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  • Résumé
  • Résumé
  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

La méthode décrite ici est un nouveau protocole d’isolement de la vésicule, qui permet pour la purification des compartiments cellulaires où les antigènes exogènes sont traitées par dégradation associés au réticulum endoplasmique dans présentation croisée.

Résumé

Les cellules dendritiques (CD) sont très capables de traiter et de présenter des antigènes exogènes intériorisées lors de classe majeur d’histocompatibilité (MHC) j’ai également connu sous le nom de Croix-présentation des molécules (CP). CP joue un rôle important non seulement dans la stimulation de la naïve CD8+ T cellules et mémoire CD8+ T cells pour infectieuses et immunitaires de la tumeur mais aussi dans l’inactivation d’auto-protection cellules naïves T par l’anergie des lymphocytes T ou de la suppression de cellules T. Bien que le mécanisme moléculaire critique du CP reste à élucider, accumulant indiquent que les antigènes exogènes sont traitées par associés au réticulum endoplasmique dégradation (ERAD) après exportation de non-classique endocytose compartiments. Jusqu'à une date récente, la caractérisation de ces compartiments endocytose était limitée car il n’y a aucun marqueurs moléculaires spécifiques autres que les antigènes exogènes. La méthode décrite ici est un nouveau protocole d’isolement de la vésicule, qui permet pour la purification de ces compartiments endocytose. Utilisant cette microsome purifiée, nous avons reconstitué ERAD-comme transport, ubiquitination et traitement de l’antigène exogène in vitro, suggérant que le système ubiquitine-protéasome traitées l’antigène exogène après l’exportation de cette compartiment cellulaire. Ce protocole peut être appliqué également à d’autres types de cellules de clarifier le mécanisme moléculaire de CP.

Introduction

Le MHC I molécules sont exprimées à la surface de toutes les cellules nucléées, avec petits peptides antigéniques provenant des antigènes endogènes, qui sont traitées par le système ubiquitine-protéasome dans le cytosol1. Après le traitement, les peptides antigéniques sont transportés dans la lumière du réticulum endoplasmique (re) par le transporteur de peptide TAP. Dans la lumière de l’ER, une série de chaperons spécifiques aident le chargement de peptide et le repliement correct de MHC I complexe. Cette série de molécules s’appelle le complexe de peptide-chargement (PLC), indiquant que l’ER est un compartiment central pour le peptide chargement sur MHC I2. Après le peptide de chargement, le MHC I molécules sont transportés à la surface des cellules et jouent un rôle clé dans le système immunitaire adaptatif comme marqueurs autonome et active le CD8+ des lymphocytes T cytotoxiques (CTL) pour détecter les cellules cancéreuses ou agents infectieux par antigénique peptides de protéines de non-soi3.

En antigène présentant des cellules (APC), des peptides antigéniques des antigènes exogènes sont également présentés à MHC I4,5,6,7,8 par CP, qui est principalement porté par DCs9,10,11. CP est essentiel tant pour l’activation de naïve CD8+ T des cellules et la mémoire CD8+ T cells dans anti-infectieuses et anti-tumorale CTL12,13et dans le maintien de la tolérance immunitaire par l’inactivation du autonomes naïf T cells14,15. Le CP joue plusieurs rôles importants dans le système immunitaire adaptatif, mais n’ont pas encore être décrit en détail les mécanismes moléculaires du CP. Des études antérieures du CP a révélé que les antigènes exogènes ont été localisées dans la salle d’urgence et l’endosome et ont été traitées par ERAD, suggérant que les antigènes exogènes sont transportées de l’endosome à l’urgence pour le traitement de ERAD-like et peptide chargement16 . Toutefois, les preuves s’accumulent indiquent que le chargement de peptide de CP s’effectue pas dans la salle d’urgence, mais plutôt dans des compartiments endocytose non classiques, qui ont aussi des traits distinctifs de l’ER (Figure 1)17,18 ,19,20,21. Pour éviter une dégradation des précurseurs peptide antigénique par la forte activité d’aminopeptidase22 dans le cytosol, le traitement et le peptide dans le CP de chargement se produit dans la zone proximale de ces compartiments endocytose non classique (Figure 1). Bien que la caractérisation de ces compartiments endocytose est controversée, il n’y a aucun existant des molécules spécifiques autres que les antigènes exogènes dans ce compartiment.

