL de tampão PBS (1,37 mM NaCl, 8,1 mM Na 2 HPO 4, 2,68 mM KCl, 1,47 mM KH 2 PO 4) por centrifugação a 1.000 x g, durante 5 min, 4 ° C e descartar o sobrenadante de cada vez por aspiração.
  4. Ressuspender o pellet em passo 2.3 em 1-2 mL (1/20-1/10 volume de meio de cultura) do meio de homogeneização (0,25 M de sacarose, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES-NaOH [pH 7,4]) com volume de 1/1.000 de coquetéis de inibidor de protease e transferência a ressuspensão DC2.4 células em um gelada homogenizacao homogenizador.
  5. Interromper as células DC2.4 ressuspensa suavemente por 10-20 pancadas com o gelado homogenizacao homogenizador.
    Nota: Durante a etapa de perturbação, a homogenizacao homogeneizador é refrigerado no gelo
  6. Transferir a suspensão celular-interrompido para um novo tubo cônico de 15 mL.
  7. Adicionar 8-9 mL de meio de homogeneização total 10 mL e centrifugar o tubo cônico durante 10 minutos a 2.000 x g e 4 ° C.
  8. Transferir o sobrenadante para um novo tubo cônico de 15 mL para remover células ininterrupta e núcleos e centrifugar o tubo cônico novamente por 10 min a 2.000 x g e 4 ° C.
  9. Transferir o sobrenadante para um novo tubo de ultracentrifugação e centrifugar por 45 min em 100.000 x g e 4 ° C.
  10. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o cuidadosamente em 1-2 mL de meio de homogeneização com volume de 1/1.000 de cocktails de inibidor de protease pipetando a solução acima e para baixo várias vezes para fazer uma fração do microsome para jusante experiências.
  11. Transferir a fração do microsome para um novo tubo de fundo redondo de 5 mL.
    Nota: Após esta etapa, é possível enriquecer microssomas objetivas por iodixanol centrifugação gradiente de densidade de acordo com o fabricante ' protocolo de s, remover microssomas específico. As frações de pico para antígenos exógenos são recolhidas e em seguida, submetidas à etapa seguinte de purificação (etapa 3).

3. Purificação de Microsomes com bOVA ERAD passando por

  1. volume de adicionar 1/100 de fresco grânulos SA-magnético para a fração do microsome da etapa 2.11 no 5 mL tubo de fundo redondo.
    Nota: Antes desta etapa, é possível pre-limpar a fração do microsome por grânulos controle magnético para reduzir contaminações de específico microsomes.
  2. Delicadamente, misture bem e gire o tubo de fundo redondo, lentamente por 30 min a 4 ° C.
  3. Adicionar 2-3 mL de meio de homogeneização total 4 ml para o tubo de fundo redondo e misture suavemente bem.
  4. Colocar o tubo de fundo redondo num suporte magnético e incubar durante 10 minutos a 4 ° C. Desde que os grânulos ligados para as vesículas são atraídos para o ímã, microgrânulos marrons gradualmente acumularão na parede do tubo mais próximo ao ímã.
  5. Com o tubo restante no suporte magnético, cuidadosamente descartar os sobrenadantes por aspiração para remover as vesículas desacopladas.
  6. Lavagem os grânulos magnéticos vinculados as vesículas duas vezes com 5 mL de meio de homogeneização, a magnética defende a 10 min a 4 ° C e descartar o sobrenadante cada vez por cuidadosamente aspiração.
    Nota: Sem o suporte magnético, purificação por centrifugações a 2.000 x g por 10 min, 4 ° C também está disponível.
  7. Ressuspender os grânulos magnéticos vinculados as vesículas cuidadosamente em meio de homogeneização 100 µ l a pipetagem a solução acima e para baixo várias vezes.
  8. Transferir as ressuspensa vesículas em um microtubo de novo como do microsome purificado para jusante experiências.
    Nota: Normalmente, fração do microsome 50 µ l contendo 5-20 µ g proteínas de 1 x 10 7 células pode ser isolados.

4. Análise do Microsomes purificado

grânulos
  1. Ressuspender o magnético ligados para as vesículas de passo 3.8 a 100-200 µ l de tampão TNE (pH de 20 mM Tris-HCl 7.4, 150 mM de NaCl, EDTA 0,5 M, 1% Nonidet P-40) com volume de 1/1.000 de cocktails de inibidor de protease em vez de meio de homogeneização.
  2. Transferir o lisado de passo 4.1 para um novo microtubo de 1,5 mL.
  3. Determinar a concentração de proteína da etapa 4.2 usando um kit de ensaio do BCA pelo fabricante ' protocolo de s.
    Nota: Normalmente, 5-10 µ l lisado da etapa 4.2 é suficiente para determinar a concentração de proteína.
  4. Transferir o lisado de passo 4.2 (2 µ g de proteína para coloração de prata e 10 µ g de proteína para a mancha ocidental) em microtubos novos.
  5. Colocar os microtubos em um bloco de calor em proteínas de 95 ° C e ferver em tampão de carregamento de gel de SDS 1x (pH 100 mM Tris-HCl 6,8, azul de bromofenol 200mm ditiotreitol, SDS de 4%, 0,2%, 20% de glicerol) 5 min.
  6. Centrifugar os microtubos para 10 min a 21.500 x g e 4 ° C. coletar os sobrenadantes em microtubos novos para remover as frações insolúveis.
  7. Analisar as proteínas resolvidas na etapa 4.6 (2 µ g) por padrão SD-PAGE.
  8. Visualize as bandas de proteína pela prata coloração usando coloração prata kit após o fabricante ' protocolo de s.
  9. Analisar as proteínas resolvidas na etapa 4.6 (10 µ g) por padrão SD-PAGE e Western Bloting. Use o reagente (SA-HRP) pelo fabricante ' s de protocolo e Visualizar por fluorography.

