Circulation extracorporelle dans un modèle murin : une nouvelle approche

Résumé

Cet article explique comment effectuer la circulation extracorporelle chez la souris. Ce nouveau modèle permettra de faciliter l’étude des mécanismes moléculaires impliqués dans les lésions organiques.

Résumé

Comme extracorporelle prolongée devient plus essentiel pendant les interventions cardiaques, une demande croissante de clinique se pose pour l’optimisation de la procédure et pour minimiser les lésions organiques résultant de la circulation extracorporelle prolongée. L’objectif de cette étude était de démontrer un modèle entièrement fonctionnel et cliniquement pertinent de la circulation extracorporelle chez une souris. Nous rapportons sur la conception de l’appareil, optimisation de circuit de perfusion et techniques microchirurgicales. Ce modèle est un modèle aiguë, ce qui n’est pas compatible avec la survie en raison de la nécessité de multiples dessins de sang. En raison de l’éventail d’outils disponibles pour la souris (par exemple, marqueurs, Ejecteurs, etc.), ce modèle facilitera l’enquête sur les mécanismes moléculaires de lésions organiques et l’effet de la circulation extracorporelle par rapport aux autres comorbidités.

Introduction

Depuis l’introduction d’extra-corporelle (CEC) dans la clinique, il a joué un rôle essentiel dans la chirurgie cardiaque¹. En chirurgie cardiaque moderne, prolongée de la DGPC est indispensable pour effectuer des reconstructions aortiques et procédures combinées. Bien que les progrès technologiques ont été énormes, l’utilisation de la circulation extracorporelle est associée avec intra - et postopératoires systémique et endommager les organes locaux^2,3.

Grands modèles animaux ont été développés pour étudier le rôle de la DGPC sur les processus physiologiques^4,5. Bien que ces modèles ont fourni à l’aperçu de certains de la DGPC associés à des complications, ils sont extrêmement coûteux et outils moléculaires (p. ex. anticorps) sont très limitées. Une alternative plus rentable a été développée chez de petits animaux. Depuis leur mise au point, plusieurs études ont été menées afin d’optimiser un modèle de la DGPC aux rats et lapins^5,6,7,8,9. Ces modèles fournissent une bonne base pour des mesures des processus physiopathologique de la maladie ; Cependant, ils sont encore insuffisants pour étudier l’immunologie cellulaire et humorale en raison de l’absence d’anticorps compétents et réactifs. Cela porte atteinte à leur rôle dans ce domaine de recherche.

Nous avons récemment développé un modèle murin de la DGPC. En raison d’une grande variété de réactifs spécifiques de souris et souris génétiquement modifiés, les modèles murins sont en général le modèle de choix pour les recherches physiologiques, moléculaires et immunologiques^10,11. Par conséquent, notre modèle facilitera l’étude du CPB en ce qui concerne les diverses maladies concomitantes comme il existe de nombreuses souches de souris disponibles avec des maladies ayant une pertinence clinique^12,13. En conséquence, le présent document explique, en détail, comment effectuer CPB chez la souris. Oxygène et paramètres hémodynamiques sont surveillés étroitement après l’arrestation de profondes respiratoire et circulatoire.

Protocole

toutes les expérimentations animales ont été réalisées dans le respect de la loi allemande de Protection animale (TierSchG) et ont été approuvées par le Comité de bien-être des animaux locaux (Basse Saxe Office d’État pour la Protection des consommateurs et la sécurité alimentaire, protocole TSA 14/1556). Le poids minimal de souris approprié pour ce modèle est de 25 g.

1. préparations préopératoire

Remarque : toutes les procédures sont effectuées dans des conditions propres, non stériles, avec des instruments stérilisés à l’autoclave.

