影像学在两层微流控平台拟南芥幼苗的根头发形态

摘要

这篇文章演示了如何以文化拟南芥幼苗在一个局限的主根和根毛向单一光学平面的两层微流控平台。这个平台可以用于实时光学成像的细根形态以及对于高分辨率成像，通过其他的手段。

摘要

根毛增加根表面积为更好的水吸收及养分吸收的植物。因为他们是体积小而且经常掩映在它们生存的自然环境，根毛的形态结构和功能很难研究和从植物研究经常被排除在外。近年来，微流控平台提供的方式，而不会干扰到成像系统的传输过程中的根可视化根系统在高分辨率。微流控平台在这里生成以前的片上植物研究把相结合提出两层设备限制根毛相同的光学平面的拟南芥主要根源。这种设计使量化的根毛细胞和细胞器水平，也可以防止漂流在另外的实验性治疗过程中的 z 轴。我们描述如何在包含水合的环境中，而无需射流泵，而同时保持苗定环境存储设备。光学成像实验后，该设备可能拆卸和作为基材用于原子力或同时保持细根结构完整扫描电镜观察。

引言

细根功能增加水和养分采集植物，探索新的土壤空间和增加总根表面面积。这些细根功能的营业额在起主要作用刺激地下食品链¹和细根在某些植物物种数目是预期到双下大气二氧化碳浓度升高²。细根一般定义为那些小于 2 毫米直径，虽然新增倡导表征其功能³细根。像许多细根，根毛提供的摄取和吸收功能，但占用更小的空间，直径相当于微米。由于其体积小、 根毛难以图像原位，往往忽略了作为整体的根建筑领域规模实验和模型的一部分。

Ex terra根头发研究，如从琼脂平板上生长的幼苗，科学界提供了有价值的信息，对细胞生长和运输^4，5。虽然琼脂板允许根系统成像无损和真正的时间，他们不提供另外的实验性治疗，如营养、 植物激素或细菌高环境控制。促进高分辨率成像，同时还提供动态环境控制新兴解决方案已经过植物研究的微流控平台的出现。这些平台已启用的非破坏性生长和可视化为高吞吐量分型^{6，7，8，9}，孤立的化学处理的几个植物物种。¹⁰、 力测量^11，12和微生物¹³的加法。微流控平台设计集中在单一的开放空间流体层根可能传播，允许根毛时有时无光学聚焦在增长或治疗过程中的使用。

在这里，我们目前的程序制订一个两层微流控平台使用照片和软光刻方法，在以前的片上植物设计基础上了围到主根相同的成像平面的幼苗根毛。这使我们能够跟踪根头发发展在真正的时间，在高分辨率下，和在整个实验治疗过程。我们培养的方法允许拟南芥幼苗萌发出种子在平台内而又有教养的水合和无菌的环境中不需要使用注射器泵设备一周。一旦延时成像实验已经结束，在这里提出了一种平台可以打开而不会干扰细根功能的位置。这允许使用其他高分辨率成像方法。在这里我们提供代表结果量化和可视化的根毛的形态结构，在这个平台上由光学、 扫描电子显微镜 (SEM) 和原子力显微技术 (AFM)。

