A raiz do cabelo morfologia de plântulas de Arabidopsis em uma plataforma Microfluidic de duas camadas de imagem

Resumo

Este artigo demonstra como a cultura de plântulas de Arabidopsis thaliana em uma plataforma de dois-camada microfluidic que restringe a raiz principal e cabelos de raiz para um único plano ótico. Esta plataforma pode ser usada para a imagem latente de óptica em tempo real da morfologia da raiz bem bem como quanto à geração de imagens de alta resolução por outros meios.

Resumo

Pelos radiculares aumentam a área de superfície de raiz para melhor absorção de água e absorção de nutrientes pela planta. Porque eles são pequenos em tamanho e muitas vezes obscurecido pelo seu ambiente natural, função e morfologia da raiz do cabelo são difíceis de estudar e muitas vezes excluídos da pesquisa da planta. Nos últimos anos, plataformas microfluidic tem oferecido uma maneira de visualizar os sistemas de raiz em alta resolução sem perturbar as raízes durante a transferência de um sistema de imagem. A plataforma microfluidic aqui apresentados compilações em pesquisas anteriores de planta-em-um-microplaqueta ao incorporar um dispositivo de duas camadas para confinar a raiz principal de Arabidopsis thaliana ao mesmo plano óptico como os pelos da raiz. Este projeto permite a quantificação dos cabelos de raiz em um celular e organela nível e também impede o eixo z à deriva durante a adição de tratamentos experimentais. Descrevemos como armazenar os dispositivos em um ambiente contido e hidratado, sem a necessidade de bombas fluídico, mantendo um ambiente de gnotobiotic para o seedling. Após a experiência de imagem óptica, o dispositivo pode ser desmontado e usado como um substrato para a força atômica ou microscópio eletrônico de varredura, mantendo estruturas bem raiz intacta.

Introdução

Características de bem de raiz aumentar água e aquisição de nutrientes para a planta, explorando novos espaços do solo e aumentar a área da superfície total da raiz. O volume de negócios desses recursos raiz bem desempenha um papel importante em estimular o metro cadeia alimentar¹ e o número de raizes finas em determinadas espécies de plantas é esperado dobrar sob elevado de dióxido de carbono atmosférico². Raizes finas são geralmente definidos como aqueles menores que 2 mm de diâmetro, embora novas definições defendem caracterizando raizes finas por sua função³. Como muitas raizes finas, cabelos de raiz fornecem a função de captação e absorção, mas ocupam um espaço muito menor com diâmetros da ordem de micra. Por causa de seu tamanho pequeno, pelos radiculares são difíceis de imagem em situ e são negligenciados frequentemente como parte da arquitetura geral da raiz em experimentos de campo escala e modelos.

Ex terra raiz cabelo estuda, tal a partir de mudas cultivadas em placas de ágar, forneceram a comunidade científica com informações valiosas sobre o crescimento celular e transporte^4,5. Enquanto as placas de ágar permitem sistemas de raiz ser fotografada não-destrutiva e em tempo real, eles não oferecem alta controle ambiental para a adição de tratamentos experimentais como nutrientes, hormonas vegetais ou bactérias. Uma emergente solução para facilitar a alta resolução de imagem, enquanto também proporcionar controle ambiental dinâmico foi o advento das plataformas microfluidic para estudos de planta. Essas plataformas permitiram o crescimento não-destrutivos e visualização de várias espécies de plantas para alto throughput fenotipagem^6,7,8,9, tratamentos químicos isolados ¹⁰, medições de força^11,12e a adição de microorganismos¹³. Projetos de plataforma microfluidic centraram-se na utilização de camadas fluídico único espaço aberto, no qual as raízes podem propagar, permitindo que os cabelos de raiz à deriva dentro e fora de foco óptico durante o crescimento ou tratamento.

Aqui nós apresentamos um procedimento para o desenvolvimento de uma plataforma de dois-camada microfluidic usando métodos de macio-litografia e foto que baseia-se projetos de planta-em-um-microplaqueta anteriores por confinar os cabelos de raiz de mudas para o mesmo plano de imagem como a raiz principal. Isso nos permite acompanhar o desenvolvimento da raiz do cabelo em tempo real, em alta resolução e durante todo o processo de tratamento experimental. Nossos métodos de cultivo permitem Arabidopsis thaliana mudas a ser germinadas da semente dentro da plataforma e cultivadas por até uma semana em um ambiente estéril e hidratada que não requer o uso de equipamento de bomba de seringa. Uma vez que o lapso de tempo de imagem experimento concluiu, a plataforma apresentada aqui pode ser aberta sem perturbar a posição dos recursos raiz mais finas. Isto permite o uso de outros métodos de imagem de alta resolução. Aqui nós fornecemos resultados representativos para a quantificação e a visualização da morfologia da raiz do cabelo nesta plataforma por microscopia óptica, varredura (SEM) e de força atômica (AFM) de técnicas de microscopia.

