Kardiyopulmoner baypas gerektirmeyen bir fare modeli: yeni bir yaklaşım

Özet

Bu kağıt, Kardiyopulmoner bypass farelerde gerçekleştirmek açıklar. Bu yeni modeli moleküler mekanizmaları organ hasarı dahil incelenmesi kolaylaştıracaktır.

Özet

Uzun süreli Kardiyopulmoner bypass sırasında kalp müdahaleler daha gerekli hale geldikçe, artan bir klinik talep yordam en iyi duruma getirme ve uzun süreli extracorporal dolaşımdan kaynaklanan organ hasarı en aza indirmek için ortaya çıkar. Bu kağıt amacı tamamen fonksiyonel ve klinik manken Kardiyopulmoner baypas gerektirmeyen bir Mouse göstermekti. Biz cihaz tasarımı, perfüzyon devre optimizasyonu ve mikrocerrahi teknikleri raporu. Bu model birden çok kan çizimi için ihtiyaç nedeniyle hayatta kalma ile uyumlu değildir akut bir modeldir. Fareler için (örneğin, işaretçileri, altını gizleme vb.)araçları yelpazesi nedeniyle, bu modeli moleküler mekanizmaları üzerindeki araştırmasını organ hasarı ve Kardiyopulmoner bypass ile ilgili olarak diğer etkisini kolaylaştıracak comorbidities.

Giriş

Klinik içine Kardiyopulmoner bypass (KPB) giriş beri kalp cerrahisi¹' de önemli bir rol oynamıştır. Modern kardiyak cerrahi, uzamış CPB süresi geniş aort rekonstrüksiyonu ve kombine yordamları gerçekleştirmek için önemlidir. Teknolojik gelişmeler çok büyük olmasına rağmen extracorporal kan dolaşımı ile içi - ve ameliyat sonrası sistemik ilişkili ve yerel organ zarar^2,3.

Büyük hayvan modeller fizyolojik süreçleri^4,5KPB rolünü araştırmak için geliştirilmiştir. Her ne kadar bu modeller KPB bazıları içgörü komplikasyonlar ilgili sağlamış, onlar son derece pahalı ve moleküler araçları (örneğin, antikorlar) çok sınırlıdır. Daha maliyet etkin bir alternatif küçük hayvanlarda geliştirmiştir. Gelişimleri beri fare ve tavşan^5,6,7,8,9KPB modelinde en iyi duruma getirmek için birden fazla çalışmalar yapılmıştır. Bu modeller patofizyolojik hastalığı süreçleri ölçümleri için iyi bir temel sağlamak; Ancak, onlar hala hücresel ve humoral İmmünoloji ilgili antikorlar ve Kimyasalları eksikliği nedeniyle araştırmak yetersizdir. Bu araştırma Bu alan içindeki rollerine bozar.

Biz son zamanlarda KPB bir fare modeli geliştirdik. Genetik olarak değiştirilmiş fare ve fare özgü reaktifler çok çeşitli nedeniyle, fare modelleri genel olarak tercih ettiği fizyolojik, moleküler ve immünolojik araştırma^10,11modeli vardır. Bu nedenle, birçok fare suşların klinik olarak ilgili hastalıklar^12,13ile kullanılabilir olduğundan modelimiz KPB çalışma ile ilgili olarak çeşitli comorbidities kolaylaştıracaktır. Buna göre bu kağıt, ayrıntılı olarak KPB fareler nasıl gerçekleştirileceği açıklanır. Oksijen ve hemodinamik parametreler derin solunum ve dolaşım tutuklandıktan sonra yakından izlenir.

Protokol

tüm hayvan deneyleri Alman hayvan koruma kanunu (TierSchG) uygun olarak gerçekleştirilen ve yerel hayvan refahı Komitesi (alt Saksonya eyalet ofis için tüketicinin korunması ve gıda güvenliği, iletişim kuralı tarafından kabul edildi TSA 14/1556). Fare bu model için uygun en az kilo 25 yaşında g.

1. Preoperatif hazırlıklar

Not: tüm yordamları temiz, steril olmayan koşullar altında autoclaved araçlarıyla yapılmaktadır.