ERAD est une voie cellulaire, qui spécifiquement élimine les protéines mal repliées de l’ER. Dans la voie ERAD, les protéines mal repliées sont marqués transportés à travers la membrane du re vers le cytoplasme et traités par l’ubiquitine-protéasome système23,24,25. Lorsque les grosses molécules, comme les protéines, sont transportés à travers la bicouche lipidique, ces molécules traversent un dispositif moléculaire appelé un translocon, tels que le complexe Sec61 et Derlin complexe dans l’ER26et le complexe de Tom et Tim complexe dans la 27de mitochondries. Lorsque les antigènes exogènes ajoutés sont transportés à travers la membrane du re, ils doivent pénétrer la bicouche lipidique complexe avec translocons, tels que le complexe Sec61. La méthode décrite ici a purifié la vésicule ciblée en utilisant ces molécules pénétrantes membrane comme marqueurs pour les compartiments de l’endocytose.

La méthode décrite ici est un nouveau protocole de purification de vésicule à l’aide de la cellule DC ligne DC2.428 et biotinylés ovalbumine (bOVA) comme un antigène exogène. L’endocytose compartiments ont été purifiés par la Streptavidine (SA)-des billes magnétiques utilisant le bOVA pénétrantes membrane comme un fabricant. Dans cette microsome purifiée, certains ajoutée exogène bOVA était encore conservé dans les fractions membranaires mais ont été transporté à l’extérieur des microsomes et puis ubiquitinées et traitée en vitro29. Cette microsome purifiée contenait non seulement les protéines intervenant dans l’endocytose de compartiment spécifiques, mais aussi les protéines ER-résident pour ERAD et le peptide de chargement complexe ; ce qui laisse supposer que le compartiment cellulaire est le compartiment endocytose prospectif pour CP29. Ce protocole n’est pas tributaire de la nature des antigènes exogènes et s’applique également pour les autres sous-ensembles de DC et autres types de cellules, telles que les macrophages, les cellules B et les cellules endothéliales, de clarifier le mécanisme moléculaire précis de DCs pour CP compétent.

Protocole

1. cellules de plus en plus et ajout d’antigènes exogènes

  1. Prepare bOVA utilisant un étiquetage de biotine-protéine kit suivant le fabricant ' protocole de s.
    Remarque : Normalement, bOVA contient biotine 2 M par 1 M OVA enmoyenne.
  2. Cellules DC2.4 croître en milieu RPMI-1640 additionné de 2 mM de L-glutamine, pyruvate de sodium 1 mM, acides aminés non essentiels de 0,1 mM, 100 U/mL de pénicilline-streptomycine, 55 mM 2-mercaptoéthanol, 10 mM HEPES (pH 7.5) et sérum de veau foetal de 10 % (ci-après RPMI) à 37 ° C en 5 % De CO 2 dans un incubateur humidifié (ci-après sans mention, les cellules sont incubées à cette condition). Il est également possible d’utiliser DMEM additionné de sérum de veau foetal de 10 %, 3,7 g/L NaHCO 3 (ci-après DMEM) à la place de RPMI.
  3. Une journée avant la purification, diviser les cellules en RPMI à 1 x 10 5 cellules/mL dans une plaque de culture de tissus. Éviter de garder les cellules à un État anastomosé. DC2.4 cellules peuvent incorporer très antigènes exogènes jusqu'à un état semi confluent, mais perdent rapidement la capacité après avoir atteint un État anastomosé excessive.
  4. Avant la DC2.4 cellules sont semi-confluentes, ajouter 250 µg/mL de bOVA pour 1 x 10 6 cellules/mL et incuber pendant 2 à 4 h.
    Remarque : Au cours d’expériences en aval, tous les tampons et les réactifs sont conservés à 4 ° C sauf indication contraire.

