Kardiopulmonalen Bypass in einem Mausmodell: ein neuer Ansatz

Zusammenfassung

Dieses Papier beschreibt die kardiopulmonalen Bypass bei Mäusen durchführen. Dieses neue Modell erleichtert die Untersuchung der molekularen Mechanismen Organschäden.

Zusammenfassung

Während längerer kardiopulmonalen Bypass bei kardiologischen Eingriffen wichtiger wird, entsteht ein zunehmender klinischer Bedarf zur Optimierung der Verfahren und zur Minimierung der Organschäden, die aus dem längeren intravasalen Verkehr. Das Ziel dieser Arbeit war eine voll funktionsfähige und klinisch relevante Modell der kardiopulmonalen Bypass in einer Maus zu demonstrieren. Wir berichten über das Gerätedesign, Perfusion Schaltung Optimierung und mikrochirurgischen Techniken. Dieses Modell ist ein akuter Modell, das mit überleben aufgrund des Bedarfs an mehreren Blut Zeichnungen nicht kompatibel ist. Wegen der Auswahl an Tools für die Mäuse (z.B., Marker, Knockouts, etc.) wird dieses Modell Untersuchung über die molekularen Mechanismen der Organschäden und die Wirkung der kardiopulmonalen Bypass im Vergleich zu anderen erleichtern. Begleiterkrankungen.

Einleitung

Seit der Einführung der kardiopulmonalen Bypass (CPB) in die Klinik hat es eine wesentliche Rolle in der Herzchirurgie¹gespielt. In der modernen Herzchirurgie unbedingt längere CPB Zeit umfangreiche Aorten Rekonstruktionen und kombinierte Verfahren durchführen. Technologische Fortschritte enorm gewesen, die Verwendung des intravasalen Umlauf wird im Zusammenhang mit Intra- und postoperativen systemische und lokale Orgel Schaden^2,3.

Große Tier-Modelle wurden entwickelt, um die Rolle des CPB auf physiologische Prozesse^4,5zu untersuchen. Obwohl diese Modelle zur Verfügung, einen Einblick in die CPB Komplikationen verbunden gestellt haben, sie sind extrem teuer und molekulare Werkzeuge (z. B. Antikörper) sind sehr begrenzt. Bei kleinen Tieren wurde eine kostengünstigere Alternative entwickelt. Seit ihrer Entwicklung wurden mehrere Studien durchgeführt, um ein Modell der CPB in Ratten und Kaninchen^5,6,7,8,9zu optimieren. Diese Modelle bieten eine gute Grundlage für Messungen der pathophysiologischen Krankheitsprozesse; Sie sind jedoch noch nicht ausreicht, um zelluläre und humorale Immunologie aufgrund des Fehlens von entsprechenden Antikörper und Reagenzien zu untersuchen. Dies beeinträchtigt ihre Rolle in diesem Bereich der Forschung.

Wir haben vor kurzem ein Maus-Modell der CPB entwickelt. Durch eine Vielzahl von Maus-spezifischen Reagenzien und genetisch veränderte Mäuse sind Maus-Modellen im Allgemeinen das Modell der Wahl für physiologische, molekularen und immunologischen Forschung^10,11. Daher wird unser Modell die Studie von CPB in Bezug auf verschiedenen Komorbiditäten erleichtern, da gibt es viele Mäuse Stämme mit klinisch relevanten Krankheiten^12,13. Entsprechend beschreibt dieses Papier im Detail, wie CPB an Mäusen durchgeführt. Sauerstoff und hämodynamischen Parameter sind genau nach Tiefe Atem-und Kreislauf überwacht.

Protokoll

alle Tierversuche wurden durchgeführt in Übereinstimmung mit dem deutschen Gesetz über Tier (TierSchG) und wurden von der lokalen Tierschutz-Ausschuss (unteren sächsischen Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit, Protokoll genehmigt TSA 14/1556). Das minimale Gewicht der Maus für dieses Modell geeignet ist 25 g.

1. präoperativen Vorbereitungen

Hinweis: alle Eingriffe werden sauber, unsterilen Bedingungen mit autoklaviert Instrumenten durchgeführt.

1. 50-60 Platz 8 cm lange Propylen hohlen Fasern in ein Rohr parallel und verbinden Sie mit einem T-Adapter auf beiden Seiten. Füllen den Raum zwischen den Hohlfasern und der externe Teil der T-Adapter mit Leim.
   1. Erlauben mindestens 24 Stunden Aushärten des Klebers. Die hohlen Fasern aus der T-Adapter mit einem standard Mikrotom schneiden und ziehen Sie den Silikonschlauch über die Verbindungspunkte.
2. 2 Fr Polyurethan Kanüle eine Metallnadel 27 G (von einem 26G Branule) einfügen. Verwenden Sie eine chirurgische Klinge und Mikro-Schere unter dem Mikroskop (8-12 X Vergrößerung) zu drei bis vier Fenestrationen von je ca. 0,15 cm im distalen Drittel der Kanüle zu gewährleisten optimale venösen Rückfluss.
   1. Entfernen des Drahtes nach Abschluss. Verwenden Sie Wattestäbchen für stumpfe Dissektion und Retraktion der Strukturen. Gaze-Tupfer (5 x 5 cm ²) verwenden, um tanken überschüssige Flüssigkeit zu Gewebe Austrocknung zu verhindern.
3. Bereiten das Priming-Volumen. Fügen Sie für die Fertigstellung 30 IU Heparin pro mL Lösung und 2,5 % V/V einer 8.4 % Lösung von Nahco3 ₃ für die Pufferung zu grundieren hinzu. Speichern Sie diese Lösung bei 4 ° C bis verwendet.
4. Füllen die CPB-Schaltung (d. h., Pumpe, Luft Trapper, Tubing und beide Kanülen) mit 850 µL-Priming-Lösung über die venöse Kanüle. Sobald gefüllt, halten die CPB im Umlauf, bis das Tier zur Kanülierung bereitsteht.