Protocolo

1. dois-camada fabricação de plataforma

1. Fabricação dos mestres multicamadas
   1. Rotação casaco fotorresiste negativa baseada em epóxi (~63.45% sólidos, 1.250 cSt) de acordo com as especificações do fabricante (2.000 rpm para 45 s) em uma bolacha de silicone de diâmetro de 4 polegadas para obter a altura desejada de 20 µm para a primeira camada de desenho.
   2. Macio-cozer as bolachas resist revestido por 4 min a 95 ° C. Permitir a bolacha esfriar por 5 min. expor o wafer de UV, luz para 15 s (~ 150 mJ/cm² a 365 nm) através de uma Fotomáscara em um UV contatar alinhador para definir a geometria da camada inferior.
   3. Pós-exposição asse a hóstia durante 5 min à 95 ° C. Sem desenvolver, retornar a bolacha para o aplicador girar e girar em uma segunda camada de fotorresiste negativa baseada em epóxi (~76.75% sólidos, 80.000 cSt) a 3.000 rpm para atingir uma segunda altura de camada de 150-200 µm.
   4. Permita o wafer de descansar por 5 min antes de transferir para uma placa de 95 ° C por 45 min. Após o cozimento na placa de aquecimento, retirar a bolacha e deixar a resistir esfriar e endurecer em temperatura ambiente por mais 5 minutos em uma superfície plana e nivelada. Alinhar e expor a hóstia para a segunda camada Fotomáscara para 30 s em um alinhador de contato UV (dose de aproximadamente 300 mJ/cm²).
   5. Executar um Asse pós-exposição ao colocar a bolacha sobre uma placa quente por 15 min a 95 ° C e em seguida, permitir que a bolacha esfriar sobre uma superfície plana e nivelada por 5 min antes de desenvolver.
   6. Desenvolver as duas camadas de resistir simultaneamente colocando a bolacha em um prato de plástico e submergindo a bolacha no desenvolvedor apropriado (consulte a Tabela de materiais). Agitar suavemente o prato ocasionalmente para lavar desenvolvedor fresco sobre a bolacha.
   7. Depois de 17 min, enxague a bolacha com isopropanol (IPA). Se aparece um filme branco, continue a iterar entre enxaguar a bolacha com o desenvolvedor e IPA até o filme desaparece. Seque o wafer de silício estampados com nitrogênio.
2. Polydimethylsiloxane Soft-litografia
   1. Expor o wafer de silício de um plasma de ar por 30 s em um plasma líquido de limpeza definido em alta (veja a tabela de materiais) para limpar. Silanize a bolacha com silano tricloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluoro-n-octil) em uma capa de química em uma placa de aquecimento abaixo do ponto de inflamação do silano (85 ° C) por 2 h.
   2. Despeje uma proporção de 10:1 do polydimethylsiloxane (PDMS) para agente de cura para o wafer de silício mestre. Desgaseificar o PDMS misturadas em uma câmara de vácuo e depois curar o polímero em um forno de 70 ° C por 1 h ou até o PDMS é totalmente curado.
   3. Usando um bisturi, corte os dispositivos PDMS e descascá-los a partir da pastilha de silício mestre. Use um soco de biópsia de 1,5 mm para criar entradas de semente e tratamento, a entrada da semente em um ângulo de 45° para incentivar o crescimento de raiz para o canal principal de perfuração.
   4. Use fita adesiva transparente para remover restos do dispositivo PDMS e coloque o dispositivo do projeto para baixo sobre uma lamela de vidro. Autoclave os dispositivos montados.