2. Préparation des Microsomes

  1. récolter les cellules DC2.4 de pipetage doux de la plaque de tissu dans un nouveau tube conique de 50 mL.
  2. Centrifuger à 1 000 x g pendant 5 min, 4 ° C et retirer soigneusement le support avec bOVA par aspiration.
  3. Laver les cellules DC2.4 deux fois avec 40 mL de tampon PBS (1,37 mM NaCl, 8,1 mM Na 2 HPO 4, 2,68 mM KCl, 1,47 mM KH 2 PO 4) par centrifugation à 1 000 x g pendant 5 min, 4 ° C et éliminer le surnageant de chaque fois par aspiration.
  4. Remettre le culot à l’étape 2.3 dans 1-2 mL (1/20-1/10 volume de milieu de culture) du milieu d’homogénéisation (0,25 M de sucrose, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES-NaOH [pH 7,4]) avec volume de 1/1 000 de cocktails inhibiteur de protéase et transfert le DC2.4 remises en suspension des cellules dans une glacee Dounce homogénéisateur.
  5. Perturber les cellules DC2.4 resuspendues doucement en 10 à 20 coups avec l’homogénéisateur Dounce glacee.
    Remarque : Lors de l’étape de la perturbation, l’homogénéisateur Dounce est refroidi sur glace
  6. Transférer la suspension cellulaire-perturbé dans un nouveau tube conique de 15 mL.
  7. Ajouter 8-9 mL de milieu de l’homogénéisation au total 10 mL et centrifuger le tube conique pendant 10 min à 2 000 x g et 4 ° C.
  8. Transférer le surnageant dans un nouveau tube conique 15 mL pour enlever les noyaux et des cellules ininterrompues et centrifuger le tube conique à nouveau pendant 10 min à 2 000 x g et 4 ° C.
  9. Transvaser le surnageant dans un nouveau tube de l’ultracentrifugation et centrifuger pendant 45 min à 100 000 x g et 4 ° C.
  10. Aspirer le surnageant et Resuspendre le culot avec soin dans 1 à 2 mL de milieu d’homogénéisation avec volume de 1/1 000 de cocktails inhibiteur de protéase en pipettant également, la solution de monter et descendre plusieurs fois de faire une fraction microsome pour expériences en aval.
  11. Transférer la fraction microsome dans un nouveau tube fond rond 5 mL.
    NOTE : Après cette étape, il est possible d’enrichir les microsomes objectives par centrifugation en gradient de densité iodixanol selon le fabricant ' protocole de s, pour enlever les microsomes non spécifiques. Les fractions de pic pour les antigènes exogènes sont collectées et ensuite soumises à la prochaine étape de la purification (étape 3).

