La morfología del pelo de la raíz de plántulas de Arabidopsis en una plataforma de microfluídica de dos capas de imagen

Resumen

Este artículo muestra cómo cultivar plántulas de Arabidopsis thaliana en una plataforma de dos capas de microfluidos que confina la raíz principal y pelos de la raíz a un solo plano óptico. Esta plataforma puede utilizarse para imágenes ópticas en tiempo real de la morfología de la raíz fina, así en cuanto a la proyección de imagen de alta resolución por otros medios.

Resumen

Pelos de la raíz aumentar la superficie de la raíz para la mejor absorción de agua y absorción de nutrientes por la planta. Porque son de tamaño pequeño y a menudo obscured por su entorno natural, la función y morfología del pelo de la raíz son difíciles de estudiar y a menudo excluidos de la investigación de la planta. En los últimos años, las plataformas microfluídicas han ofrecido una manera de visualizar sistemas radiculares en alta resolución sin perturbar las raíces durante la transferencia a un sistema de proyección de imagen. La plataforma de microfluidos presenta aquí construye en investigaciones anteriores de la planta en un chip mediante la incorporación de un dispositivo de dos capas para limitar la raíz principal de Arabidopsis thaliana en el mismo plano óptico como los pelos de raíz. Este diseño permite la cuantificación de los pelos de la raíz en un celular y organelas nivel y también evita el eje z a la deriva durante la adición de tratamientos experimentales. Se describe cómo almacenar los dispositivos en un ambiente contenido e hidratado, sin necesidad de bombas fluídicas, manteniendo un ambiente gnotobiótico para la plántula. Tras el experimento de proyección de imagen óptico, el dispositivo puede desmontado y utilizado como sustrato de fuerza atómica o microscopía electrónica de barrido manteniendo estructuras fina raíz intacta.

Introducción

Características del bien raíz aumentan agua y adquisición de nutrientes para la planta, explorar nuevos espacios de suelo y el aumento de la superficie total de la raíz. El volumen de negocios de estas características de raíz fina juega un papel importante en estimular la cadena alimenticia metro¹ y el número de raíces finas en determinadas especies de plantas es que doble en dióxido de carbono atmosférico elevado². Raíces finas se definen generalmente como aquellos menores de 2 mm de diámetro, aunque nuevas definiciones de abogan para la caracterización de las raíces finas por su función³. Como muchas raíces finas, pelos de la raíz proporciona la función de absorción y absorción pero ocupan un espacio mucho más pequeño con un diámetro del orden de micras. Debido a su pequeño tamaño, pelos radicales son difíciles de imagen en situ y son a menudo pasados por alto como parte de la estructura general de la raíz en el campo escala experimentos y modelos.

Ex terra pelos estudios, como las plántulas cultivadas en placas de agar, han proporcionado información valiosa sobre el crecimiento celular y transporte^4,5a la comunidad científica. Mientras que las placas de agar permiten sistemas de raíz a ser reflejada de forma no destructiva y en tiempo real, no ofrecen alto control ambiental por la adición de tratamientos experimentales tales como nutrientes, hormonas de plantas o bacterias. Una solución emergente para facilitar la proyección de imagen de alta resolución mientras que también ofrezcan control ambiental dinámico ha sido el advenimiento de las plataformas de microfluidos para estudios de la planta. Estas plataformas han permitido el crecimiento no destructiva y la visualización de varias especies de plantas de alto rendimiento phenotyping^6,7,8,9, tratamientos químicos aislados ¹⁰, de^11,de las medidas de fuerza¹²y la adición de microorganismos¹³. Diseños de plataforma de microfluidos se han centrado en el uso de capas fluídicas único espacio abierto en el que pueden propagar las raíces, permitiendo los pelos de la raíz a la deriva dentro y fuera de foco óptico durante el crecimiento o el tratamiento.

Aquí presentamos un procedimiento para desarrollar una plataforma de microfluidos dos capas utilizando métodos de litografía suave y foto que por el confinamiento de los pelos de la raíz de plántulas en el mismo plano de proyección de imagen que la raíz principal se basa en los diseños de planta-en-un-chip. Esto nos permite seguir el desarrollo de pelos radicales en tiempo real, en alta resolución y en todo el proceso de tratamiento experimental. Nuestros métodos de cultivo permiten plántulas de Arabidopsis thaliana a germinado de la semilla dentro de la plataforma y culta por hasta una semana en un ambiente estéril e hidratada que no requiere el uso de equipo de la bomba de jeringa. Una vez que ha concluido el experimento de Time-lapse, la plataforma presentada aquí puede abrirse sin perturbar la posición de las características más finas de raíz. Esto permite el uso de otros métodos de proyección de imagen de alta resolución. Aquí proporcionamos resultados representativos para la cuantificación y visualización de la morfología del pelo de la raíz en esta plataforma por microscopía óptica, exploración (SEM) y la fuerza atómica técnicas de microscopía (AFM).

