小鼠体外循环模型: 一种新方法

摘要

本文介绍了如何在小鼠体内进行体外循环手术。这种新型模型将有助于研究器官损伤的分子机制。

摘要

随着长期体外循环在心脏介入过程中变得越来越重要, 临床需求增加, 以进行程序优化, 并最大限度地减少因长期外循环而造成的器官损害。本文的目的是演示一个完整的功能和临床相关模型的体外循环在小鼠。我们报告的设备设计, 灌注电路优化, 和显微外科技术。该模型是一个急性模型, 这是不相容的生存, 由于需要多血图。由于可用于小鼠的工具范围 (例如、标记、敲除、等), 该模型将有助于研究器官损伤的分子机制和体外循环对其他并存.

引言

自体外循环 (cpb) 进入临床后, 它在心脏手术中起了重要作用¹。在现代心脏手术中, 延长的 CPB 时间对进行广泛的主动脉重建和联合手术是必不可少的。尽管技术进步巨大, 外循环的使用与术后全身和局部脏器损伤有关^2,3。

开发了大型动物模型来研究 CPB 在生理过程中的作用^4,5。虽然这些模型提供了一些对 CPB 相关并发症的洞察力, 但它们是非常昂贵的, 分子工具 (例如, 抗体) 是非常有限的。一个更具成本效益的替代品已经在小动物身上得到了发展。自其发展以来, 进行了多项研究, 以优化大鼠和家兔的 CPB 模型^5,6,7,8,9。这些模型为病理生理学疾病过程的测量提供了良好的基础;然而, 由于缺乏相关的抗体和试剂, 它们仍然不足以研究细胞和体液免疫学。这削弱了他们在这个研究领域的作用。

我们最近开发了一个鼠 CPB 模型。由于各种鼠标特异试剂和转基因小鼠, 小鼠模型一般是生理、分子和免疫学研究的选择模型^10,11。因此, 我们的模型将促进研究 CPB 与各种并存, 因为有许多小鼠菌株可与临床相关的疾病^12,13。因此, 本文详细介绍了如何在小鼠体内进行 CPB。在深部呼吸和循环停止后, 对氧和血流动力学参数进行严密监测。

研究方案

所有动物实验都是遵照德国动物保护法 (TierSchG) 进行的, 并得到当地动物福利委员会 (下萨克森国家消费者保护和食品安全办公室的批准, 协议TSA 14/1556)。适合该模型的小鼠的最小重量为25克.

1. 术前准备

注意: 所有的程序都在清洁、消毒的条件下进行, 并带有蒸压仪器.

1. 将 50-60 8 厘米长的丙烯中空纤维平行放置在试管中, 并与两侧的 T 型适配器连接。用胶水填充空心纤维和 T 型适配器的外部分支之间的空间.
   1. 允许至少24小时以使胶水变硬。使用标准切片切断从 T 型适配器延伸出来的中空纤维, 并将硅胶管拉到连接点.
2. 将27克金属针 (从 26G branule) 和 #160 插入一个2法郎的聚氨酯套管。使用显微镜下的手术刀片和微剪刀 (8-12X 放大), 使三至四 fenestrations, 每在远端三分之一的套管, 以确保最佳的静脉回流流量.
   1. 在完成时移除导线。用棉签对结构进行钝夹层和缩回。使用纱布拭子 (5 x 5 cm ² ) 来吸收多余的液体, 以防止组织脱水.
3. 准备启动卷。为完成, 增加30单位肝素每毫升启动液和2.5% 伏/v 的8.4% 解决方案的 NaHCO ₃ 的缓冲。将此解决方案存储在4和 #176; C 直到使用.
4. 填入 CPB 电路 (如: , 泵, 空气捕手, 油管和两个套管) 与850和 #181; 通过静脉导管启动溶液。一旦填充, 保持体外循环循环, 直到动物准备好插管.

2。动物麻醉

1. 要进行麻醉, 请将该动物置于2.5% 伏/伏异氟烷/氧混合物的诱导室中。通过评估踏板撤退反射, 尾部捏反射, 和眼睛眨眼反射来确认正确的麻醉。应用兽医眼膏避免眼部干燥.
2. 将动物置于温度调节功能的暖垫上。使用插入直肠的探头测量体温, 并连接到数据采集系统.
3. 在完全麻醉完成后, 用20G 塑料 braunule 将动物 orotracheally 插管, 将其插入口腔, 并在视觉控制下将其推入气管。使用与鼠标呼吸器连接的异氟醚蒸发器启动机械通气。根据动物的重量, 调整通风, 使潮气量 250-350 和 #181; 我实现了.
4. 确保完全镇痛, 注射5毫克/千克动物体重卡洛芬皮下注射。建议将异氟醚浓度保持在 1.3-2.5% 之间的氧。异氟醚浓度可根据手术阶段手动调节.