2. dispositivos de plantação

1. Preparação de semente de Arabidopsis thaliana
   1. Superfície de esterilizar a. thaliana sementes em um tubo de microcentrífuga com uma solução de 30% disponível comercialmente lixívia diluída em detergente de Triton X água e 0,1% desionisado para sementes de lavagem de 7 min. 4 vezes com água estéril.
   2. Estratificar sementes por tubo de microcentrífuga de refrigeração durante a noite ou até uma semana a 4 ° C.
2. Preparação do dispositivo
   1. Coloque dispositivos esterilizados em um vácuo de desgaseificação câmara para remover o ar do gás permeável PDMS e fluídico canais para melhorar a facilidade de enchimento.
   2. Remover os dispositivos da câmara de vácuo e mergulhe imediatamente os dispositivos em uma placa de Petri preenchida com media baseada em vegetais líquidos força ¼ em pH 5,7.
   3. Utilizando uma pipeta, puxe o líquido através das entradas de para preencher o dispositivo. Certifique-se que não há bolhas de ar permanecem dentro de canais por inspeção visual.
   4. Transferência de dispositivos individuais para novos pratos de Petri seco. Despeje ou pipeta ágar quente em torno do dispositivo até que o nível de ágar-ágar é quase alinhado com a parte superior do dispositivo PDMS. Permitir que agar para solidificar.
      Nota: Os dispositivos agora estão prontos para o plantio de sementes ou podem ser armazenados a 4 ° C, até que seja necessário.
3. Plantar sementes dentro de dispositivos
   1. Em um ambiente estéril, transferi uma semente esterilizada para a entrada de cada dispositivo usando uma pipeta pequena.
   2. Tampa da placa de Petri com cera filme (veja a Tabela de materiais) e coloque em uma câmara de crescimento ciclismo claro/escuro ou parapeito à temperatura ambiente. Oriente o prato de Petri de modo que os dispositivos são verticais e gravidade incentivará as raízes a crescer através do canal.

3. tratamento

1. Tratamentos experimentais
   1. Ao tempo desejado no desenvolvimento do seedling, adicione o tratamento experimental para o seedling, adicionando uma quantidade prescrita do tratamento para cada uma das portas 8 lado através de uma pipeta.
   2. Reseal o prato de Petri e retornar para a câmara de crescimento ou peitoril da janela.
   3. Prossiga com as amostras de imagem no momento desejado para capturar pontos de tempo individuais ou começar a imagem latente de lapso de tempo.

4. optical Imaging

1. Baixa resolução (4-20 X)
   1. Coloque o prato de Petri inteiro que contém o dispositivo e mudas sob um microscópio de campo claro invertido para campo claro de baixa resolução (4-20 X) ou imagens de interferência diferencial (DIC) de contraste. Otimize as condições de iluminação para elucidar características morfológicas de interesse, ajustando o brilho da lâmpada, tempos de exposição, abertura e a polaridade da luz. Dirigir o estágio para a área desejada da raiz e foco na raiz ou root hair(s) de interesse.
   2. Adquira um ponto de tempo único ou uma série temporal de imagens. Para visualizar o crescimento de pelos radiculares, imagem crescentes cabelos de raiz uma vez por min. Para visualizar o crescimento da raiz principal, adquira uma imagem cada 30 min. retorno de Petri e as mudas para câmara de crescimento ou janela na posição vertical após a conclusão da imagem latente.
2. Imagens de maior resolução (20-63 X)
   1. Uma vez que o seedling cresceu para um momento desejado, use pinça para remover lamela e dispositivo de agar. Limpa o fundo da lamela usando um tecido de laboratório de etanol humedecido.
   2. Aplica os meios de comunicação de imersão recomendado para o objectivo, tal como sugerido pelo fabricante de lente do microscópio. Colocar a lamela para baixo no palco microscópio e levantar o estágio para entrar em contato com a mídia de imersão no objectivo. Otimize as condições de iluminação, ajustando o brilho da lâmpada, tempos de exposição, abertura e a polaridade da luz. Dirigir o estágio para a área desejada e foco na root hair(s) de interesse.
      Nota: O DIC é necessário para visualizar a ciclose e marcadores de fluorescência são necessários para visualizar o movimento das organelas.
   3. Para quantificar o crescimento da raiz do cabelo ao longo do tempo, adquira uma imagem por min. Para visualizar o movimento das organelas, minimize o tempo de exposição de fluorescência, mantendo ainda um sinal de fluorescência identificáveis das organelas. Adquira imagens das organelas mais rápido que permite que o tempo de exposição. Para mais imagens de lapso de tempo, use uma incubadora de palco viver-pilha de imagem para manter a umidade e a temperatura ambiente.
      Nota: Um objectivo de óleo X 63 é recomendado para imagiologia organelas da raiz do cabelo.

5. não-ópticos Imaging

1. Preparação do dispositivo
   1. Uma vez que mudas tem crescido para o tempo desejado,

Remova o dispositivo e a lamela de Petri.