3. Purification des Microsomes avec bOVA subissant ERAD

perles magnétiques SA
  1. Add 1/100 volume de produits frais à la fraction microsome d’étape 2.11 dans les 5 mL rond tube inférieur.
    Remarque : Avant cette étape, il est possible d’avance la fraction microsome par des billes magnétiques contrôle afin de réduire les contaminations de microsomes non-spécifiques.
  2. Doucement, bien mélanger et faire pivoter le tube fond rond lentement pendant 30 min à 4 ° C.
  3. Ajouter 2-3 mL de milieu de l’homogénéisation au total 4 mL dans le tube à fond rond et mélanger délicatement bien.
  4. Le tube fond rond sur un support magnétique et incuber pendant 10 min à 4 ° C. Puisque les perles liés aux vésicules sont attirés par l’aimant, micro-billes bruns s’accumuleront progressivement à la paroi du tube le plus proche de l’aimant.
  5. Avec le tube restant dans le support magnétique, jeter avec précaution les surnageants par aspiration pour enlever les vésicules indépendants.
  6. Laver les billes magnétiques liés aux vésicules deux fois avec 5 mL de milieu d’homogénéisation par la magnétique reposer pendant 10 min à 4 ° C et éliminer le surnageant de chaque fois par aspiration soigneusement.
    Remarque : Sans le support magnétique, purification par centrifugations à 2 000 x g pendant 10 min, 4 ° C est également disponible.
  7. Remettre les billes magnétiques liés aux vésicules soigneusement dans 100 µL de milieu homogénéisation en pipettant également, la solution de monter et descendre plusieurs fois.
  8. Transférer les vésicules remises en suspension dans un microtube de nouveau comme le microsome purifiée pour expériences en aval.
    Remarque : En règle générale, 50 µL de fraction microsome contenant de 5 à 20 µg protéines de 1 x 10 7 cellules peut être isolées.

4. Analyse des Microsomes purifiée

  1. remettre le magnétique perles liés aux vésicules d’étape 3,8 par 100-200 µL de tampon TNE (20 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, EDTA de 0,5 M, 1 % Nonidet P-40) avec volume de 1/1 000 de cocktails inhibiteur de protéase au lieu de la moyenne de l’homogénéisation.
  2. Transférer le lysat d’étape 4.1 vers un nouveau microtubes de 1,5 mL.
  3. Déterminer la concentration de la protéine de l’étape 4.2 en utilisant un kit de dosage BCA par le fabricant ' protocole de s.
    Remarque : En général, 5 à 10 µL de lysat d’étape 4.2 est suffisant pour déterminer la concentration de protéine.
  4. Transférer le lysat de l’étape 4.2 (2 µg de protéines pour la coloration à l’argent et 10 µg de protéines pour éponger occidental) dans nouveau microtubes.
  5. Mettre les microtubes sur un bloc chauffant à protéines 95 ° C et faire bouillir dans 1 x tampon de gel-charge de SDS (100 millimètres Tris-HCl pH 6,8, bleu de bromophénol 200 mM dithiothréitol, SDS de 4 %, 0,2 % et 20 % de glycérol) pendant 5 min.
  6. Centrifuger les microtubes pendant 10 min à 21 500 x g et 4 ° C. recueillir les surnageants dans des microtubes de nouveau pour enlever les fractions insolubles.
  7. Analyser les protéines résolus à l’étape 4.6 (2 µg) par SD-PAGE standard.
  8. Visualiser les bandes de protéines par la coloration à l’aide de coloration à l’argent à l’argent kit après le fabricant ' protocole de s.
  9. Analyser les protéines résolus à l’étape 4.6 (10 µg) par SD-PAGE standard et Western-Blot. Utiliser le réactif (SA-HRP) par le fabricant ' s le protocole et le visualiser par fluorographie.