Protocolo

1. dos capas fabricación de plataforma

1. Fabricación de múltiples maestros
   1. Vuelta capa de photoresist negativo basado en epoxy (~63.45% sólidos, 1.250 cSt) según las especificaciones del fabricante (2.000 rpm durante 45 s) sobre una oblea de silicio de 4 pulgadas de diámetro para obtener la altura deseada de 20 μm para la primera capa de diseño.
   2. Suave-cueza al horno las obleas recubierta resisten durante 4 min a 95 ° C. Permiten oblea enfriar durante 5 minutos expone la oblea a la luz por 15 UV s (~ 150 mJ/cm² a 365 nm) a través de un photomask en UV en contacto con alineador para definir la geometría de la capa inferior.
   3. Post-exposición cueza al horno la oblea por 5 min a 95 ° C. Sin desarrollar, retomar la oblea el recubridor spin y spin en una segunda capa de photoresist negativo de epoxy-basado (~76.75% sólidos, 80.000 cSt) a 3.000 rpm para conseguir una segunda altura de la capa de 150-200 μm.
   4. Permiten la oblea descansar 5 minutos antes de transferirlas a una placa de 95 ° C por 45 min. Después de hornear sobre la placa, retirar la oblea y permite resistir a enfriar y endurecer a temperatura ambiente durante otros 5 minutos sobre una superficie plana. Alinee y exponer la oblea a la segunda capa photomask durante 30 s en un alineador contacto UV (dosis de aproximadamente 300 mJ/cm²).
   5. Realizar un horneado posterior a la exposición mediante la colocación de la oblea sobre una placa durante 15 min a 95 ° C y luego permitir que la oblea se enfríe sobre una superficie plana durante 5 minutos antes de desarrollar.
   6. Desarrollar ambas capas de resistir simultáneamente colocando la oblea en un plato plástico y sumergir la oblea en el revelador adecuado (véase Tabla de materiales). Muévalo suavemente el plato de vez en cuando para lavar revelador fresco sobre la oblea.
   7. Después de 17 minutos, enjuague la oblea con isopropanol (IPA). Si aparece una película blanca, continúan iterar entre enjuague la oblea con el desarrollador y la IPA hasta que desaparezca la película. Seque la oblea de silicio con motivos con nitrógeno.
2. Polydimethylsiloxane suave-litografía
   1. Exponer la oblea de silicio a un plasma de aire para 30 s en un limpiador de plasma en alta (ver la tabla de materiales) para limpiar. Silanize la oblea con tricloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluoro-n-octilo) silano en una campana química sobre una placa por debajo el punto de inflamación de silano (85 ° C) durante 2 h.
   2. Vierta una relación 10:1 de polidimetilsiloxano (PDMS) de agente de curado en la oblea de silicio principal. Desgasificar la mezcla PDMS en una cámara de vacío y después curar el polímero en un horno de 70 ° C durante 1 hora o hasta que el PDMS esté completamente seca.
   3. Con un bisturí, cortar los dispositivos PDMS y pelar de la oblea de silicio principal. Utilizar un punch de biopsia de 1,5 mm para crear entradas de semilla y tratamiento, perforando la entrada de la semilla en un ángulo de 45° para promover el crecimiento de la raíz en el canal principal.
   4. Utilizar cinta adhesiva transparente para eliminar los residuos desde el dispositivo PDMS y coloque el lado de diseño del dispositivo hacia abajo sobre un cubreobjetos de vidrio. Autoclave de los dispositivos montados.

