La morfologia dei capelli di radice di semenzali di Arabidopsis in una piattaforma di Microfluidic di due-strato di imaging

Riepilogo

In questo articolo viene illustrato come Arabidopsis thaliana semenzali in una piattaforma di due-strato microfluidici che limita la radice principale e peli radicali per un singolo piano ottico della coltura. Questa piattaforma può essere utilizzata per imaging ottico in tempo reale della morfologia di radice bene anche per quanto riguarda imaging ad alta risoluzione con altri mezzi.

Abstract

Peli radicali aumentare la superficie di radice per migliore assorbimento di acqua e assorbimento delle sostanze nutritive dalla pianta. Perché sono di piccole dimensioni e spesso oscurata dal loro ambiente naturale, funzione e morfologia dei capelli di radice sono difficili da studiare e spesso esclusi dalla ricerca sulle piante. Negli ultimi anni, microfluidica piattaforme hanno offerto un modo per visualizzare la radice sistemi ad alta risoluzione senza disturbare le radici durante il trasferimento di un sistema di imaging. La piattaforma microfluidica presentato qui compilazioni su ricerca precedente pianta-on-a-chip incorporando un dispositivo di due-strato per confinare la radice principale di Arabidopsis thaliana allo stesso piano ottico come i capelli di radice. Questo design consente la quantificazione di peli radicali su un cellulare e organello livello e inoltre impedisce l'asse z alla deriva durante l'aggiunta di trattamenti sperimentali. Descriviamo come conservare i dispositivi in un ambiente confinato e idratato, senza la necessità di pompe fluidiche, pur mantenendo un ambiente gnotobiotici per il semenzale. Dopo l'esperimento di imaging ottico, il dispositivo può essere smontato e utilizzato come substrato per forza atomica o microscopia elettronica a scansione pur mantenendo intatta la strutture delle radici fini.

Introduzione

Caratteristiche di radice bene aumentano acqua e acquisizione dei nutrienti per la pianta, esplorare nuovi spazi di terreno e aumentando la superficie di radice totale. Il fatturato di queste caratteristiche del bene principale svolge un ruolo importante nello stimolare la catena alimentare della metropolitana¹ e il numero di radici fini in alcune specie di piante è previsto a doppia sotto anidride carbonica atmosferica elevata². Radici fini sono generalmente definite come quelli inferiori a 2 mm di diametro, anche se nuove definizioni di avvocato per la caratterizzazione di radici fini dalla loro funzione³. Come molte radici fini, peli radicali forniscono la funzione di assorbimento e di assorbimento, ma occupano uno spazio molto più piccolo con diametri dell'ordine di micron. A causa delle loro piccole dimensioni, peli radicali sono difficili da immagine in situ e sono spesso trascurati come parte dell'architettura complessiva radice nel campo scala esperimenti e modelli.

Ex terra dei capelli di radice studia, come nel caso di piantine coltivate su piastre di agar, hanno fornito preziose informazioni sulla crescita cellulare e trasporti^4,5la comunità scientifica. Mentre piastre di agar consentono sistemi della radice essere imaged in modo non distruttivo e in tempo reale, essi non offrono alta controllo ambientale per l'aggiunta di trattamenti sperimentali come le sostanze nutrienti, ormoni vegetali o batteri. Una soluzione emergente a facilitare la formazione immagine di alta risoluzione mentre anche offrendo dinamico controllo ambientale è stato l'avvento di piattaforme di microfluidica per studi di pianta. Queste piattaforme hanno permesso la crescita distruttiva e la visualizzazione di diverse specie vegetali per throughput elevato phenotyping^6,7,8,9, trattamenti chimici isolati ¹⁰, vigore misure^11,12e l'aggiunta di microrganismi¹³. Disegni di piattaforma microfluidica si sono concentrati sull'uso di strati fluidico unico ambiente open space in cui le radici possono propagare, permettendo i capelli di radice alla deriva dentro e fuori di messa a fuoco ottica durante la crescita o il trattamento.

Qui presentiamo una procedura per lo sviluppo di una piattaforma di due-strato microfluidici utilizzando foto e metodi soft-Litografia che si basa su disegni di pianta-on-a-chip precedenti di confinare i semenzale di peli radicali allo stesso piano imaging come la radice principale. Questo ci permette di monitorare lo sviluppo dei capelli di radice in tempo reale, ad alta risoluzione e durante tutto il processo di trattamento sperimentale. I nostri metodi di coltura permettono di Arabidopsis thaliana piantine essere germinati dal seme all'interno della piattaforma e colta per fino ad una settimana in un ambiente sterile e idratata che non richiede l'uso di attrezzature pompa siringa. Una volta che l'esperimento di time-lapse imaging ha concluso, la piattaforma qui presentata possa essere aperti senza disturbare la posizione delle funzioni radice più fini. Questo consente l'utilizzo di altri metodi di imaging ad alta risoluzione. Qui forniamo risultati rappresentativi per la quantificazione e la visualizzazione della morfologia dei capelli di radice in questa piattaforma di microscopia ottica, scansione (SEM) e a forza atomica (AFM) di tecniche di microscopia.

Protocollo

1. due-strato piattaforma Fabrication

1. Fabbricazione dei maestri multistrati
   1. Spin cappotto photoresist negativo a base epossidica (~63.45% solidi, 1.250 cSt) secondo le specifiche del produttore (2.000 giri/min per 45 s) su un wafer di silicio del diametro di 4 pollici per ottenere l'altezza desiderata di 20 µm per il primo strato di design.
   2. Soft-cuocere le cialde di resistere rivestito per 4 min a 95 ° C. Consentire la cialda raffreddare per 5 min. esporre la cialda ai raggi UV per 15 s (~ 150 mJ/cm² a 365 nm) attraverso un photomask in un UV contatto Allineatore per definire la geometria dello strato inferiore.
   3. Post-esposizione cuocere la cialda per 5 min a 95 ° C. Senza sviluppo, torna il wafer alla spalmatrice di spin e spin su un secondo strato di photoresist negativo a base epossidica (~76.75% solidi, 80.000 cSt) a 3.000 giri/min per raggiungere un secondo strato di altezza di 150-200 µm.
   4. Consentire la cialda riposare per 5 minuti prima di trasferire in una piastra di 95 ° C per 45 min. Dopo la cottura sulla piastra riscaldante, rimuovere la cialda e consentire il resistere a raffreddare e indurire a temperatura ambiente per un altro 5 minuti su una superficie piana. Allineare ed esporre la cialda per il secondo strato fotomaschere per 30 s in un allineatore contatto UV (dose di circa 300 mJ/cm²).
   5. Eseguire un post-esposizione cuocere mettendo la cialda su una piastra per 15 min a 95 ° C e quindi consentire la cialda a raffreddare su una superficie piana per 5 min prima di sviluppare.
   6. Sviluppare contemporaneamente entrambi gli strati resistere mettendo la cialda in un piatto di plastica e sommergendo la cialda in sviluppatore appropriato (Vedi Materiali tavolo). Scuotere delicatamente il piatto occasionalmente per lavare sviluppatore fresco sopra la cialda.
   7. Dopo 17 min, sciacquare la cialda con isopropanolo (IPA). Se viene visualizzata la finestra di una patina bianca, continuino ad iterare tra risciacquo la cialda con sviluppatore e IPA, fino a quando il film scomparirà. Asciugare il wafer di silicio a motivi con azoto.
2. Polydimethylsiloxane Soft-Litografia
   1. Esporre il wafer di silicio per un plasma ad aria per 30 s in un plasma cleaner impostato su high (Vedi materiali tavolo) per pulire. Silanizzare la cialda con tricloro (1h, 1h, 2H, 2h-perfluoro-n-octil) Silano in una cappa chimica su una piastra sotto il punto di infiammabilità del silano (85 ° C) per 2 h.
   2. Versare un rapporto 10:1 di polidimetilsilossano (PDMS) per agente indurente sul master di wafer di silicio. Degassare il PDMS misto in una camera a vuoto e poi curare il polimero in forno a 70 ° C per 1 ora o fino a quando il PDMS è completamente guarito.
   3. Usando un bisturi, tagliare i dispositivi PDMS e sbucciatele da master di wafer di silicio. Utilizzare un punzone di biopsia di 1,5 mm per creare insenature seme e trattamento, l'ingresso di seme ad un angolo di 45° per incoraggiare la crescita delle radici nel canale principale di punzonatura.
   4. Utilizzare nastro adesivo trasparente per rimuovere i detriti dal dispositivo PDMS e posizionare il lato di progettazione del dispositivo su un vetrino coprioggetti. Autoclave i dispositivi assemblati.

2. dispositivi di impianto

1. Preparazione del seme di Arabidopsis thaliana
   1. Superficie sterilizzare semi di a. thaliana in un tubo di microfuge con una soluzione di candeggina commercialmente disponibili 30% diluito in detergente di Triton X deionizzata acqua e 0,1% per minimo 7 semi di lavare 4 volte con acqua sterile.
   2. Stratificare i semi di microfuge tubo di refrigerazione durante la notte o fino ad una settimana a 4 ° C.
2. Preparazione del dispositivo
   1. Posizionare i dispositivi sterilizzati in un vuoto degasaggio camera per eliminare l'aria dal gas permeabile PDMS e fluidici canali per migliorare la facilità di riempimento.
   2. Rimuovere i dispositivi dalla camera a vuoto e immergere immediatamente i dispositivi in una capsula Petri riempiti di liquido ¼ forza basata vegetale media a pH 5.7.
   3. Utilizzando una pipetta, tirare liquido attraverso le insenature per riempire il dispositivo. Assicuratevi che nessun bolle d'aria rimangano all'interno dei canali mediante ispezione visiva.
   4. Trasferire i singoli dispositivi di nuovo asciutto Petri. Versare o pipetta agar caldo intorno al dispositivo fino a quando il livello di agar è quasi a filo con la parte superiore del dispositivo PDMS. Consentire l'agar solidificare.
      Nota: I dispositivi sono ora pronti per piantare i semi o possono essere conservati a 4 ° C fino a quando necessario.
3. Piantare i semi all'interno dei dispositivi
   1. In un ambiente sterile, trasferire un seme sterilizzato all'ingresso di ogni dispositivo usando una pipetta piccola.
   2. Copertina di Petri con cera film (Vedi Materiali tavolo) e posto in una camera di crescita in bicicletta di chiaro/scuro o davanzale a temperatura ambiente. Orientare la piastra di Petri in modo che i dispositivi sono verticali e gravità incoraggerà le radici di crescere attraverso il canale.

3. trattamento

1. Trattamenti sperimentali
   1. Al momento desiderato nello sviluppo del semenzale, aggiungere il trattamento sperimentale al semenzale aggiungendo una quantità prescritta del trattamento per ciascuna delle porte 8 lato tramite pipetta.
   2. Richiudere la capsula di Petri e tornare alla camera di crescita o davanzale.
   3. Procedere con imaging campioni all'ora desiderata per catturare momenti individuali o iniziare la formazione immagine di lasso di tempo.

4. optical Imaging

1. Abbassare l'Imaging ad alta risoluzione (4-20 X)
   1. Posto l'intera capsula di Petri contenente il dispositivo ed il semenzale sotto un microscopio invertito campo luminoso per campo luminoso ad alta risoluzione (4-20 X) più basso o imaging (DIC) contrasto differenziale di interferenza. Ottimizzare le condizioni di illuminazione per delucidare le caratteristiche morfologiche di interesse regolando i tempi di esposizione, luminosità della lampada, l'apertura e la polarità della luce. Guidare la fase per l'area desiderata della radice e concentrarsi sulla radice o root hair(s) di interesse.
   2. Acquisire un punto di tempo singolo o una serie temporale di immagini. Per visualizzare la crescita dei peli radicali, immagine cresciti peli radicali una volta al minuto. Per visualizzare la crescita della radice principale, acquisire una sola immagine ogni 30 min ritorno di Petri e le piantine per camera di crescita o davanzale in posizione verticale dopo formazione immagine è completa.
2. Maggiore formazione immagine ad alta risoluzione (20-63 X)
   1. Una volta che il semenzale è cresciuto per un tempo desiderato, è possibile utilizzare pinze per rimuovere vetrino coprioggetto e dispositivo da agar. Pulire fuori la parte inferiore del coprivetrino utilizzando un tessuto di laboratorio di etanolo a contatto.
   2. Applicare i supporti consigliati immersione all'obiettivo come suggerito dal costruttore della lente del microscopio. Posare il coprioggetto sul palco di microscopio e alzare il tavolino per contattare il supporto di immersione sull'obiettivo. Ottimizzare le condizioni di illuminazione regolando i tempi di esposizione, luminosità della lampada, l'apertura e la polarità della luce. Guidare la fase per l'area desiderata e la messa a fuoco su root hair(s) di interesse.
      Nota: Per visualizzare il flusso citoplasmatico è necessario DIC e marcatori di fluorescenza sono necessari per visualizzare il movimento degli organelli.
   3. Per quantificare la crescita dei capelli di radice nel corso del tempo, acquisire un'immagine per min. Per visualizzare il movimento degli organelli, ridurre al minimo il tempo di esposizione di fluorescenza pur mantenendo un segnale di fluorescenza identificabili dagli organelli. Più velocemente il tempo di esposizione consente di acquisire immagini degli organelli. Più time-lapse imaging, per utilizzare un'incubatrice di fase imaging di cellule vive per mantenere l'umidità e temperatura ambiente.
      Nota: Un obiettivo di olio X 63 è consigliato per imaging dei capelli di radice organelli.

5. non-Optical Imaging

1. Preparazione del dispositivo
   1. Una volta che il semenzale è cresciuta per il tempo desiderato,

rimuovere il dispositivo e il vetrino coprioggetto da di Petri.

Capovolgere il dispositivo e Sbucci delicatamente il vetrino coprioggetti in modo che la radice rimane all'interno del canale PDMS.

Procedere per utilizzare il dispositivo PDMS come substrato per la radice nella maggiore forza atomica di risoluzione o microscopia elettronica a scansione.

Microscopia elettronica a scansione

1. Depositare un sottile (~ 20 nm) strato di cromo sulla radice e dintorni di PDMS utilizzando una pistola Electron Beam evaporazione bicamerale.
2. Trasferire la radice e il dispositivo PDMS alla Camera microscopio elettronico a scansione.
   Nota: Imaging condizioni, cioè tensione, corrente e lavora a distanza dovrà essere ottimizzati per ottenere la risoluzione desiderata per una determinata applicazione.

Microscopia a forza atomica (AFM)

1. Montare il lato di radice del dispositivo PDMS fino il titolare di un esemplare AFM. Per aumentare il contrasto nella fotocamera e distinguere più facilmente la radice dal PDMS, posizionare il dispositivo PDMS su un substrato piatto riflettente (come mica rivestita in oro) prima di montare il dispositivo sul portacampioni AFM.
2. Fissare un attacco ben liquido sopra il dispositivo PDMS e riempirlo con acqua per mantenere le radici idratate durante la formazione immagine.
3. Caricare il portacampioni in AFM. Regolare il controllo di z per lo spessore del dispositivo PDMS e guidare il cantilever nella regione di interesse sulla radice usando una macchina fotografica come guida.
4. Allineare il laser con la punta del cantilever. Per ottenere risultati ottimali con formazione immagine modalità di contatto, utilizzare cantilever con costanti delle molle di 0,01 o 0,03 N/m per esercitare una forza minima sulla radice durante la scansione.
5. Abbassare lentamente il meccanismo di scansione fino a mensola appena entra in contatto con il campione. Regolare le dimensioni di scansione per la regione desiderata e scegliere una velocità di scansione di 1 linea/s con 256 punti di tensione per ogni riga. Acquisire la scansione.

Risultati

I dispositivi microfluidici di due-strato PDMS qui descritti hanno un canale alta 200 µm per la radice principale di Arabidopsis e una camera alta di 20 µm per confinare lateralmente cresciti peli radicali (Figura 1A). Questo disegno può essere utilizzato per le specie vegetali con diametri di radice simile come Arabidopsis thaliana e possa essere facilmente modificato per ospitare specie di diverse dimensioni. Il disegno incorpo...

Discussione

Il metodo descritto in questo articolo per la creazione di una piattaforma di pianta-on-a-chip è unico in quanto i due strati di design confini i capelli di radice di un unico piano di formazione immagine e la piattaforma può essere decostruiti ed usati come substrato per l'imaging non ottici ad alta risoluzione . Usando la formazione immagine non ottici ad alta risoluzione può fornire informazioni preziose su tessuto della pianta che non poteva essere ottenuto da imaging ottico da solo. Ad esempio, formazione immagin...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Silicon Wafer	WRS Materials	100mm diameter, 500-550um thickness, Prime, 10-20 resistivity, N/Phos<100>
Quintel Contact Aligner	Neutronix Quintel Corp	NXQ 7500 Mask Aligner
Fluorescent Microscope	Nikon	Eclipse Ti-U
laboratory tissue	Kimberly Clark	Kimwipe KIMTECH SCIENCE Brand, 34155
Negative Photoresist Epoxy	Microchem	SU-8 2000s series
Photoresist developer	Microchem	Su-8 developer
trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluoro-octyl)silane	Sigma Aldrich		use in chemical hood
Air Plasma Cleaner	Harrick Plasma
PDMS	Dow Corning	Sylgard 184 Silicone elastomer base
PDMS curing agent	Dow Corning	Sylgard 184 Silicone elastomer curing agent
Dessicator	Bel-Art	F42010-000
Scalpel	X-acto knife
Biopsy Punch	Ted Pella	15110-15
Adhesive tape	Staples	Invisible Tape
Microfuge tube	Eppendorf
Triton X	J.T.Baker XI98-07
Bleach	Chlorox	concentrated
Plant-Based Media	Phyto Technology Laboratories	M524
Agar	Teknova	A7777
Wax film	Parafilm
microscope	Olympus	IX51
Atomic Force Microscope	Keysight Technologies	5500 PicoPlus AFM
Petri dish	VWR
Scanning Electron Microscope	JEOL	7400
Dual Gun Electron Beam Evaporator	Thermionics	Custom Dual Electron Gun Evaporation System