1. Yer 50-60 8 cm uzun propilen liflerin paralel bir tüp oyuk ve her iki tarafta bir T-adaptör ile bağlayın. Yapıştırıcı ile içi boş elyaf ve T-adaptör dış dalı arasındaki boşluğu doldurmak.
   1. İzin ver en az 24 tutkal sertleşmesine s. Dışarı uzanan T-standart bir microtome kullanarak bağdaştırıcısından boş lifler kesme ve bağlantı yerleri silikon tüp kenara.
2. Bir 27 G metal iğneden (26 G branule) 2 Fr poliüretan kanül yerleştirin. Cerrahi bir bıçak kullanın ve mikro-makas (8-12 X büyütme) 3-4 fenestrations yaklaşık 0.15 cm her sağlamak için kanül distal üçüncü içinde en uygun Venöz yapmak için mikroskop altında geri akışı.
   1. Kaldır tamamlandığında tel. Pamuk temizleme bezi künt disseksiyon ve retraksiyon yapıları için kullanın. Doku su kaybı önlemek için aşırı sıvı emmek için gazlı bez temizleme bezi (5 x 5 cm ²) kullanın.
3. Astar birim hazırlamak. Tamamlamak için heparin çözüm ve % 2.5 v/v % 8.4 çözümünün tamponlama için NaHCO ₃ priming mL başına 30 IU ekleyin. Bu çözüm kullanana kadar 4 ° C'de depolayın.
4. Doldurmak KPB devre (yani, pompa, hava avcı, boru ve her iki Kanüller) 850 µL astar eriyik yolu ile Venöz kanül ile. Hayvan cannulation için hazır olması ne kadar KPB dolaşan dolu bir kez tutmak.

2. Hayvan anestezi

anestezi yönetmek, hayvan indüksiyon odasında altında %2.5 yer için

1. v/v isoflurane/oksijen karışımı. Uygun anestezi tarafından değerlendirilmesi pedal çekilme refleks, kuyruk tutam refleks ve göz kırpma refleksi onaylayın. Göz kuruluğu önlemek için veteriner göz merhem uygulamak.
2. Sıcaklık düzenleyen fonksiyonu ile ısınma bir yastık üzerinde hayvan yer. Rektal eklenen ve veri toplama sistemine bağlı bir sonda ile vücut ısısını ölçmek.
Tam anestezi elde sonra
3. bir 20 G plastik braunule kullanarak, sözlü olarak ekleme ve görsel kontrol altında nefes borusu içine iterek hayvan orotracheally Tüp takacağım. Mekanik havalandırma bir fare vantilatöre bağlı bir isoflurane Buharlaştırıcı kullanarak başlatın. 250-350 µL gelgit hacmi elde havalandırma hayvan ağırlık bağlı olarak ayarlayın.
Tam analjezi sağlamak için
4. 5 mg/kg vücut ağırlığı hayvan carprofen subkutan enjekte et. Bu isoflurane konsantrasyonu % oksijen 1.3-2.5 arasında tutulması önerilir. Isoflurane konsantrasyon el ile ayarlanabilir prosedür Sahne bağlı olarak.

