JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Эта статья демонстрирует культура Arabidopsis thaliana саженцев в два слоя microfluidic платформа, которая ограничивает главного корня и корневые волоски на одной оптической плоскости. Эта платформа может использоваться для реального времени оптических изображений тонкой корень морфологии, а также как с высоким разрешением изображений другими средствами.

Аннотация

Корневые волоски увеличивают площадь поверхности корня для лучшего поглощения воды и усвоение питательных веществ растениями. Потому что они небольшого размера и часто скрыт в их естественной среде обитания, корень волос морфологии и функции трудно изучить и часто исключены из исследования растений. В последние годы microfluidic платформы предлагают способ визуализации корневых систем с высоким разрешением не нарушая корни во время передачи изображений системы. Microfluidic платформа представленные здесь строит на предыдущих исследований растений на чипе, включив устройство двухслойная ограничиться Arabidopsis thaliana главный корень же оптических плоскости как корневые волоски. Эта конструкция позволяет количественного определения корневых волосков на сотовые и органелл уровне, а также предотвращает z-axis дрейфующих во время добавления экспериментальное лечение. Мы опишем, как для хранения устройства в автономной и увлажненной среде, без необходимости для оптимизированных насосов, сохраняя при этом gnotobiotic среды для рассады. После оптических изображений эксперимента устройство может разбирать и используется как субстрат для атомно-силовой или растровая электронная микроскопия при сохранении тонкой корневых структур.

Введение

Особенности тонкой корень увеличить воды и питательных веществ приобретение для растений, изучение новых пространств почвы и увеличения площади поверхности общий корень. Оборот этих функций тонкой корень играет важную роль в стимулировании подземных пищевой цепи1 и количество тонкой корней в некоторых видов растений является ожидается двойной под повышенной атмосферной двуокиси углерода2. Тонкой корни обычно определяются как те меньше 2 мм в диаметре, хотя новые определения выступают за характеризующие тонкой корни их функции3. Как многие прекрасные корни корневые волоски предоставляют функцию поглощения и поглощения, но занимают гораздо меньше места с диаметром порядка мкм. Из-за их малого размера корневые волоски трудно изображение в situ и часто игнорируются как часть общей архитектуры корня в поле Масштаб экспериментов и модели.

Ex Терра корневого волоска исследований, таких как сеянцев, выращенных на плитах агара, обеспечили научное сообщество с ценной информацией о клеточного роста и транспорта4,5. В то время как агар пластины позволяют корневых систем к записи образа необратимых и в режиме реального времени, они не предлагают высокого экологического контроля для добавления экспериментальные методы лечения, такие как питательные вещества, гормоны растений или бактерий. Новые решения для облегчения отображения с высоким разрешением также предоставив динамических экологического контроля был появлением microfluidic платформ для исследования растений. Эти платформы позволили неразрушающего роста и визуализации нескольких видов растений для высокой пропускной способности фенотипирование6,7,8,9, изолированные химических обработок 10, силы измерения11,12и добавлением микроорганизмов13. Microfluidic платформа конструкции были сосредоточены на использовании одного открытого пространства аэрогидродинамических слои, в которых могут распространять корни, позволяющие корневые волоски дрейфа и уменьшать оптический фокус во время роста или лечения.

Здесь мы представляем процедура разработки двухслойная microfluidic платформа с помощью фото и софт литография методов, которая опирается на предыдущие проекты завод на чипе, ограничивая Рассада корневых волосков в той же плоскости изображения как главный корень. Это позволяет нам отслеживать развитие корня волос в режиме реального времени, с высоким разрешением и на протяжении всего процесса экспериментальное лечение. Наши методы культивирования позволяют Arabidopsis thaliana Саженцы проросшие от семян в рамках платформы и культивировали в течение до недели в гидратированных и стерильной среде, которая не требует использования шприц насосного оборудования. После заключил покадровой изображений эксперимент, платформы, представленные здесь может быть открыт не нарушая положение тонкие функции корня. Это позволяет использовать другие методы обработки изображений высокого разрешения. Здесь мы предоставляем представитель результаты для количественной оценки и визуализации корневого волоска морфологии в этой платформе, оптический, сканирование электронная микроскопия (SEM) и атомно-силовой методы микроскопии (АСМ).