Dispositivo de virar de cabeça para baixo e gentilmente descascar a lamela para que a raiz permanece dentro do canal PDMS.

Continue a usar o dispositivo PDMS como substrato para a raiz em maior força atômica de resolução ou microscopia eletrônica.

Microscópio eletrônico de varredura

1. Depositar uma fina (~ 20 nm) camada de cromo para a raiz e em torno de PDMS utilizando uma câmara de evaporação feixe de elétron Dual arma.
2. Transferi a raiz e o dispositivo PDMS para uma câmara de microscópio eletrônico de varredura.
   Nota: Imagem condições, ou seja, tensão, distância atual e trabalho precisará ser otimizados para atingir a resolução desejada para um determinado aplicativo.

Microscopia de força atômica (AFM)

1. Monte o lado de raiz do dispositivo PDMS em um suporte de amostra AFM. Para aumentar o contraste na câmera e mais facilmente distinguir a raiz o PDMS, coloque o dispositivo PDMS em um substrato plano reflexivo (tais como a mica revestida em ouro) antes de montar o dispositivo no suporte de amostra AFM.
2. Fixar um acessório bem líquido sobre o dispositivo do PDMS e preenchê-lo com água para manter as raízes hidratadas durante a imagem latente.
3. Carrega o suporte de amostra para o AFM. Ajustar o controle de z para a espessura do dispositivo PDMS e dirigir o cantilever para a região de interesse na raiz usando uma câmera para orientação.
4. Ajustar o laser com a ponta do cantilever. Para obter melhores resultados com imagens de modo de contato, use cantilevers com constantes de mola de 0,03 ou 0,01 N/m para exercer força mínima na raiz durante a verificação.
5. Abaixe lentamente o mecanismo de varredura até o cantilever só faz contato com a amostra. Ajustar o tamanho de varredura para a região desejada e escolha uma velocidade de varredura de 1 linha/s com 256 pontos de tensão por linha. Adquira o scan.

Resultados

Os dispositivos de microfluidic PDMS da dois-camada aqui descritos têm um canal de alta de 200 µm para a raiz principal de Arabidopsis e uma câmara alta de 20 µm para confinar lateralmente crescentes pelos radiculares (figura 1A). Este projeto pode ser utilizado para espécies de plantas com diâmetros de raiz semelhante como Arabidopsis thaliana e pode ser facilmente modificado para acomodar a espécie de diferentes tamanhos. O...

Discussão

O método descrito neste artigo para a criação de uma plataforma de planta-em-um-microplaqueta é o único que da dois-camada design limites os cabelos de raiz para um único plano de imagem e a plataforma pode ser desconstruídos e usados como um substrato para a imagem latente não-ópticos de alta resolução . Usando a imagem latente não-ópticos de alta resolução pode fornecer informações valiosas sobre o tecido de planta que não pode ser obtido da optical imaging em paz. Por exemplo, imagens de AFM podem fo...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Silicon Wafer	WRS Materials	100mm diameter, 500-550um thickness, Prime, 10-20 resistivity, N/Phos<100>
Quintel Contact Aligner	Neutronix Quintel Corp	NXQ 7500 Mask Aligner
Fluorescent Microscope	Nikon	Eclipse Ti-U
laboratory tissue	Kimberly Clark	Kimwipe KIMTECH SCIENCE Brand, 34155
Negative Photoresist Epoxy	Microchem	SU-8 2000s series
Photoresist developer	Microchem	Su-8 developer
trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluoro-octyl)silane	Sigma Aldrich		use in chemical hood
Air Plasma Cleaner	Harrick Plasma
PDMS	Dow Corning	Sylgard 184 Silicone elastomer base
PDMS curing agent	Dow Corning	Sylgard 184 Silicone elastomer curing agent
Dessicator	Bel-Art	F42010-000
Scalpel	X-acto knife
Biopsy Punch	Ted Pella	15110-15
Adhesive tape	Staples	Invisible Tape
Microfuge tube	Eppendorf
Triton X	J.T.Baker XI98-07
Bleach	Chlorox	concentrated
Plant-Based Media	Phyto Technology Laboratories	M524
Agar	Teknova	A7777
Wax film	Parafilm
microscope	Olympus	IX51
Atomic Force Microscope	Keysight Technologies	5500 PicoPlus AFM
Petri dish	VWR
Scanning Electron Microscope	JEOL	7400
Dual Gun Electron Beam Evaporator	Thermionics	Custom Dual Electron Gun Evaporation System