5. In Vitro Reconstituição da ERAD de bOVA usando purificado Microsomes

  1. transferência o purificado microssomas (5-10 µ g de proteína) da etapa 3.8 com um volume de 50% de reticulócitos lisado (RL), em tampão de reação (50 mM Tris pH 7,4, 3mm ATP, 0.5 mM MgCl 1x 2) e 12:02 bandeira-tag ubiquitin em um microtubo de novo. O volume final deste experimento é 20-40 µ l.
  2. Incubar o microtubo para 2 h a 37 ° C.
    Nota: Se a quantidade de ubiquitinated bOVA na etapa 5.12 é muito pequena para detectar pela mancha ocidental, adicionar 10 µ m de MG132 ou 2 µM de lactacystin para inibir o processamento do bOVA ubiquitinated por proteasomes.
  3. Parar a reação, colocando o microtubo na Ice.
  4. Resolver as microssomas adicionando buffer de TNE 500 µ l com volume de 1/1.000 de cocktails de inibidor de protease.
  5. o microtubo de centrifugação durante 10 minutos a 21,500 x g e 4 ° C. recolher os sobrenadantes para um microtubo novo para remover as frações insolúveis, que contêm ubiquitinated bOVA em DC2.4 antes do ensaio em vitro ubiquitination.
  6. Transferir o sobrenadante para um microtubo de novo e adicionar o volume de 1/100 de novas contas SA-magnético (geralmente 5 µ l para 500 µ l de sobrenadantes).
  7. Delicadamente, misture bem e girar o microtubo lentamente por 30 min a 4 ° C.
  8. Centrifugar o microtubo para 10 min a 21.500 x g e 4 ° C. descartar o sobrenadante por aspiração para recuperar o bOVA e ubiquitinated bOVA vinculado com os grânulos SA-magnético.
  9. Lavar duas vezes os grânulos SA-magnética coletados com 1 mL de tampão TNE por centrifugação durante 10 min a 21.500 x g e 4 ° C. descartar o sobrenadante de cada vez por aspiração.
  10. Ferver os grânulos SA-magnético em 1x do gel de SDS carregando buffer para min 5 a 95 ° C, em um bloco de calor para resolver as proteínas purified pelos grânulos magnético-SA.
  11. Centrifugar o microtubo para 10 min a 21.500 x g e 4 ° C. recolher os sobrenadantes para um microtubo novo para remover as frações insolúveis.
  12. Analisar as contas SA-magnéticos ligadas às proteínas por padrão SD-PAGE e Western Bloting. O uso de anticorpos (anti-Flag, anti-multi-Ub e anti-mouse IgG HRP) e o reagente (SA-HRP) é pelo fabricante ' protocolo s e visualizado por fluorography.

Resultados

Para elucidar o mecanismo molecular da CP, é necessário identificar os compartimentos celulares, onde se submeter a antígenos exógenos ERAD, como transporte e processamento. Enquanto observações por microscopia de imunofluorescência ou microscopia eletrônica identificaram o compartimento celular onde antígenos exógenos acumularam16,17,18,1

Discussão

Em estudos anteriores de CP, os antígenos exógenos incorporados acumularam na área restrita do atrasado endosome ou ER por microscopia de imunofluorescência16,30,31,32. Estima-se que ERAD, como transporte e processamento de antígenos exógenos são realizados nestas áreas especializadas da ER ou endossomo atrasado, como o compartimento celular foi identificado pela sacarose ou iodixanol u...

Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho é apoiado pela Universidade de Takasaki da saúde e bem-estar.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
RPMI 1640gibco by life technologies11875-093
Fetal bovine serumEquitech bioSFB30
Sodium pyruvategibco by life technologies11360-070
MEM non-essential amino acidsgibco by life technologies11140-050
HEPESgibco by life technologies15630-080
2-mercaptoethanolgibco by life technologies21985-023
L-glutaminegibco by life technologies25030-164
Penisicillin-Sreptomycingibco by life technologies15140-122
DMEMgibco by life technologies12100-46
OVASIGMAA5503
Biotin-protein labelling kitThermo Fisher ScientificF6347
MG-132 Santa Cruz Biotechnology201270
lactacystin SIGMAL6785
Dounce homogenizerIUCHI131703
protease inhibitor cocktails SIGMAP8340
iodixanol Cosmo bio1114542
SA-magnetic beads New England Biolabs201270
control magnetic beadsChemagenM-PVA012
magnetic standBD Biosciences552311
BCA protein assay kitThermo Fisher Scientific23225
silver staining kitsCosmo bio423413
Reticulocyte LysatePromega1730714
Flag-tagged ubiquitin SIGMAU5382
anti-ovalbumin (OVA,mouse)Antibody ShopHYB 094-06
ant-multi-ubiquitin (mouse)MBLD058−3
anti-Flag (mouse)SIGMAF3165
trypsinSIGMA85450C

Referências

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