3. Cerrahi

1. sonra tam anestezi ve entübasyon, Ensizyon deri boyun için keskin iyi makas ile gerçekleştirmek, ayrı bir künt moda kaslarda ve Sağ juguler ven ve sol Karotis arter açığa. Hazırlık sırasında küçük gemiler en az kan kaybı emin olmak için iki kutuplu forseps için bağlı bir veteriner coagulator kullanarak koagüle.
2. Şah damarları hazırlanması sonra cranially sol ortak Karotid arter ile 8-0 ipek sütür kullanma, çatallanma distal segment ligate.
3. Kullanarak bir silikon konektörü (0,5 mm kimliği, 1 mm OD), yer 8-0 ipek sütür kayma Arteryel girişi boru için 27 G kanül distal sonu knot, arter ve INSERT Karotid arter içine kanül ucu proksimal segmentin bağlan.
4. 3-4 mm proksimale aort bırakır böylece kanül ucu kanül ucu doğru yerleşimini sonra ilerlemek. 8-0 ipek deniz mili ile güvenli hale getirme kanül ucu düzeltmek.
5. Kullanma mikrocerrahi forseps ve makas, künt ve keskin diseksiyon gerçekleştirmek, Sağ juguler ven yanal için köprücük, yakın boyun kas dokusunun künt hazırlık tarafından ortaya çıkarmak ve distal uç ve bir 8-0 8-0 ipek düğüm yerleştirin döngü proksimal ucunda.
6. Sonra ligasyonu juguler ven distal ucunun Sağ juguler ven ve sağ Kulakçık doğru ilerleme Venöz kanül ucu yeri ve ipek düğüm kullanarak güvenli. En uygun Venöz dönüş için Venöz uç sağ ventrikül ilerlemek gerekli olabilir.
7. Doğru kanül pozisyonu elde sonra sistemik heparinization heparin juguler ven içine direkt intravenöz enjeksiyon yolu ile hayvan vücut ağırlığı gram başına 2.5 IU ekleyerek devam.
8. Gerçek zamanlı invaziv basınç kontrolü için sol femoral arter cannulate. Kasık bölgesinde ortaya çıkarmak ve yavaşça femoral ven ve 25 X büyütme altında femoral sinir ortak femoral arter ayırın.
   1. Ligate distal femoral arter parçası. Geçici olarak bir kayma-düğüm ile proksimal bölümü doldurmak ve mikro-forseps kullanarak anterior duvarda küçük bir insizyon attım olun.
   2. Daha sonra 1 Fr poliüretan kanül femoral arter yerleştirin ve 10-0 sütür ipek ile sabitleyin. Bu kanül kan gaz analiz için kan örnekleri ayıklamak için kullanılır.
9. Sonra başarılı yerleşim Arteryel ve venöz Kanüller, Kardiyopulmoner bypass pompayı çevirerek başlatmak. KPB ile başlayan entübasyon üzerinden yaklaşık 45 dk. Pompa hızı artırarak bir akış hızı 0.5 mL/dk, sistemik basınç ölçümleri ve artış kan akımı tam akış (4-6 mL/dak) için 2 dk içinde bağlı olarak kullanarak başlangıç zamanıdır.
10. Tam kontrolü altında gerçekleştirmek ağız sapı başlayan ve 5 mm Kaudal yönde gidiyor keskin makas kullanarak üst bir yöntemdir. Hemen kanama önlemek için göğüs kenarları koagüle. Aort kranial yönde şu Şah damarı çekerek ortaya çıkarmak.
11. İçin en uygun denetimi, çepeçevre aort timus ve çevresindeki doku sıkma kolaylaştırmak için ücretsiz. Artan aort çevresine bir 8-0 ipek daire yerleştirin. Minikardiyopleji yöntemi için çapraz klemp yerleştirmek için daha iyi maruz için kranial yönde ipek döngü artan aort çekin.

4. Kardiyopulmoner baypas gerektirmeyen ve kan gazı analizi

1. kan gaz analizi (BGA) için cam kılcal tüpler femoral arter kateter yolu ile 60-90 µL arteryel kan toplamak için kullanın.
   1. Silikon tüp üzerinde küçük bir mengene kullanın ve sonda gelen boru ayır. Serbest yavaş yavaş kelepçe Kılcal Boru kontrollü dolum izin vermek için baskıyı.
   2. Kateter silikon tüp takın. Kan gazı analyzer aşağıdaki zaman noktalarda ölçümler için kılcal tüpler yerleştirin:
      10 dakika sonra KPB inisiyasyon havalandırma (BGA1) ile
      25 min CPB ve solunum durması (BGA2) 15 dk sonra
      40 dk CPB ve solunum durması (BGA3) 30 dk sonra
      KPB 55 dk., 45 dk solunum ve kalp durması (BGA4) 20 dk sonra
2. istikrarlı KPB akışı, baş altında Havalandırma durdurma tarafından te solunum tutuklama.
3. Havalandırma sona ermesi sonra ısınma yastık için 28 ºC ayarlayın ve topikal hayvan 28 ºC vücut ısısı solunum durması soğuk salin batırılmış gazlı bez kullanarak ilk 20 dk içinde için soğutma başlatın.
4. Kez bir vücut sıcaklığı 28 ºC elde ve toplam solunum tutuklama 30 dak sonra 0.3 mL %7,45 KCl çözeltisi Minikardiyopleji yöntemi başlatmak için KPB devre yönetmek.
5. İçin aort damarı sıkma çapraz, daha önce yerleştirilmiş ipek döngü (Adım 3.10) daha iyi maruz kranial yönde çekin ve bir mikro-serrefine kelepçe aort artan parçası yerleştirin.
6. Toplam 60 dk solunum ve kalp durması 30 dk gerçekleştirin. Mikro-serrefine kelepçe reperfüzyon kalp başlatmak için artan aort kaldırın. Aynı anda, yeniden havalandırın ve hayvan 37 sıcak ° C.
7. Reperfüzyon tamamladıktan ve hayvan normothermia, ulaştı sonra KPB pompası kapatarak sonlandırmak ve fizyolojik ölçümleri (örneğin vücut ısısı, EKG ve invaziv kan basıncı) 20 dakika süreyle izlemeye devam edin
8. Deneme sonunda hayvan tam anestezi (%5 isoflurane) altında exsanguinate ve toplamak kan ve organları daha fazla analiz ¹⁴.