研究方案

1.两层平台制作

1. 多层大师的制备
   1. 旋涂环氧负性光刻 (1,250 ~63.45%固体 cSt) 根据制造商的规格 (45 2，000rpm s) 到 4 英寸直径硅片，以获得所需的 20 微米的第一个设计层高度。
   2. 软烤涂层的抗晶片为 4 分钟，95 ° c。允许硅片冷却 5 分钟暴露于 UV 光线为 15 硅片 s (~ 150 兆焦耳/厘米²在 365 nm) 通过在 UV 光掩膜接触定位仪来确定底层的几何形状。
   3. 暴露后烘烤硅片 5 分钟在 95 ° c。如果没有发展，回到晶圆片旋转涂布机和自旋上第二层的环氧负性光刻 (80,000 ~76.75%固体 cSt) 在 3000 转，实现第二层高度为 150-200 微米。
   4. 允许硅片，然后才转到 95 ° C 加热 45 分钟休息 5 分钟。后在烤盘上烤，移除晶圆片和允许抗冷却和硬化在室温下另一个 5 分钟在平坦的水平面上。对齐和暴露到第二层掩模为 30 硅片在紫外线接触仪 （剂量大约 300 兆焦耳/厘米²） s。
   5. 执行暴露后烘烤硅片放在 95 ° C，15 分钟的电炉子，然后允许硅片冷却 5 分钟平水平地面上再发展。
   6. 这两种抗蚀剂层并举的将晶片放入塑料盘，淹没在相应的开发人员硅片 （见材料表）。轻轻摇动这道菜，偶尔要洗新鲜的开发人员在晶圆片。
   7. 17 分钟后冲洗与异丙醇 (IPA) 晶片。如果白膜出现，继续循环之间冲洗硅片与开发商和投资促进机构，直到电影消失。干图案的硅片的氮。
2. 聚二甲基硅氧烷软光刻
   1. 公开 30 空气等离子体对硅晶片 s 在等离子清洗上高级设置 （见材料表） 来清洁。Silanize （1 H，1 H，2h，2h-全氟-n-辛基） 三氯硅烷在化学罩下面 2 h 硅烷 (85 ° C) 的闪点的电炉子上晶圆。
   2. 倒到主硅片上的固化剂的聚二甲基硅氧烷 (PDMS) 的比例为 10:1。脱气真空室中混合的 PDMS 防治然后在 70 ° C 烘箱 1 h 或直到完全固化聚二甲基硅氧烷聚合物。
   3. 使用一把手术刀，聚二甲基硅氧烷设备切剥他们从主硅片。使用 1.5 毫米活检冲床创建种子和治疗的入口，冲孔种子进口 45 ° 角，以鼓励根系生长成的主渠道。
   4. 使用透明胶带从聚二甲基硅氧烷设备删除碎片，设备设计端下来放玻璃盖玻片。高压釜组装的设备。

2.种植设备

1. 拟南芥种子制备
   1. 表面消毒南芥种子 30%商用漂白剂稀释 4 倍用无菌水 7 分钟洗种子去离子水和 0.1%Triton X 洗涤剂溶液微量离心管中。
   2. 分层的种子通过冷冻离心管，一夜之间或一周在 4 ° c。
2. 设备准备
   1. 无菌的设备置于真空脱气室，从气体排除空气渗透 PDMS 和射流渠道来提高易用性的灌装。
   2. 从真空室删除的设备并且立即淹没充满液体 ¼ 强度植物基础培养基 ph 值为 5.7 培养皿中的设备。
   3. 使用吸管，拉液体通过入口填补该设备。请确保没有气泡留在渠道内通过目测。
   4. 将单个设备转移到新干培养皿。倒或移液管的热琼脂周围设备直到琼脂水平几乎与 PDMS 设备的顶部齐平。允许琼脂凝固。
      注: 设备现在正准备播种或可以存储在 4 ° C，直到需要。
3. 播种设备内
   1. 在无菌环境中，将一个消毒的种子转移到使用小吸管每个装置的进口。
   2. 盖培养皿用蜡膜 （见材料表） 和光/暗循环生长室或窗台在室温中放置。这样的设备是垂直的重力会鼓励扎根成长通过通道东方培养皿。

3.处理

1. 实验性治疗
   1. 在幼苗生长发育所需的时间，实验处理幼苗通过添加到每个 8 侧端口通过吸管加入规定的量的治疗。
   2. 重新封装培养皿，回到生长室或窗台。
   3. 继续在所需的时间，以捕获单个时间点或开始时间推移成像成像样品。

4.光学成像

1. 降低分辨率 (4-20 X) 成像
   1. 整个培养皿中的设备和较低的分辨率 (4-20 X) 明亮的领域或微分干涉 (dic) 成像倒立明场显微镜下幼苗的地方。优化照明条件下，通过调整曝光时间、 灯亮度、 光圈和光的极性澄清感兴趣的形态学特点。开车阶段到所需的根和重点区域的根或 root hair(s) 感兴趣。
   2. 获取单个时间点或时间序列的图像。若要可视化的根毛生长，形象越来越根毛每分钟一次。若要可视化的主根生长，获得一个图像每隔 30 分钟返回培养皿和幼苗生长室或在垂直位置的窗台上成像完成后。
2. 高分辨率 (20-63 X) 的图像
   1. 一旦幼苗已成长为所需的时间，用镊子从琼脂中删除盖玻片和设备。干净的底边盖玻片用乙醇湿实验室组织。
   2. 适用于作为显微镜镜头厂商的建议目的推荐的浸泡媒体。盖玻片下来放在显微镜载物台和提高阶段联系浸入式媒体的目标。通过调整曝光时间、 灯亮度、 光圈和光的极性优化的照明条件。对感兴趣的 root hair(s) 开车送去的所需的区域和重点阶段。
      注: DIC 需要可视化胞质，和荧光标记需要可视化细胞器运动。
   3. 为了量化根头发的生长，随着时间的推移，获得一个图像每分钟。若要可视化细胞器运动，尽量减少同时仍然保留一个可识别的荧光信号从细胞器荧光照射时间。曝光时间允许的情况下尽快获得图像的细胞器。对于长延时成像，使用一个活细胞成像阶段孵化器保持环境温度和湿度。
      注: 63 X 油目的被推荐成像根头发细胞器。