1. Lieu 50-60 8 cm long propylène fibres en parallèle dans un tube creuses et se connecter avec un adaptateur en T des deux côtés. Remplir l’espace entre les fibres creuses et la branche externe de l’adaptateur en T avec la colle.
   1. Autoriser au moins 24 h pour la colle durcir. Couper les fibres creuses s’étendant de l’adaptateur en T à l’aide d’un microtome standard et enfiler le tube de silicone pour les sites de connexion.
2. Insérer une aiguille métallique de 27 G (à partir d’un branule de 26G) dans une canule de polyuréthane Fr 2. Utilisez une lame chirurgicale et le micro-ciseaux au microscope (grossissement de X 8-12) pour faire trois ou quatre fenestrations d’environ 0,15 cm chacun au sein du tiers distal de la canule pour garantir les optimale veineux retour.
   1. Enlever le fil une fois terminé. Utiliser des cotons-tiges pour dissection non tranchante et rétraction des structures. Utiliser des tampons de gaze (5 x 5 cm ²) pour absorber les excès de liquide pour prévenir la déshydratation des tissus.
3. Préparer le volume d’amorçage. Achèvement, ajouter 30 UI d’héparine par millilitre d’amorçage solution et 2,5 % v/v d’une solution de 8,4 % de NaHCO ₃ pour la mise en mémoire tampon. Conserver cette solution à 4 ° C jusqu'à utilisation.
4. Remplir le circuit de la DGPC (c'est-à-dire, pompe, trappeur de l’air, les tubes et les deux canules) avec 850 µL de solution d’amorçage via la canule veineuse. Une fois remplie, garder les OPC en circulation jusqu'à ce que l’animal est prêt pour la canulation.

2. L’anesthésie animaux

1. pour administrer l’anesthésie, placer l’animal dans une chambre à induction moins de 2,5 % mélange isoflurane/oxygène v/v. Confirmer l’anesthésie correcte en évaluant le réflexe de retrait pédale, réflexe de pincée de queue et réflexe de clin de œil. Pommade oculaire vétérinaire pour éviter la sécheresse oculaire.
2. Placer l’animal sur un coussin chauffant avec fonction de régulation de température. Mesurer la température corporelle avec une sonde insérée par voie rectale et branché pour le système d’acquisition de données.
3. Après que l’anesthésie complète est atteinte, intuber l’orotracheally animale à l’aide d’un braunule en plastique de 20G, en insérant par voie orale et en poussant dans la trachée sous contrôle visuel. Démarrer la ventilation mécanique à l’aide d’un vaporisateur isoflurane relié à un ventilateur de souris. Selon le poids de l’animal, ajuster la ventilation de sorte qu’un volume de marée de 250-350 µL est réalisé.
4. Pour assurer une analgésie complète, injecter carprofène animaux poids corporel 5 mg/kg par voie sous-cutanée. Il est recommandé de conserver l’isoflurane concentration entre 1,3 à 2,5 % d’oxygène. Isoflurane concentration peut être réglée manuellement selon le stade de la procédure.