3。外科手术程序

1. 在完全麻醉和插管完成后, 用锋利的细剪刀、以钝的方式分离肌肉、并暴露右颈静脉和左颈动脉, 在颈部进行中线皮肤切口。在制备过程中, 使用与双极性钳连接的兽医凝固将小血管凝固, 以确保最小的失血.
2. 经颈静脉血管制备后, cranially 结扎左颈总动脉远端段使用8-0 丝缝合线进行分岔.
3. 使用硅胶连接器 (0.5 mm ID, 1 mm 外径) 将27克套管的远端连接到动脉流入管上, 在动脉的近段处放置8-0 丝缝线滑动节, 并将套管尖端插入颈动脉.
4. 在正确放置套管尖端后, 将套管尖端向前推进 3-4 毫米, 使其下部向主动脉弓。用8-0 丝结固定好套管的尖端.
5. 使用显微外科钳和剪刀, 进行钝和尖锐的解剖, 暴露右颈静脉通过钝性准备组织侧向胸锁乳突肌, 接近锁骨, 并放置一个8-0 丝结在远端和一个8-0在近端循环.
6. 结扎颈静脉远端后, 将静脉导管尖端放置在右颈静脉, 朝向右心房进展, 并使用丝结固定。为了获得最佳的静脉回流, 可能需要将静脉尖端进入右心室.
7. 一旦达到正确的插管位置, 通过直接静脉注射到颈静脉内, 将每克动物体重增加2.5 的肝素, 进行全身肝.
8. 用于 real-time 侵入性压力监测, cannulate 左股动脉。在25X 放大倍数下, 暴露腹股沟区, 轻轻地将股股静脉和股神经分开.
   1. 结扎股动脉远端的部分。用微钳在前壁上临时咬合, 用滑结做一个小切口.
   2. 之后, 在股动脉中插入一根1法郎的聚氨酯套管, 用丝10-0 缝线固定。本套管用于抽取血液样本进行血气分析.
9. 在成功放置动脉和静脉套管后, 通过打开泵启动体外循环。从插管到 CPB 开始的时间大约是45分钟, 开始使用0.5 毫升/分钟的流速, 这取决于系统压力测量, 并增加泵的速度在2分钟内的全流量 (4-6 毫升/分钟) 的血流量.
10. 在完全监视下, 使用锐剪刀从柄开始执行上部胸骨, 并在尾部方向上5毫米。立即凝固胸骨边缘以避免流血。通过在颅方向上拉右颈动脉来暴露主动脉弓.
11. 为了获得最佳控制, 圆周从胸腺和周围组织中释放主动脉弓, 以便于夹紧。在升主动脉周围放置一个8-0 丝环。要将十字钳放置在心脏停搏液中, 在颅骨方向上拉上丝环, 以更好地暴露升主动脉.

4。体外循环与血气分析

用于血气分析的
1. , 使用玻璃毛细管收集 60-90 和 #181; 通过股动脉导管进行动脉血流.
   1. 在硅胶导管上使用一个小钳, 并将导管与导尿管分离。在钳上缓慢释放压力, 使毛细管控制充填.
   2. 将硅胶管重新连接到导管。将毛细管插入血气分析仪, 用于测量在以下时间点:
      10 分钟后启动 CPB 通气 (BGA1)25分钟的 cpb 和15分钟的呼吸骤停 (BGA2)
      后40分钟 cpb 和30分钟的呼吸骤停 (BGA3)
      后55分钟, 45 分钟的呼吸, 20 分钟心跳骤停 (BGA4)
2. 在稳定的 CPB 流下, initia通过停止通气来呼吸骤停.
3. 通风结束后, 将暖垫设置为28和 #186; c 和 #160; 开始局部冷却的动物到28和 #186; c 体温在第一20分钟内使用纱布浸泡在生理盐水中的呼吸骤停.
4. 一旦体温为28和 #186; C 是达到, 并在总共30分钟的呼吸骤停后, 管理0.3 毫升的7.45% 氯化钾溶液进入 CPB 回路, 启动心脏停搏液.
5. 对于主动脉的交叉夹紧, 将先前放置的丝环 (步骤 3.10) 置于颅骨方向, 以便更好地曝光, 并在主动脉的上升部分放置微 serrefine 钳.
6. 共执行60分钟呼吸骤停和30分钟心跳骤停。从提升主动脉中取出微 serrefine 钳, 开始心脏再灌注。同时, re-ventilate 和温暖的动物到37和 #176; C.
7. 在再灌注完成后, 动物已达到常温, 关闭泵, 并继续监测生理测量 ( 如 体温、心电图和侵入性血压) 20 分钟, 终止 CPB。
8. 在实验结束时, 血完全麻醉下的动物 (5% 异氟醚), 并收集血液和器官作进一步分析 ¹⁴ .