протокол

1. двухслойная изготовление платформы

  1. Изготовление многослойных мастеров
    1. Спин пальто на основе эпоксидных негативного фоторезиста (~63.45% тел, 1250 КНТ) согласно спецификации изготовителя (2000 rpm для 45 s) на 4-дюймовый диаметр кремниевой пластины для получения желаемой высоты 20 мкм для первого слоя дизайн.
    2. Софт выпекать противостоять покрытием пластин 4 мин на 95 ° C. Разрешить пластин для охлаждения для 5 минут разоблачить пластин к Ультрафиолетовому свету для 15 s (~ 150 МДж/см2 на 365 Нм) через photomask в УФ контакт выравниватель для определения геометрии нижнего слоя.
    3. Постконтактная выпекать вафельные для 5 мин при 95 ° C. Без разработки, вернуть Вафля спин coater и спина на второй слой на основе эпоксидных негативного фоторезиста (~76.75% тел, 80000 КНТ) при 3000 об/мин для достижения второй слой высотой 150-200 мкм.
    4. Разрешить вафельные отдохнуть в течение 5 мин до перехода на 95 ° C плитой по 45 мин. После выпечки на конфорку, удалите пластины и позволяют противостоять остыть и затвердеть при комнатной температуре еще 5 мин на плоской горизонтальной поверхности. Выравнивание и разоблачить пластин для второго слоя фотошаблонов для 30 s в контакт выравниватель УФ (доза приблизительно 300 МДж/см2).
    5. Выполните постконтактная выпекать, поместив пластины на конфорку 15 мин при температуре 95 ° C, а затем позволить пластин для охлаждения на плоской горизонтальной поверхности на 5 мин до начала разработки.
    6. Развивать оба слоя противостоять одновременно, поместив вафля в пластиковую посуду и погружаемой вафельные в соответствующему разработчику (см. Таблицу материалов). Осторожно покачайте блюдо периодически мыть свежие разработчика над пластины.
    7. После 17 мин промойте пластины с изопропиловый спирт (IPA). Если появляется белый фильм, по-прежнему прохода между полоскания пластины с разработчиком и IPA, до тех пор, пока фильм исчезает. Сухие узорной кремниевой пластины с азотом.
  2. Полидиметилсилоксан Soft литография
    1. Разоблачить кремниевой пластины для воздушно-плазменной 30 s в плазме более чистых на высокой (см. таблицу материалов) для очистки. Silanize вафель с трихлор (1H, 1 Ч, 2 Ч, 2H-перфтор n октиловый) силана в химические вытяжки на конфорку ниже температуры вспышки Силан (85 ° C) за 2 ч.
    2. Залейте 10:1 соотношение полидиметилсилоксан (PDMS) отвердителя на главной пластины кремния. Дега смешанных PDMS в вакуумной камере и затем вылечить полимера в 70 ° C духовку на 1 час или до PDMS полностью вылечить.
    3. С помощью скальпеля, вырезать PDMS устройства и очистите их от главной пластины кремния. Для создания семян и лечения заливов, пробивая входе семян под углом 45° для поощрения роста корней в основной канал, используйте удар биопсии 1,5 мм.
    4. Используйте ясно Скотч для удаления мусора из PDMS устройства и место находится на стороне устройства дизайн вниз на coverslip стекла. Автоклав сборных устройств.

2. Посадка устройства

  1. Подготовка семян Резуховидка Таля
    1. Поверхность стерилизовать A. thaliana семена в отцентрифугировать трубку с раствором 30% коммерчески доступных отбеливателя разбавленных в деионизированной воды и 0,1% тритон X моющее средство для 7 мин мыть семена 4 раза с стерильной водой.
    2. Стратифицировать семена по холодильным отцентрифугировать трубки, на ночь или до недели при 4 ° C.
  2. Подготовка устройства
    1. Место стерилизованные устройств в вакуумной дегазации камеры для удаления воздуха из газа проницаемыми PDMS и оптимизированных каналы улучшить легкость заполнения.
    2. Удаление устройства из вакуумной камеры и сразу погружаться в чашку Петри, заполнены с жидким ¼ СМИ завод основан прочность при рН 5,7 устройства.
    3. С помощью пипетки, забирают жидкость через отверстия для заполнения устройство. Убедитесь, что нет пузырьков воздуха остаются внутри каналов путем визуального осмотра.
    4. Передача отдельных устройств для новых сухой Петри. Налить или Пипетка горячие агар вокруг устройства до тех пор, пока уровень агар почти заподлицо с верхней части устройства PDMS. Разрешить агар затвердеть.
      Примечание: Устройства теперь готовы для посадки семян или можно хранить при 4 ° C до тех пор, пока требуется.
  3. Засаживать семена внутри устройства
    1. В стерильных условиях передача одной стерилизации семян на входе каждого устройства, с помощью небольшой пипетки.
    2. Обложка Петри с воском фильм (см. Таблицу материалов) и поместите в свет/темно Велоспорт рост палата или подоконнике при комнатной температуре. Ориент Петри блюдо, так что устройства вертикальных и тяжести будет поощрять корни расти через канал.