2. dispositivos de siembra

1. Preparación de la semilla de Arabidopsis thaliana
   1. Superficie de esterilizar las semillas de a. thaliana en un tubo de microcentrífuga con una solución de cloro disponibles en el mercado 30% diluido en desionizada agua 0,1% Triton X detergente para 7 minutos semillas de lavado 4 veces con agua estéril.
   2. Estratificar semillas por tubo de microcentrífuga de refrigeración durante la noche o hasta por una semana a 4 ° C.
2. Preparación del dispositivo
   1. Colocar dispositivos esterilizados en un cámara para eliminar el aire del gas de desgasificación al vacío permeable al PDMS y canales fluídicos para mejorar la facilidad de llenado.
   2. Quite los dispositivos de la cámara de vacío y sumergir inmediatamente los dispositivos en una placa Petri con líquido ¼ fuerza planta basado en los medios de comunicación a pH 5.7.
   3. Usando una pipeta, tirar el líquido a través de las entradas para llenar el dispositivo. Asegúrese de que no hay burbujas de aire siguen siendo dentro de canales por inspección visual.
   4. Transferencia de los dispositivos individuales para nuevos platos de Petri seca. Vierta o pipeta agar caliente alrededor del dispositivo hasta que el agar es casi al ras con la parte superior del dispositivo PDMS. Permita que el agar solidifique.
      Nota: Dispositivos ahora están listos para plantar semillas o pueden almacenarse a 4 ° C hasta que se necesite.
3. Plantar semillas dentro de los dispositivos
   1. En un ambiente estéril, transferir una semilla esterilizada a la entrada de cada dispositivo con una pipeta pequeña.
   2. Cubierta de la caja Petri con cera (véase Tabla de materiales) de la película y colocar en una cámara de crecimiento ciclo luz/oscuridad o alféizar de la ventana a temperatura ambiente. Orientar la placa de Petri para que los dispositivos son verticales y gravedad animará las raíces para crecer a través del canal.

3. tratamiento

1. Tratamientos experimentales
   1. En el tiempo deseado en el desarrollo de la plántula, añadir el tratamiento experimental a la plántula mediante la adición de una cantidad indicada del tratamiento a cada uno de los puertos 8 laterales a través de la pipeta.
   2. Volver a cerrar herméticamente la caja Petri y vuelve a cámara de crecimiento o alféizar de la ventana.
   3. Proceder con muestras de la proyección de imagen en el tiempo deseado para capturar puntos de tiempo individuales o comenzar imágenes de lapso de tiempo.

4. óptica imágenes

1. Baja resolución (4-20 X) imagen
   1. Lugar la toda placa de Petri que contiene el dispositivo y la plántula bajo un microscopio de campo brillante invertida para campo brillante de baja resolución (4-20 X) o proyección de imagen de interferencia diferencial (DIC) de contraste. Optimizar las condiciones de iluminación para dilucidar las características morfológicas de interés mediante el ajuste de tiempos de exposición, brillo de la lámpara, diafragma y la polaridad de la luz. Conducir la etapa a la zona deseada de la raíz y el enfoque en la raíz o root hair(s) de interés.
   2. Adquirir un momento único o una serie de tiempo de imágenes. Para visualizar el crecimiento de los pelos radicales, la imagen cada vez más pelos de la raíz una vez por minuto. Para visualizar el crecimiento de la raíz principal, adquirir una imagen cada 30 minutos regreso la caja Petri y las plantas de semillero a cámara de crecimiento o alféizar de la ventana en posición vertical después de la proyección de imagen.
2. Proyección de imagen de mayor resolución (20-63 X)
   1. Una vez que la plántula ha crecido en un tiempo deseado, utilizar pinzas para quitar el cubreobjetos y el dispositivo del agar. Limpie la parte inferior del cubreobjetos utilizando un laboratorio etanol humedecido.
   2. Aplicar los medios de comunicación de inmersión recomendada para el objetivo según lo sugerido por el fabricante de la lente del microscopio. Coloque el cubreobjetos sobre la platina del microscopio y levantar la etapa para comunicarse con los medios de inmersión en el objetivo. Optimizar las condiciones de iluminación mediante el ajuste de tiempos de exposición, brillo de la lámpara, diafragma y la polaridad de la luz. Conducir la etapa el área deseada y en root hair(s) de interés.
      Nota: DIC es necesaria para visualizar la corriente citoplasmática, y marcadores de fluorescencia son necesarios para visualizar el movimiento de organelas.
   3. Para cuantificar el crecimiento del pelo de raíz con el tiempo, adquirir una imagen por minuto. Para visualizar el movimiento de organelas, minimizar el tiempo de exposición de fluorescencia conservando una señal identificable de la fluorescencia de los organelos. Adquirir tan pronto como el tiempo de exposición permite imágenes de los organelos. Para más imágenes de lapso de tiempo, utilizar una incubadora de escenario imágenes de células vivas para mantener la humedad y la temperatura ambiente.
      Nota: Se recomienda un objetivo de aceite X 63 para proyección de imagen de pelo de la raíz de organelos.

5. no-imágenes ópticas

1. Preparación del dispositivo
   1. Una vez que la plántula ha crecido para el tiempo deseado,

Quite el dispositivo y el cubreobjetos de la caja Petri.