5.非光学成像

1. 设备准备
   1. 一旦幼苗已成长为所需的时间，

从培养皿中取出设备和盖玻片。

把设备弄颠倒了，轻轻剥盖玻片，根留在 PDMS 通道内。

继续用于 PDMS 设备作为基材，根在高分辨率原子力或扫描电子显微镜。

扫描电镜观察

1. 存款薄 (~ 20 毫微米) 的根和围聚二甲基硅氧烷使用双枪电子梁蒸发室上的铬层。
2. 将根和聚二甲基硅氧烷设备转移到扫描电子显微镜室。
   注意: 成像条件、即电压、 电流和工作距离将需要进行优化，以实现为一个给定的应用程序所需的分辨率。

原子力显微镜 (AFM)

1. 在原子力显微镜标本持有人上了装载 PDMS 设备根端。增加对比度相机中的更容易区分根从聚二甲基硅氧烷，将平反射 （如涂金云母） 衬底上的聚二甲基硅氧烷设备放置在原子力显微镜标本架上安装设备之前。
2. 安全在 PDMS 设备液体井附件和装满水保持在成像过程中水化的根源。
3. 加载到原子力显微镜标本持有人。调整 z-厚度的聚二甲基硅氧烷设备控制和驱动悬臂到该地区的利益为指导使用照相机从根上。
4. 对齐与悬臂尖端激光。对于接触模式成像的最佳结果，使用悬臂梁与弹簧常数的 0.01 或 0.03 N m 在扫描过程中的根力很小。
5. 慢慢地降低扫描机制直到悬臂只是使联系与样品。调整为所需的区域扫描尺寸和选择 1 线/s 与 256 电压点每行扫描速度。获取扫描。

结果

此处所述的两层 PDMS 微流控设备有 200 微米高渠道为主要的拟南芥根和 20 μ m 的高分庭，以限制侧向生长根毛 (图 1A)。这种设计可能用于类似根直径植物拟南芥和可以随时修改，以适应不同尺寸.的物种该设计采用用于植物的入口以及任何所需的化学或生物治疗的 8 侧入口。与媒体细化设备和浇筑设备周围的琼脂保持根环境水水的?...

讨论

用于创建一个片上植物平台本文中描述的方法是独特的两层设计的范围根毛到单一的成像平面和平台可能解构和作为基材用于高分辨率非光学成像.使用高分辨率的非光学成像可以提供有价值的信息不能从单独的光学成像获得的植物组织。例如，原子力显微镜成像可以提供力测量计算根组织的弹性，在开发过程中或特定的化学或生物治疗后。同样，扫描电镜成像可以提供高分辨率细节表面形貌的根...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Silicon Wafer	WRS Materials	100mm diameter, 500-550um thickness, Prime, 10-20 resistivity, N/Phos<100>
Quintel Contact Aligner	Neutronix Quintel Corp	NXQ 7500 Mask Aligner
Fluorescent Microscope	Nikon	Eclipse Ti-U
laboratory tissue	Kimberly Clark	Kimwipe KIMTECH SCIENCE Brand, 34155
Negative Photoresist Epoxy	Microchem	SU-8 2000s series
Photoresist developer	Microchem	Su-8 developer
trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluoro-octyl)silane	Sigma Aldrich		use in chemical hood
Air Plasma Cleaner	Harrick Plasma
PDMS	Dow Corning	Sylgard 184 Silicone elastomer base
PDMS curing agent	Dow Corning	Sylgard 184 Silicone elastomer curing agent
Dessicator	Bel-Art	F42010-000
Scalpel	X-acto knife
Biopsy Punch	Ted Pella	15110-15
Adhesive tape	Staples	Invisible Tape
Microfuge tube	Eppendorf
Triton X	J.T.Baker XI98-07
Bleach	Chlorox	concentrated
Plant-Based Media	Phyto Technology Laboratories	M524
Agar	Teknova	A7777
Wax film	Parafilm
microscope	Olympus	IX51
Atomic Force Microscope	Keysight Technologies	5500 PicoPlus AFM
Petri dish	VWR
Scanning Electron Microscope	JEOL	7400
Dual Gun Electron Beam Evaporator	Thermionics	Custom Dual Electron Gun Evaporation System