3. лечение

  1. Экспериментальные методы лечения
    1. В нужный момент в развитии рассады добавьте экспериментальное лечение для рассады, добавив предписанное количество обращения к каждому из портов 8 стороне через пипетку.
    2. Запечатайте Петри и вернуться к рост палата или подоконник.
    3. Продолжите изображений образцов в нужный момент захвата отдельных время точек или начать изображений промежуток времени.

4. оптическая томография

  1. Ниже изображения резолюции (4-20 X)
    1. Поместите всю Петри, содержащие устройства и рассада под микроскопом Перевернутый яркие поля для нижней резолюции (4-20 X) яркие поля или изображения контрастность (DIC) дифференциальной помехи. Оптимизация условий освещения для выяснения морфологических особенностей интереса путем корректировки времени экспозиции, яркости лампы, диафрагмы и полярность света. Привод сцену в нужной области корня и сосредоточиться на корень или root hair(s) интерес.
    2. Приобрести один момент или временных рядов изображений. Чтобы визуализировать роста корневых волосков, изображение растущего корневых волосков раз в мин. Чтобы визуализировать роста главного корня, приобрести одно изображение каждые 30 мин возвращение Петри и саженцы рост палата или подоконник в вертикальном положении после завершения обработки изображений.
  2. Выше изображения резолюции (20-63 X)
    1. После того, как саженец выросла в течение желаемого времени, используйте щипцы для удаления coverslip и устройства из агар. Очистите от нижней части coverslip, с использованием этанола смоченные Лаборатория ткани.
    2. Применить Рекомендуемые погружения СМИ к цель предложенная производителем объектива микроскопа. Поместите на микроскопа coverslip вниз и поднять на сцену, чтобы связаться погружения СМИ на цель. Оптимизация условий освещения, регулируя времени экспозиции, яркости лампы, диафрагмы и полярность света. Привод сцену в нужной области и сосредоточиться на root hair(s) интерес.
      Примечание: DIC необходимо визуализировать цитоплазматических потокового, и флуоресценции маркеры необходимы для визуализации органелл движения.
    3. Чтобы количественно рост корня волос со временем, приобрести одно изображение в минуту. Чтобы визуализировать органелл движения, свести к минимуму время экспозиции флуоресценции сохраняя identifiable флуоресцирование сигнал от органеллы. Получение изображений органеллы так быстро, как позволит время экспозиции. Для больше покадровой изображений, используйте клеток изображений стадии инкубатор для поддержания температуры окружающей среды и влаги.
      Примечание: 63 X нефти цели рекомендуется для визуализации корневого волоска органеллы.

5. не оптических изображений

  1. Подготовка устройства
    1. После того, как рассада выросла на нужное время,
Удалите с устройства и coverslip Петри.
  • Включите устройство вверх ногами и аккуратно очистить от coverslip, так что корень остается в пределах канала PDMS.
  • Продолжать использовать устройство PDMS как субстрат для корня в выше резолюции атомно-силовой или растровая электронная микроскопия.
  • Сканирующая электронная микроскопия
    1. Депозит тонким (~ 20 Нм) слой хрома на корень и окружающих PDMS, используя двойной камеры испарения пучка электронов пистолет.
    2. Передача корня и PDMS устройства к камере сканирующий электронный микроскоп.
      Примечание: Imaging условий, т.е. напряжение, текущих и рабочее расстояние будет нужно быть оптимизированы для достижения желаемого резолюции для данного приложения.
  • Атомно-силовой микроскопии (АСМ)
    1. Смонтируйте корневой стороне устройства PDMS вверх на AFM держатель образца. Чтобы увеличить контраст в камеру и более легко различать корень от PDMS, место PDMS устройство на плоской отражающей подложку (например, слюда, с покрытием золотом) перед установкой устройства на держатель образца AFM.
    2. Безопасный жидкость хорошо вложений на устройство PDMS и заполнить его водой, чтобы сохранить корни, гидратированный во время визуализации.
    3. Загрузите держатель образца в AFM. Z-регулятор для толщины PDMS устройства и управлять консольные в регионе интереса на корень, с помощью камеры для руководства.
    4. Выравнивание лазера с кончика кантилевера. Для достижения наилучших результатов с режим контакта изображений используйте кантилеверы с весны константы 0,01 или 0,03-N/м приложить минимальные силы на корень во время сканирования.
    5. Медленно опустите механизм сканирования до консольные просто делает контакт с образцом. Отрегулируйте размер сканирования для желаемого региона и выбрать скорость сканирования 1 линия/с с 256 точек напряжения в строке. Приобрести сканирования.