Sonuçlar

Bu iletişim kuralı perfüzyon devre, cerrahi işlemler açıklanır ve fizyolojik parametrelerinin bir fare CPB sırasında izleme. Yeterince yetenekli bir microsurgeon tarafından gerçekleştirilen, sonuçları sürekli ve tekrarlanarak alınır.

Ortalama arter basıncı yeterli doku perfüzyon korumak için her zaman KPB kan akışını ayarlama ve ilave hacmi ekleyerek 40 ve 60 mmHg arasında tutulur. Hayvan, birim durumu ...

Tartışmalar

Bir tam işlev gören klinik olarak ilgili model KPB bir fare geliştirdik. Kalp-damar hastalıkları olan fareler otuzdan fazla suşları ile bizim model geliştirme için KPB ile ilgili yeni potansiyel iletişim kuralları için bir başlangıç noktası olabilir. Ayrıca, fare özgü reaktifler ve nakavt-out fareler bolluk, nedeniyle bu model sadece KPB geçerli fare modelinin yerini alamaz ama moleküler mekanizmaları KPB ile ilgili organ hasarı dahil diseksiyon kolaylaştıracaktır. Bugüne kadar KPB mikrocerrahi...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sterofundin	B.Braun Petzold GmbH	PZN:8609189	priming volume, 1:1 with Tetraspan
Tetraspan 6% HES Solution	B. Braun Melsungen AG	PZN: 05565416	priming volume, 1:1 with Sterofundin
Heparin Natrium 25.000	Ratiopharm GmbH	PZN: 3029843	2.5 IU per ml of priming solution
NaHCO3 8,4% Solution	B. Braun Melsungen AG	PZN: 1579775	3% in priming solution
KCL 7.45 % Solution	B. Braun Melsungen AG	PZN: 2418577	0.1 mL for cardioplegia
Carprofen	Zoetis Inc., USA	PZN:00289615 08859153	5 mg/kg/BW
1 Fr PU Catheter	Instechlabs INC., USA	C10PU-MCA1301	carotid artery
2 Fr PU Catheter	Instechlabs INC., USA	C20PU-MJV1302	jugular vein
Vasofix Safety catheter 20G	B.Braun Medical	4268113S-01	orotracheal intubation
8-0 Silk suture braided	Ashaway Line & Twine Mfg. Co., USA	75290	ligature
Isoflurane	Piramal Critical Care Deutschland GmbH	PZN:9714675	narcosis
CLINITUBES blood capillaries	Radiomed GmbH	51750132	blood sampling 60 - 95 microliter
Spring Scissors - 6mm Blades	Fine Science Tools GmbH	15020-15	instruments
Spring Scissors - 2mm Blades	Fine Science Tools GmbH	15000-03	instruments
Halsted-Mosquito Hemostat	Fine Science Tools GmbH	13009-12	instruments
Dumont #55 Forceps	Fine Science Tools GmbH	11295-51	instruments
Castroviejo Micro Needle Holder - 9cm	Fine Science Tools GmbH	12060-02	instruments
Micro Serrefines	Fine Science Tools GmbH	18555-01	instruments
Bulldog Serrefine	Fine Science Tools GmbH	18050-28	instruments
MiniVent Ventilator for Mice (Model 845)	Harvard Apparatus	73-0044	mechanical ventilation
Isoflurane Vaporizer Drager 19.1	Drägerwerk AG & Co. KGaA		anesthesia 1.3 - 2.5%
PowerLab data acquisition device 4/35	ADInstruments Ltd, New Zealand	PL3504	invasive pressure, ECG, temperature
ABL 800 Flex	Radiometer GmbH		blood gas analysis
NMRI mice	Charles River Laboratories	Crl:NMRI(Han)	male, 30 - 35 g, 12 weeks old, housed at least 1 week before the experiment