结果

本协议描述了在鼠 CPB 过程中的灌注回路、手术过程和生理参数的监测。当由一个充分熟练的 microsurgeon, 结果是一致和性获得。

为了保持足够的组织灌注, 平均动脉压力始终保持在40和60柱通过调整 CPB 血流量和增加额外的体积。根据动物的重量, 它的体积状况和体温, 外血流维持在 2.3-6.5 毫升/分钟. 在实验过程中, 通过增加0.1 毫...

讨论

我们已经开发了一个完全功能性的临床相关模型的 CPB 在鼠标。由于有三十多株患有心血管疾病的小鼠, 我们的模型可以成为与 CPB 相关的新的前瞻性协议的发展起点。此外, 由于大量的鼠标特异试剂和 knockout-out 小鼠, 该模型不仅可以取代目前的大鼠 cpb 模型, 但将有助于解剖的分子机制参与与 cpb 相关的器官损害。到目前为止, CPB 还没有应用于小鼠, 因为在插管技术的显微外科挑战, 以及技术挑战, ?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sterofundin	B.Braun Petzold GmbH	PZN:8609189	priming volume, 1:1 with Tetraspan
Tetraspan 6% HES Solution	B. Braun Melsungen AG	PZN: 05565416	priming volume, 1:1 with Sterofundin
Heparin Natrium 25.000	Ratiopharm GmbH	PZN: 3029843	2.5 IU per ml of priming solution
NaHCO3 8,4% Solution	B. Braun Melsungen AG	PZN: 1579775	3% in priming solution
KCL 7.45 % Solution	B. Braun Melsungen AG	PZN: 2418577	0.1 mL for cardioplegia
Carprofen	Zoetis Inc., USA	PZN:00289615 08859153	5 mg/kg/BW
1 Fr PU Catheter	Instechlabs INC., USA	C10PU-MCA1301	carotid artery
2 Fr PU Catheter	Instechlabs INC., USA	C20PU-MJV1302	jugular vein
Vasofix Safety catheter 20G	B.Braun Medical	4268113S-01	orotracheal intubation
8-0 Silk suture braided	Ashaway Line & Twine Mfg. Co., USA	75290	ligature
Isoflurane	Piramal Critical Care Deutschland GmbH	PZN:9714675	narcosis
CLINITUBES blood capillaries	Radiomed GmbH	51750132	blood sampling 60 - 95 microliter
Spring Scissors - 6mm Blades	Fine Science Tools GmbH	15020-15	instruments
Spring Scissors - 2mm Blades	Fine Science Tools GmbH	15000-03	instruments
Halsted-Mosquito Hemostat	Fine Science Tools GmbH	13009-12	instruments
Dumont #55 Forceps	Fine Science Tools GmbH	11295-51	instruments
Castroviejo Micro Needle Holder - 9cm	Fine Science Tools GmbH	12060-02	instruments
Micro Serrefines	Fine Science Tools GmbH	18555-01	instruments
Bulldog Serrefine	Fine Science Tools GmbH	18050-28	instruments
MiniVent Ventilator for Mice (Model 845)	Harvard Apparatus	73-0044	mechanical ventilation
Isoflurane Vaporizer Drager 19.1	Drägerwerk AG & Co. KGaA		anesthesia 1.3 - 2.5%
PowerLab data acquisition device 4/35	ADInstruments Ltd, New Zealand	PL3504	invasive pressure, ECG, temperature
ABL 800 Flex	Radiometer GmbH		blood gas analysis
NMRI mice	Charles River Laboratories	Crl:NMRI(Han)	male, 30 - 35 g, 12 weeks old, housed at least 1 week before the experiment