    • Результаты

    Двухслойная PDMS microfluidic устройства описанных здесь иметь 200 мкм высокой канал для главного корня Arabidopsis и высокой палаты 20 мкм ограничиться боково растущего корневые волоски (рис. 1A). Эта конструкция может использоваться для видов растений с аналоги?...

    Обсуждение

    Метод, описанный в этой статье для создания платформы завод на чипе является уникальным в том, что два слоя дизайн рамки корневые волоски на одной плоскости изображения и платформы может быть деконструкции и используется как субстрат для не оптических изображений высокого разрешения ....

    Раскрытие информации

    Авторы не имеют ничего сообщать.

    Благодарности

    Эта рукопись была автором UT-Battelle, ООО под контракт № ДЕ AC05-00OR22725 с Департаментом энергетики США. Правительство Соединенных Штатов сохраняет и издатель, приняв статьи для публикации, признает, что правительство Соединенных Штатов сохраняет неисключительную, оплаченного, безотзывный, всемирно лицензию для публикации или воспроизвести опубликованной форме Эта рукопись, или позволить другим сделать это, для целей правительства Соединенных Штатов. Министерство энергетики будет предоставлять общественности доступ к этим результатам федерально спонсируемых исследований в соответствии с планом Доу публичного доступа (http://energy.gov/downloads/doe-public-access-plan).

    Эта работа частично поддержали программу геномной науки, Департамента энергетики США, управление науки, биологических и экологических исследований, как часть растений Микроб интерфейсы научной области фокуса (http://pmi.ornl.gov). Изготовление microfluidic платформ была проведена в нанотехнологические исследовательской лаборатории в центре для Nanophase материаловедение, которые является DOE отделение науки пользователя объекта. JAA поддерживается NSF выпускников стипендий DGE-1452154

    Материалы

    NameCompanyCatalog NumberComments
    Silicon WaferWRS Materials100mm diameter, 500-550um thickness, Prime, 10-20 resistivity, N/Phos<100>
    Quintel Contact AlignerNeutronix Quintel CorpNXQ 7500 Mask Aligner
    Fluorescent MicroscopeNikonEclipse Ti-U
    laboratory tissueKimberly ClarkKimwipe KIMTECH SCIENCE Brand, 34155
    Negative Photoresist EpoxyMicrochemSU-8 2000s series
    Photoresist developerMicrochemSu-8 developer
    trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluoro-octyl)silaneSigma Aldrichuse in chemical hood
    Air Plasma CleanerHarrick Plasma
    PDMSDow CorningSylgard 184 Silicone elastomer base
    PDMS curing agentDow CorningSylgard 184 Silicone elastomer curing agent
    DessicatorBel-ArtF42010-000
    ScalpelX-acto knife
    Biopsy PunchTed Pella15110-15
    Adhesive tapeStaplesInvisible Tape
    Microfuge tubeEppendorf
    Triton XJ.T.Baker XI98-07
    BleachChloroxconcentrated
    Plant-Based MediaPhyto Technology LaboratoriesM524
    AgarTeknovaA7777
    Wax filmParafilm
    microscopeOlympusIX51
    Atomic Force MicroscopeKeysight Technologies5500 PicoPlus AFM
    Petri dishVWR
    Scanning Electron MicroscopeJEOL7400
    Dual Gun Electron Beam EvaporatorThermionicsCustom Dual Electron Gun Evaporation System