3. Procédures chirurgicales

1. après l’anesthésie complète et intubation est atteinte, effectuer une incision médiane de peau au cou avec des ciseaux fins pointus, séparer les muscles de façon brutale et exposer la veine jugulaire de droite et artère carotide gauche. Au cours de la préparation, coaguler les petits vaisseaux à l’aide de coagulateur vétérinaire relié à la pince bipolaire pour assurer une perte de sang minime.
2. Après la préparation des vaisseaux jugulaires, parotidien ligaturer le segment distal de l’artère carotide commune gauche à la bifurcation à l’aide de sutures en soie de 8-0.
3. Connectez l’extrémité distale d’une canule de 27 G à la tubulure d’apport artériel à l’aide d’un connecteur de silicone (ID de 0,5 mm, 1 mm OD), bordereau de suture soie place 8-0 noeuds du segment proximal de l’artère, insérer l’extrémité de la canule dans l’artère carotide.
4. Après le placement correct de l’extrémité de la canule, améliorer l’extrémité de la canule pour qu’il fixe 3-4 mm dans la partie proximale de la crosse aortique. Fixer l’extrémité de la canule en fixant à l’aide de nœuds en soie de 8-0.
5. Using microchirurgicales pinces et ciseaux, effectuer une dissection émoussée et pointue, exposer la veine jugulaire droite par émoussé préparation du tissu latéralement au muscle sternocléidomastoïdien, à proximité de la clavicule et placer un noeud en soie de 8-0 à l’extrémité distale et un 8-0 boucle à l’extrémité proximale.
6. Après une ligature de l’extrémité distale de la veine jugulaire, placer l’extrémité de la canule veineuse dans la veine jugulaire de droite et les progrès vers l’oreillette droite et les fixer avec le noeud de soie. Pour le retour veineux optimal, il peut être nécessaire faire avancer l’extrémité veineuse dans le ventricule droit.
7. Une fois que la position de la canule correcte est obtenue, mener héparinisation en ajoutant 2,5 UI d’héparine par gramme de l’animal de poids corporel par injection intraveineuse directe dans la veine jugulaire.
8. Pour la surveillance de la pression invasive en temps réel, canule dans l’artère fémorale gauche. Exposer la région de l’aine et séparer doucement l’artère fémorale commune la veine fémorale et le nerf fémoral sous un grossissement de 25 X.
   1. Ligate la partie distale de l’artère fémorale. Temporairement obstruer la partie proximale avec un feuillet-noeud et faire une petite incision sur la paroi antérieure avec une micro-pincette.
   2. Par la suite, insérer une canule de polyuréthane Fr 1 dans l’artère fémorale et le fixer avec une soie suture 10-0. Cette canule est utilisé pour extraire des échantillons de sang pour l’analyse des gaz sanguins.
9. Après le placement réussi des canules artérielles et veineuses, initier extracorporelle en mettre la pompe en marche. Le temps d’intubation à partir du CPB est environ 45 min. commencer à utiliser un débit de 0,5 mL/min, en fonction des mesures de la pression systémique et augmentation du débit sanguin dans les 2 min à plein débit (4 à 6 mL/min) en augmentant la vitesse de la pompe.
10. Sous une surveillance complète, effectuez une sternotomie supérieure à l’aide de ciseaux pointus à partir du manubrium et allant de 5 mm en direction caudale. Coaguler les bords sternales immédiatement pour éviter un saignement. Exposer la crosse aortique en tirant sur l’artère carotide droite dans le sens crânien.
11. Pour un contrôle optimal, sur sa circonférence gratuit la crosse aortique du thymus et des tissus environnants pour faciliter le serrage. Placer une boucle de soie de 8-0 autour de l’aorte ascendante. Pour placer la bride croisée pour la cardioplégie, tirez la boucle en soie dans le sens crânien pour mieux exposer l’aorte ascendante.

4. Circulation extracorporelle et analyse des gaz sanguins

1. pour l’analyse des gaz sanguins (BGA), utiliser des tubes capillaires de verre pour recueillir le sang artériel de 60-90 µL via le cathéter dans l’artère fémorale.
   1. Utiliser une petite pince sur le tube en silicone et détacher le tube du cathéter. Relâchez la pression lentement sur la pince pour permettre un remplissage contrôlé du tube capillaire.
   2. Rattacher le tube de silicone au cathéter. Insérer les tubes capillaires dans l’analyseur de gaz de sang pour les mesures aux points de temps suivantes :
      10 min après le début de la DGPC avec ventilation (BGA1)
      après 25 min de la DGPC et 15 min d’arrêt respiratoire (BGA2)
      après 40 min de la DGPC et 30 min d’arrêt respiratoire (BGA3)
      après 55 min du CPB, 45 min de respiratoire et 20 min d’un arrêt cardiaque (BGA4)
2. sous flux stable de la DGPC, initia un arrêt respiratoire par l’arrêt ventilation te.
3. Après la fin de la ventilation, le coussin chauffant la valeur 28 ºC et commence à refroidir par voie topique l’animal à température du corps 28 ºC au cours des 20 premières minutes d’arrêt respiratoire à l’aide de gaze imbibée de sérum physiologique froid.
4. Lorsqu’on atteint une température de 28 ºC et après un total de 30 min d’arrêt respiratoire, administrer 0,3 mL de solution de KCl 7,45 % dans le circuit de la DGPC à initier la cardioplégie.
5. Pour traverser le clampage de l’aorte, tirez la boucle précédemment mises en soie (étape 3.10) dans le sens crânien pour la meilleure exposition et placer une pince micro-serrefine sur la partie ascendante de l’aorte.
6. Effectuer un total de 60 min arrêt respiratoire et à 30 min d’un arrêt cardiaque. Retirez la pince de micro-serrefine de l’aorte ascendante d’ouvrir la reperfusion du coeur. En même temps, re-ventiler et chauffer l’animal à 37 ° C.
7. Après reperfusion soit terminée et que l’animal a atteint normothermie, mettre fin à la DGPC en désactivant la pompe et continuer à surveiller les mesures physiologiques (p. ex. la température corporelle, ECG et la pression sanguine) pendant 20 min.
8. à la fin de l’expérience, exsanguinate l’animal sous anesthésie complète (5 % isoflurane) et recueillir le sang et des organes pour plus loin l’analyse ¹⁴.

Résultats

Ce protocole décrit le circuit de perfusion, les interventions chirurgicales et la surveillance des paramètres physiologiques au cours de la DGPC de souris. Lorsque exécutée par une microsurgeon adéquatement qualifié, on obtient les résultats régulièrement et de façon reproductible.

Pour maintenir la perfusion tissulaire adéquate, la pression artérielle moyenne est toujours entre 40 et 60 mmHg en ajustant le débit s...

Discussion

Nous avons développé un modèle ayant une pertinence clinique pleinement opérationnel de la DGPC dans une souris. Avec plus d’une trentaine de souches de souris ayant des maladies cardiovasculaires, notre modèle pourrait être un point de départ pour le développement de nouveaux protocoles éventuels associés au doryphore. En outre, en raison de la pléthore des réactifs spécifiques de souris et souris knockout-out, ce modèle ne peut pas seulement remplacer l’actuel modèle de rat de CPB mais facilitera la ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sterofundin	B.Braun Petzold GmbH	PZN:8609189	priming volume, 1:1 with Tetraspan
Tetraspan 6% HES Solution	B. Braun Melsungen AG	PZN: 05565416	priming volume, 1:1 with Sterofundin
Heparin Natrium 25.000	Ratiopharm GmbH	PZN: 3029843	2.5 IU per ml of priming solution
NaHCO3 8,4% Solution	B. Braun Melsungen AG	PZN: 1579775	3% in priming solution
KCL 7.45 % Solution	B. Braun Melsungen AG	PZN: 2418577	0.1 mL for cardioplegia
Carprofen	Zoetis Inc., USA	PZN:00289615 08859153	5 mg/kg/BW
1 Fr PU Catheter	Instechlabs INC., USA	C10PU-MCA1301	carotid artery
2 Fr PU Catheter	Instechlabs INC., USA	C20PU-MJV1302	jugular vein
Vasofix Safety catheter 20G	B.Braun Medical	4268113S-01	orotracheal intubation
8-0 Silk suture braided	Ashaway Line & Twine Mfg. Co., USA	75290	ligature
Isoflurane	Piramal Critical Care Deutschland GmbH	PZN:9714675	narcosis
CLINITUBES blood capillaries	Radiomed GmbH	51750132	blood sampling 60 - 95 microliter
Spring Scissors - 6mm Blades	Fine Science Tools GmbH	15020-15	instruments
Spring Scissors - 2mm Blades	Fine Science Tools GmbH	15000-03	instruments
Halsted-Mosquito Hemostat	Fine Science Tools GmbH	13009-12	instruments
Dumont #55 Forceps	Fine Science Tools GmbH	11295-51	instruments
Castroviejo Micro Needle Holder - 9cm	Fine Science Tools GmbH	12060-02	instruments
Micro Serrefines	Fine Science Tools GmbH	18555-01	instruments
Bulldog Serrefine	Fine Science Tools GmbH	18050-28	instruments
MiniVent Ventilator for Mice (Model 845)	Harvard Apparatus	73-0044	mechanical ventilation
Isoflurane Vaporizer Drager 19.1	Drägerwerk AG & Co. KGaA		anesthesia 1.3 - 2.5%
PowerLab data acquisition device 4/35	ADInstruments Ltd, New Zealand	PL3504	invasive pressure, ECG, temperature
ABL 800 Flex	Radiometer GmbH		blood gas analysis
NMRI mice	Charles River Laboratories	Crl:NMRI(Han)	male, 30 - 35 g, 12 weeks old, housed at least 1 week before the experiment