Voltee el dispositivo hacia abajo y suavemente retire lo cubreobjetos para que la raíz se mantiene dentro del canal PDMS.

Proceder a utilizar el dispositivo PDMS como sustrato de la raíz en mayor fuerza de resolución atómica o microscopía electrónica.

Microscopía electrónica de barrido

1. Depositar una delgada (~ 20 nanómetro) capa de cromo sobre la raíz y alrededor de PDMS con un arma de electrón viga evaporación bicamerales.
2. Transferencia de la raíz y el dispositivo PDMS para una cámara de microscopio electrónico de barrido.
   Nota: Condiciones, es decir, voltaje, corriente y trabajo a distancia de la proyección de imagen tendrá que ser optimizado para lograr la resolución deseada para una aplicación determinada.

Microscopía de fuerza atómica (AFM)

1. Monte lo PDMS dispositivo raíz para arriba en un sostenedor del espécimen de la AFM. Para aumentar el contraste en la cámara y más fácil distinguir la raíz de los PDMS, coloque el dispositivo PDMS sobre un sustrato plano reflectante (como la mica revestida en oro) antes de montar el dispositivo en el soporte de espécimen AFM.
2. Asegurar un accesorio bien líquido sobre el dispositivo PDMS y llenarlo con agua para mantener las raíces hidratadas durante proyección de imagen.
3. Cargue el soporte del espécimen en la AFM. Ajuste el control z para el grueso del dispositivo PDMS y conducir el voladizo a la región de interés en la raíz usando una cámara para la dirección.
4. Alinear el láser con la punta del voladizo. Para obtener mejores resultados con la proyección de imagen modo de contacto, utilizar voladizos con constantes del resorte de 0.01 o 0.03 N/m para ejercer fuerza mínima en la raíz durante la exploración.
5. Baje lentamente el mecanismo de exploración hasta el voladizo en contacto con la muestra. Ajustar el tamaño de exploración de la región deseada y elija una velocidad de exploración de 1 línea/s con 256 puntos de voltaje por línea. Adquirir la exploración.

Resultados

Los dispositivos de microfluidos PDMS dos capas descritos aquí tienen un canal alta de 200 μm en la principal raíz de Arabidopsis y una cámara alta de 20 μm a confinar lateralmente crecientes pelos de la raíz (figura 1A). Este diseño puede usarse para especies con diámetros de raíz similares como Arabidopsis thaliana y puede ser fácilmente modificado para alojar especies de diferentes tamaños. El diseño incorpora una ent...

Discusión

El método descrito en este artículo para crear una plataforma de planta-en-un-chip es único en que las dos capas diseño confines los pelos de la raíz a un solo plano de proyección de imagen y la plataforma puede deconstruyen y utilizados como sustrato para la proyección de imagen de alta resolución no ópticos . Usando proyección de imagen no ópticos de alta resolución puede proporcionar información valiosa sobre el tejido de la planta que no se podía obtener de la proyección de imagen óptica sola. Por eje...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Silicon Wafer	WRS Materials	100mm diameter, 500-550um thickness, Prime, 10-20 resistivity, N/Phos<100>
Quintel Contact Aligner	Neutronix Quintel Corp	NXQ 7500 Mask Aligner
Fluorescent Microscope	Nikon	Eclipse Ti-U
laboratory tissue	Kimberly Clark	Kimwipe KIMTECH SCIENCE Brand, 34155
Negative Photoresist Epoxy	Microchem	SU-8 2000s series
Photoresist developer	Microchem	Su-8 developer
trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluoro-octyl)silane	Sigma Aldrich		use in chemical hood
Air Plasma Cleaner	Harrick Plasma
PDMS	Dow Corning	Sylgard 184 Silicone elastomer base
PDMS curing agent	Dow Corning	Sylgard 184 Silicone elastomer curing agent
Dessicator	Bel-Art	F42010-000
Scalpel	X-acto knife
Biopsy Punch	Ted Pella	15110-15
Adhesive tape	Staples	Invisible Tape
Microfuge tube	Eppendorf
Triton X	J.T.Baker XI98-07
Bleach	Chlorox	concentrated
Plant-Based Media	Phyto Technology Laboratories	M524
Agar	Teknova	A7777
Wax film	Parafilm
microscope	Olympus	IX51
Atomic Force Microscope	Keysight Technologies	5500 PicoPlus AFM
Petri dish	VWR
Scanning Electron Microscope	JEOL	7400
Dual Gun Electron Beam Evaporator	Thermionics	Custom Dual Electron Gun Evaporation System