5. In Vitro Reconstitution de l’Ubiquitination ERAD bOVA Microsomes de purifiée à l’aide de

  1. transfert purifié microsomes (5-10 µg de protéines) de l’étape 3.8 avec un volume de 50 % de lysat de réticulocytes (RL), 1 x tampon de réaction (50 mM Tris pH 7,4, ATP, 0,5 mM MgCl 3 mM (2) et 12:02-tag drapeau ubiquitine dans un microtube de nouveau. Le volume final de cette expérience est de 20-40 µL.
  2. Incuber le microtube pendant 2 h à 37 ° C.
    Remarque : Si le montant de bOVA ubiquitinées dans étape 5.12 est trop petit pour détecter les Western Blot, ajouter 10 µM de MG132 ou 2 µM de lactacystin d’inhiber la transformation de la bOVA ubiquitinée par protéasomes.
  3. Arrêter la réaction en plaçant le microtube sur glace.
  4. Résoudre les microsomes en ajoutant 500 µL de tampon de TNE avec volume de 1/1 000 de cocktails d’inhibiteur de la protéase.
  5. Centrifugeuse microtube pendant 10 min à 21,500 x g et 4 ° C. recueillir le surnageant dans un microtube de nouveau pour enlever les fractions insolubles, qui contiennent ubiquitinées bOVA dans DC2.4 avant l’essai in vitro ubiquitination avec.
  6. Transférer le surnageant dans un microtube de nouveau et ajouter 1/100 volume de nouvelles perles magnétiques SA (habituellement 5 µL pour 500 µL de surnageants).
  7. Doucement, bien mélanger et faire pivoter le microtube lentement pendant 30 min à 4 ° C.
  8. Centrifuger le microtube pendant 10 min à 21 500 x g et 4 ° C. jeter le surnageant par aspiration à recouvrer les bOVA ubiquitinées bOVA lié avec les perles magnétiques SA.
  9. Laver deux fois les perles magnétiques SA collectées avec 1 mL de tampon TNE par centrifugation pendant 10 min à 21 500 x g et 4 ° C. jeter le surnageant de chaque fois par aspiration.
  10. Faire bouillir les perles magnétiques SA dans 1 x gel SDS chargement tampon pendant 5 min à 95 ° C sur un bloc chauffant pour résoudre les protéines purifiées par les perles magnétiques SA.
  11. Centrifuger le microtube pendant 10 min à 21 500 x g et 4 ° C. recueillir le surnageant dans un microtube de nouveau pour enlever les fractions insolubles.
  12. Analyser les perles magnétiques SA liées aux protéines par SD-PAGE standard et Western-Blot. L’utilisation d’anticorps (anti-multi-Ub, Anti-Flag et anti-souris IgG-HRP) et le réactif (SA-HRP) est par le fabricant ' protocole s et visualisée par fluorographie.

Résultats

Afin d’élucider les mécanismes moléculaires du CP, il est nécessaire d’identifier les compartiments cellulaires, où les antigènes exogènes subissent un transport ERAD-like et le traitement. Alors que les observations en microscopie par immunofluorescence ou par microscopie électronique identifié le compartiment cellulaire où les antigènes exogènes accumulent16,17,18,

Discussion

Dans les études précédentes du CP, les antigènes exogènes incorporés accumulent dans la zone réglementée de l’endosome tardif ou ER par microscopie par immunofluorescence16,30,31,32. On estime que ERAD-comme transport et le traitement des antigènes exogènes sont effectués dans ces domaines spécialisés de l’ER ou retard endosome, le compartiment cellulaire a été identifié par...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail est soutenu par la Takasaki Université de la santé et le bien-être.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
RPMI 1640gibco by life technologies11875-093
Fetal bovine serumEquitech bioSFB30
Sodium pyruvategibco by life technologies11360-070
MEM non-essential amino acidsgibco by life technologies11140-050
HEPESgibco by life technologies15630-080
2-mercaptoethanolgibco by life technologies21985-023
L-glutaminegibco by life technologies25030-164
Penisicillin-Sreptomycingibco by life technologies15140-122
DMEMgibco by life technologies12100-46
OVASIGMAA5503
Biotin-protein labelling kitThermo Fisher ScientificF6347
MG-132 Santa Cruz Biotechnology201270
lactacystin SIGMAL6785
Dounce homogenizerIUCHI131703
protease inhibitor cocktails SIGMAP8340
iodixanol Cosmo bio1114542
SA-magnetic beads New England Biolabs201270
control magnetic beadsChemagenM-PVA012
magnetic standBD Biosciences552311
BCA protein assay kitThermo Fisher Scientific23225
silver staining kitsCosmo bio423413
Reticulocyte LysatePromega1730714
Flag-tagged ubiquitin SIGMAU5382
anti-ovalbumin (OVA,mouse)Antibody ShopHYB 094-06
ant-multi-ubiquitin (mouse)MBLD058−3
anti-Flag (mouse)SIGMAF3165
trypsinSIGMA85450C

Références

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