    Ссылки

    1. Pritchard, S. G. Soil organisms and global climate change. Plant Pathol. 60 (1), 82-99 (2011).
    2. Norby, R. J., Ledford, J., Reilly, C. D., Miller, N. E., O'Neill, E. G. Fine-root production dominates response of a deciduous forest to atmospheric CO2 enrichment. Proc. Natll. Acad. Sci. USA. 101 (26), 9689-9693 (2004).
    3. McCormack, M. L., et al. Redefining fine roots improves understanding of below-ground contributions to terrestrial biosphere processes. New Phytol. 207 (3), 505-518 (2015).
    4. Mangano, S., Juarez, S. P. D., Estevez, J. M. ROS regulation of polar-growth in plant cells. Plant Physiol. 171 (3), 1593-1605 (2016).
    5. Ketelaar, T., Emons, A. M. The Actin Cytoskeleton in Root Hairs: A Cell Elongation Device. Root Hairs. , 211-232 (2009).
    6. Grossmann, G., et al. The RootChip: an integrated microfluidic chip for plant science. Plant Cell. 23 (12), 4234-4240 (2011).
    7. Grossmann, G., et al. Time-lapse fluorescence imaging of Arabidopsis root growth with rapid manipulation of the root environment using the RootChip. J. Vis. Exp. (65), (2012).
    8. Jiang, H., Xu, Z., Aluru, M. R., Dong, L. Plant chip for high-throughput phenotyping of Arabidopsis. Lab Chip. 14 (7), 1281 (2014).
    9. Busch, W., et al. A microfluidic device and computational platform for high-throughput live imaging of gene expression. Nat. Methods. 9 (11), (2012).
    10. Meier, M., Lucchettta, E., Ismagilov, R. Chemical Stimulation of the Arabidopsis thaliana Root using Multi-Laminar Flow on a Microfluidic Chip. Lab Chip. 10 (16), 2147-2153 (2010).
    11. Ozoe, K., Hida, H., Kanno, I., Higashiyama, T., Notaguchi, M. Early characterization method of plant root adaptability to soil environments. Proc. of 28th IEEE Interntl. Conf. Micro. Electro Mech. Syst. , (2015).
    12. Sanati Nezhad, A. Microfluidic platforms for plant cells studies. Lab on a chip. , 3262-3274 (2014).
    13. Parashar, A., Pandey, S. Plant-in-chip: Microfluidic system for studying root growth and pathogenic interactions in Arabidopsis. App. Phys. Lett. 98 (26), 2009-2012 (2011).
    14. Rigas, S., et al. Root gravitropism and root hair development constitute coupled developmental responses regulated by auxin homeostasis in the Arabidopsis root apex. New Phytolol. 197 (4), 1130-1141 (2013).
    15. Bengough, A. G., McKenzie, B. M., Hallett, P. D., Valentine, T. A. Root elongation, water stress, and mechanical impedance: A review of limiting stresses and beneficial root tip traits. J. Exp. Bot. 62 (1), 59-68 (2011).
    16. Sia, S. K., Whitesides, G. M. Microfluidic devices fabricated in poly(dimethylsiloxane) for biological studies. Electrophor. 24 (21), 3563-3576 (2003).
    17. Millet, L. J., Stewart, M. E., Sweedler, J. V., Nuzzo, R. G., Gillette, M. U. Microfluidic devices for culturing primary mammalian neurons at low densities. Lab chip. 7 (8), 987-994 (2007).
    18. Nelson, B. K., Cai, X., Nebenführ, A. A multicolored set of in vivo organelle markers for co-localization studies in Arabidopsis and other plants. Plant J. 51 (6), 1126-1136 (2007).
    19. Talbot, M. J., White, R. G. Cell surface and cell outline imaging in plant tissues using the backscattered electron detector in a variable pressure scanning electron microscope. Plant Methods. 9 (1), 40 (2013).

    Перепечатки и разрешения

    Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

    Запросить разрешение

    Смотреть дополнительные статьи

    126Arabidopsis thalianaSEMAFM

    This article has been published

    Video Coming Soon

    JoVE Logo

    Конфиденциальность

    Условия эксплуатации

    Политика

    СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

    РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

    НОВОСТИ JoVE

    Исследования

    Образование

    АВТОРЫ

    Библиотекарь

    О JoVE

    Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены