La morphologie de poils absorbants d’Arabidopsis semis dans une bicouche Microfluidic plateforme d’imagerie

Résumé

Cet article montre comment la culture de semis de Arabidopsis thaliana en une plate-forme microfluidique de deux couches qui confine la racine principale et les poils absorbants pour un seul plan optique. Cette plate-forme peut être utilisée pour l’imagerie optique en temps réel de la morphologie de racines fines aussi bien en ce qui concerne l’imagerie haute résolution par d’autres moyens.

Résumé

Poils absorbants augmentent la surface racinaire pour une meilleure absorption de l’eau et l’absorption des nutriments par la plante. Parce qu’ils sont de petite taille et souvent masquée par leur environnement naturel, fonction et morphologie des poils absorbants sont difficiles à étudier et souvent exclus de la recherche sur les plantes. Ces dernières années, les plateformes microfluidiques ont offert un moyen de visualiser le système racinaire à haute résolution sans déranger les racines lors du transfert d’un système d’imagerie. La plate-forme microfluidique présentée ici s’appuie sur des recherches antérieures de plante-on-a-chip en incorporant un dispositif deux couches pour confiner la racine principale de l’Arabidopsis thaliana au même plan optique comme les poils absorbants. Cette conception permet la quantification des poils absorbants sur un téléphone cellulaire et organelle niveau et également empêche l’axe z à la dérive lors de l’ajout de traitements expérimentaux. Nous décrivons comment stocker les appareils dans une ambiance confinée et hydratée, sans la nécessité pour les pompes fluidiques, tout en maintenant un environnement gnotobiotiques pour le semis. Après l’expérience d’imagerie optique, l’appareil peut être démonté et utilisé comme substrat pour la force atomique ou la microscopie électronique à balayage tout en gardant les structures fines racines intactes.

Introduction

Caractéristiques de radicelles augmentent l’eau et l’acquisition de nutriments pour la plante, explorer de nouveaux espaces de sol et d’accroître la superficie totale des racines. Le chiffre d’affaires de ces fonctionnalités de radicelles joue un rôle important dans la stimulation de l' underground chaîne alimentaire¹ et le nombre de racines fines dans certaines espèces de plantes est devrait doubler en dioxyde de carbone atmosphérique élevé². Les radicelles sont généralement définis comme ceux inférieurs à 2 mm de diamètre, bien que les nouvelles définitions préconisent pour caractériser les racines fines par leur fonction³. Comme beaucoup de fines racines, radicelles offrent les fonctions d’absorption et d’absorption mais occupent un espace beaucoup plus petit avec des diamètres de l’ordre du micron. En raison de leur petite taille, poils absorbants sont difficiles à image in situ et sont souvent négligés dans le cadre de l’architecture globale de la racine dans les modèles et les expériences en champ.

Ex terra poil étudie, tel à partir de plants cultivés sur milieu gélosé, ont présenté à la communauté scientifique des renseignements précieux sur la croissance cellulaire et de transport^4,5. Tandis que les boîtes de gélose permettent des systèmes racinaires à être photographiée en temps réel et de façon non destructive, ils ne proposent pas de contrôle de l’environnement élevé pour l’ajout de traitements expérimentaux tels que les éléments nutritifs, hormones de plantes ou de bactéries. Une nouvelle solution pour faciliter l’imagerie haute résolution tout en offrant également contrôle dynamique de l’environnement a été l’avènement de plateformes microfluidiques pour les études de l’usine. Ces plates-formes ont permis la croissance non destructif et la visualisation de plusieurs espèces de plantes à haut rendement phénotypage^6,7,8,9, traitements chimiques isolés ¹⁰, force dimensions^11,12et l’ajout de micro-organismes¹³. Conceptions de plate-forme microfluidiques ont mis l’accent sur l’utilisation de couches fluidique unique espace ouvert dans lequel les racines peuvent se propager, autorisant les poils de la racine à la dérive dans et hors de l’optique mise au point au cours de la croissance ou le traitement.

Nous présentons ici une procédure pour l’élaboration d’une plateforme de microfluidique de deux couches à l’aide de photo et les méthodes douces-lithographie qui s’appuie sur les conceptions précédentes de plante-on-a-chip en limitant les poils absorbants des semis pour le plan d’imagerie de la racine principale. Cela nous permet de suivre le développement de poils absorbants en temps réel, à haute résolution et tout au long du processus de traitement expérimental. Nos méthodes de culture permettent des semis d’Arabidopsis thaliana à être mises à germer des graines au sein de la plate-forme et d’élevage pour une semaine en milieu hydraté et stérile qui ne nécessite pas l’utilisation d’équipements de pompe seringue. Après que l’expérience d’imagerie Time-lapse a conclu, la plateforme présentée ici peut être ouverte sans déranger la position des caractéristiques plus fines racines. Ceci permet l’utilisation d’autres méthodes d’imagerie haute résolution. Nous fournissons ici résultats représentatifs pour la quantification et la visualisation de la morphologie des poils absorbants dans cette plate-forme par microscopie optique, balayage (SEM) et à force atomique techniques de microscopie (AFM).

Protocole

1. deux-couche Fabrication de plate-forme

1. Fabrication des maîtres multicouches
   1. Spin manteau à base d’époxy de résine photosensible négative (~63.45% solides, 1 250 cSt) selon les spécifications du fabricant (2 000 tr/min 45 s) sur une plaquette de silicium de diamètre de 4 pouces pour obtenir la hauteur souhaitée de 20 µm pour la première couche de conception.
   2. Soft-cuire les gaufres resist couché pendant 4 min à 95 ° C. Permettre la plaquette refroidir pour 5 min. exposer la plaquette aux UV pour 15 s (~ 150 mJ/cm² à 365 nm) à travers un photomasque dans un UV contact aligneur pour définir la géométrie de la couche inférieure.
   3. Après l’exposition cuire la galette pendant 5 min à 95 ° C. Sans développer, retourner la gaufrette au spin coater spin et sur une seconde couche de RESINE PHOTOSENSIBLE négative à base d’époxy (~76.75% solides, 80 000 cSt) à 3 000 tr/min pour atteindre une hauteur de deuxième couche de 150 à 200 µm.
   4. Permettre la gaufrette se reposer pendant 5 min avant de les transférer à une plaque chauffante à 95 ° C pendant 45 min. Après la cuisson sur la plaque de cuisson, retirer la plaquette et laisser la résistance se refroidir et durcir à température ambiante pendant 5 min sur une surface plane. Aligner et exposer la gaufrette à la deuxième photomask couche pendant 30 s dans un aligneur de contact UV (dose d’environ 300 mJ/cm²).
   5. Effectuer une cuisson post-exposition en plaçant les tranches sur une plaque de cuisson à 95 ° C pendant 15 minutes et laisser ensuite la plaquette à refroidir sur une surface plane pendant 5 min avant de développer.
   6. Développer les deux couches de résister en même temps en plaçant la plaquette dans un plat en plastique et submergeant la plaquette dans le développeur approprié (voir la Table des matières). Balançant doucement le plat occasionnellement pour lavis développeur fraîche sur la plaquette.
   7. Après 17 minutes, rincez la plaquette avec de l’isopropanol (IPA). Si une pellicule blanche apparaît, continuer à parcourir entre rinçage la plaquette avec le développeur et l’UIE, jusqu'à ce que le film disparaît. Sécher la plaquette de silicium à motifs avec de l’azote.
2. Polydiméthylsiloxane Soft-Lithographie
   1. Exposer la plaquette de silicium d’un plasma d’air pendant 30 s dans un plasma cleaner mis en haut (voir Table des matières) pour nettoyer. Silyler l’hostie du silane trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluoro-n-octyl) sous une hotte chimique sur une plaque chauffante sous le point d’éclair du silane (85 ° C) pendant 2 h.
   2. Verser un ratio 10:1 de polydiméthylsiloxane (PDMS) agent de durcissement sur la plaquette de silicium de maître. Dégazer le PDMS mélangés dans une chambre à vide et puis guérir le polymère dans un four à 70 ° C pendant 1 h ou jusqu'à ce que le PDMS est complètement guéri.
   3. À l’aide d’un scalpel, couper les dispositifs PDMS et pelez-les de la plaquette de silicium de maître. Un coup de poing biopsie 1,5 mm permet de créer des entrées de semences et le traitement, poinçonnage de l’entrée de la graine à un angle de 45° pour encourager la croissance des racines dans le chenal principal.
   4. Ruban adhésif transparent permet d’enlever les débris de l’appareil PDMS et placez le côté design de périphérique sur une lamelle de verre. Stériliser les appareils assemblés.

2. dispositifs de plantation

1. Préparation de semences de Arabidopsis thaliana
   1. Surface de stériliser les graines d’Arabidopsis dans un tube à centrifuger avec une solution d’eau de Javel commercialement disponible 30 % dilué dans un détergent Triton X déminéralisée à eau et 0,1 % pour les semences de lavage de 7 min. 4 fois avec de l’eau stérile.
   2. Stratifier les graines par réfrigération tube à centrifuger pendant la nuit ou jusqu'à une semaine à 4 ° C.
2. Préparation de l’appareil
   1. Placer des dispositifs stérilisés dans un vide dégazage chambre pour enlever l’air du gaz perméable PDMS et canaux fluidiques pour améliorer la facilité de remplissage.
   2. Enlever les dispositifs de la chambre à vide et plonger immédiatement les dispositifs dans une boîte de Pétri remplie de ¼ force végétale un milieu liquide à pH 5,7.
   3. À l’aide d’une pipette, tirer le liquide à travers les bras de mer pour remplir l’appareil. Veillez à ce qu’aucune bulle d’air ne reste au sein de canaux par inspection visuelle.
   4. Transfert des unités individuelles à nouveau Pétri sec. Verser ou une pipette agar chaud autour de l’appareil jusqu'à ce que le niveau de gélose affleure presque au dessus de l’appareil PDMS. Permettre à agar se solidifier.
      NOTE : Les dispositifs sont maintenant prêtes à planter des graines ou peuvent être conservés à 4 ° C jusqu'à ce que nécessaire.
3. Planter des graines dans les dispositifs
   1. Dans un environnement stérile, transférer une graine stérilisée à l’entrée de chaque appareil à l’aide d’une petite pipette.
   2. Couverture de la boîte de Pétri avec de la cire du film (voir Table des matières) et placer dans une chambre de croissance cycle lumière/obscurité ou le rebord de la fenêtre à la température ambiante. Orienter la boîte de Pétri afin que les périphériques sont verticaux et gravité va encourager les racines à se développer à travers le canal.

3. le traitement

1. Traitements expérimentaux
   1. Au moment voulu dans le développement de la plantule, ajouter le traitement expérimental à la plantule en ajoutant un montant prescrit du traitement à chacun des ports 8 côté par pipette.
   2. Refermer la boîte de Pétri et revenir à la chambre de croissance ou une fenêtre.
   3. Aller de l’avant avec l’imagerie des échantillons au moment voulu pour capturer des moments individuels ou commencer imagerie de laps de temps.

4. optique imagerie

1. Abaisser l’imagerie de résolution (4-20 X)
   1. Placer l’ensemble boîte de Pétri contenant l’appareil et le semis sous un microscope inversé champ lumineux pour le champ lumineux de basse résolution (4-20 X) ou l’imagerie (DIC) de contraste interférentiel différentiel. Optimiser les conditions d’éclairage pour élucider les caractéristiques morphologiques d’intérêt en réglant le temps d’exposition, la luminosité de la lampe, ouverture et la polarité de la lumière. Conduire la scène à l’endroit désiré de la racine et se concentrer sur la racine ou le root hair(s) d’intérêt.
   2. Acquérir un moment unique ou une série temporelle d’images. Pour visualiser la croissance des poils absorbants, image croissante des poils absorbants une fois par minute. Pour visualiser la croissance de la racine principale, acquérir une image chaque 30 min. retour la boîte de Pétri et les semis à la chambre de croissance ou le rebord de la fenêtre en position verticale après l’imagerie est terminée.
2. Imagerie de résolution (20-63 X) supérieur
   1. Lorsque la plantule est trop grand pour un temps désiré, utilisez pinces pour retirer la lamelle couvre-objet et dispositif de l’agar. Nettoyer le fond de la lamelle à l’aide d’un tissu de laboratoire éthanol humidifiée.
   2. Appliquer les médias recommandée d’immersion à l’objectif tel que suggéré par le fabricant de lentilles du microscope. Placez le couvre-objet sur la platine du microscope et soulever la scène pour communiquer avec les médias de l’immersion sur l’objectif. Optimiser les conditions d’éclairage en réglant le temps d’exposition, la luminosité de la lampe, ouverture et la polarité de la lumière. Conduire la scène à l’endroit désiré et de se concentrer sur root hair(s) d’intérêt.
      Remarque : La DIC est requis pour visualiser la cyclose et marqueurs fluorescence sont nécessaires pour visualiser le mouvement des organites.
   3. Afin de quantifier la croissance des cheveux de la racine au fil du temps, acquérir une image par min. Afin de visualiser le mouvement des organites, réduire au minimum le temps d’exposition de fluorescence tout en conservant un signal de fluorescence identifiable d’organelles. Acquérir dès que le temps d’exposition permet des images des organites. Pour plus de Time-lapse imagerie, utiliser un incubateur de stade d’imagerie de cellules vivantes pour maintenir l’humidité et la température ambiante.
      Remarque : Un objectif à huile 63 X est recommandé pour imagerie organites de poils absorbants.

5. non optique imagerie

1. Préparation de l’appareil
   1. Lorsque des semis sont trop grand pour la durée souhaitée,

Retirez l’appareil et la lamelle couvre-objet de la boîte de Pétri.

Retournez l’appareil et décollez délicatement la lamelle couvre-objet pour que la racine reste dans le chenal PDMS.

Continuer d’utiliser le dispositif PDMS comme substrat pour la racine dans la force atomique résolution plus élevée ou la microscopie électronique à balayage.

Microscopie électronique à balayage

1. Déposer une fine (~ 20 nm) couche de chrome sur la racine et qui entourent le PDMS en utilisant une double Gun Electron Beam évaporation chambre.
2. Transférer la racine et le dispositif de PDMS devant une chambre du microscope électronique à balayage.
   NOTE : Conditions, c'est-à-dire de tension, distance actuelle et fonctionnel de l’imagerie devra être optimisé pour atteindre la résolution souhaitée pour une application donnée.

Microscopie à Force atomique (AFM)

1. Du côté de racine du périphérique PDMS montent sur un porte-échantillon AFM. Pour augmenter le contraste dans la caméra et la racine plus facilement distinguer le PDMS, placez l’appareil PDMS sur un substrat plat réfléchissant (comme mica revêtu en or) avant de monter l’appareil sur le porte-échantillon AFM.
2. Fixer une attache bien liquide sur le dessus de l’appareil PDMS et remplissez-le d’eau pour garder les racines hydratés pendant la formation image.
3. Insérez le porte-échantillon dans l’AFM. Réglage de la z-pour l’épaisseur de l’appareil PDMS et conduire le cantilever à la région d’intérêt sur la racine à l’aide d’une caméra pour l’orientation.
4. Aligner le laser avec la pointe du levier. Pour de meilleurs résultats avec l’imagerie mode de contact, utilisez poutres en porte-à-faux avec des constantes de printemps de 0,01 ou 0,03 N/m à exercer une force minimale sur la racine lors de la numérisation.
5. Abaissez lentement le mécanisme de balayage jusqu'à ce que le levier soit juste en contact avec l’échantillon. Ajustez la taille de numérisation pour la région souhaitée, puis choisissez une vitesse de balayage de 1 ligne/s avec 256 points de tension par ligne. L’analyse de l’acquisition.

Résultats

La microfluidique PDMS diploblastique décrits ici ont un canal élevé de 200 µm pour la racine principale d’Arabidopsis et une chambre haute de 20 µm à confiner latéralement de plus en plus les poils (Figure 1 a). Cette conception peut être utilisée pour les espèces de plantes avec un diamètre racine semblable comme Arabidopsis thaliana et peut être facilement modifiée pour tenir compte des espèces de différentes tailles....

Discussion

La méthode décrite dans cet article pour la création d’une plate-forme centrale-on-a-chip est unique car les deux couches design confins les poils absorbants pour un seul plan d’imagerie et de la plate-forme peut être déconstruits et utilisés comme substrat pour l’imagerie non optiques de haute résolution . Imagerie non optiques à haute résolution peut fournir des informations précieuses sur le tissu de la plante qui ne peut pas être obtenu de l’imagerie optique seul. Par exemple, l’imagerie AFM peut...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Silicon Wafer	WRS Materials	100mm diameter, 500-550um thickness, Prime, 10-20 resistivity, N/Phos<100>
Quintel Contact Aligner	Neutronix Quintel Corp	NXQ 7500 Mask Aligner
Fluorescent Microscope	Nikon	Eclipse Ti-U
laboratory tissue	Kimberly Clark	Kimwipe KIMTECH SCIENCE Brand, 34155
Negative Photoresist Epoxy	Microchem	SU-8 2000s series
Photoresist developer	Microchem	Su-8 developer
trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluoro-octyl)silane	Sigma Aldrich		use in chemical hood
Air Plasma Cleaner	Harrick Plasma
PDMS	Dow Corning	Sylgard 184 Silicone elastomer base
PDMS curing agent	Dow Corning	Sylgard 184 Silicone elastomer curing agent
Dessicator	Bel-Art	F42010-000
Scalpel	X-acto knife
Biopsy Punch	Ted Pella	15110-15
Adhesive tape	Staples	Invisible Tape
Microfuge tube	Eppendorf
Triton X	J.T.Baker XI98-07
Bleach	Chlorox	concentrated
Plant-Based Media	Phyto Technology Laboratories	M524
Agar	Teknova	A7777
Wax film	Parafilm
microscope	Olympus	IX51
Atomic Force Microscope	Keysight Technologies	5500 PicoPlus AFM
Petri dish	VWR
Scanning Electron Microscope	JEOL	7400
Dual Gun Electron Beam Evaporator	Thermionics	Custom Dual Electron Gun Evaporation System