2. Tierische Narkose

1. Anästhesie zu verwalten, legen Sie das Tier in eine Induktion Kammer unter 2,5 % V/V Isofluran/Sauerstoff-Gemisch. Bestätigen Sie ordnungsgemäße Betäubung durch Beurteilung von Pedal Rückzug Reflex, Tail Prise Reflex und Auge blinzeln Reflex. Tierärztliche Auge Salbe zur Vermeidung von Augentrockenheit.
2. Legen Sie das Tier auf eine Erwärmung mit klimaregulierende Funktion. Messen der Körpertemperatur mit einer Sonde rektal eingeführt und angeschlossen an das Datenerfassungssystem.
3. Nach Vollnarkose erreicht ist, Intubation der tierischen Orotracheally mit einer 20G Kunststoff Braunule, mündlich einlegen und schob es in die Luftröhre unter Sichtkontrolle. Mechanische Lüftung, die Verwendung einer Isofluran Vaporizer, verbunden mit einem Maus-Ventilator zu starten. Je nach Tier die Lüftung so einstellen, dass ein Tidalvolumen von 250-350 µL erreicht wird.
4. Komplette Analgesie versichern Spritzen subkutan 5 mg/kg Körpergewicht tierischen Carprofen. Es wird empfohlen, dass Isofluran Konzentration zwischen 1,3-2,5 % Sauerstoff gehalten werden. Isofluran Konzentration kann manuell eingestellt werden, je nach Stadium des Verfahrens.

3. Chirurgische Eingriffe

1. nach Vollnarkose und Intubation ist erreicht, führen Sie einen Mittellinie Hautschnitt am Hals mit einer scharfen Schere feinen Muskeln in einem stumpfen Mode zu trennen und Aussetzen der rechten Halsschlagader und linken Halsschlagader. Während der Zubereitung gerinnen kleine Schiffe mit einer tierärztlichen Coagulator verbunden, bipolare Pinzetten, um minimaler Blutverlust zu gewährleisten.
2. Nach der Präparation der Vena Schiffe, cranially verbinden das distale Segment der linke gemeinsame Halsschlagader zu seiner Gabelung mit seidenen Fäden 8-0.
3. Verbinden das distale Ende der Kanüle 27 G auf den arteriellen Zustrom Schlauch mit einem Silikon-Stecker (0,5 mm ID, 1 mm OD), Platz 8-0 Seide Naht Rutsch am proximalen Segment der Arterie, und legen Sie die Spitze der Kanüle in die Halsschlagader Knoten.
4. Nach der korrekten Platzierung von der Kanülenspitze der Kanülenspitze voraus, so dass es 3-4 mm proximal der Aortenbogen legt. Beheben der Kanülenspitze durch die Sicherung mit Seide Knoten 8-0.
5. Mit mikrochirurgischen Pinzetten und Scheren, stumpfe und scharfe Dissektion durchzuführen, aussetzen der rechten Halsschlagader durch stumpfe Präparation des Gewebes seitlich an den sternocleidomastoideus-Muskel in der Nähe von Schlüsselbein, und legen Sie einen 8-0 Seide Knoten am distalen Ende und ein 8-0 Schleife am proximalen Ende.
6. Nach Unterbindung der distalen Ende der Halsschlagader, setzen Sie die Spitze der venösen Kanüle in der rechten Halsschlagader und Fortschritte in Richtung auf den rechten Vorhof und mit der Seide Knoten sichern. Für optimale venösen Rückfluss, ist es möglicherweise erforderlich, die venöse Spitze in den rechten Ventrikel gelangen.
7. Sobald die korrekte Kanüle Position erreicht ist, führen Sie systemische Heparinisierung durch Zugabe von 2,5 IU Heparin pro Gramm der tierischen Körpergewicht über direkte intravenöse Injektion in die Halsschlagader.
8. Für Echtzeit-invasive Drucküberwachung, cannulate die linke Femoral Arterie. Aussetzen die Leistengegend und vorsichtig trennen die gemeinsame Femoral Arterie aus der femoral Ader und femoral Nerv unter 25 X Vergrößerung.
   1. Ligate der distale Teil der Femoral Arterie. Vorübergehend verdecken den proximalen Teil mit eine Anfangsschlaufe und machen einen kleinen Schnitt an der vorderen Wand mit Mikro-Pinzetten.
   2. Danach legen Sie eine 1 Fr Polyurethan Kanüle in die Femoral Arterie und sichern Sie es mit einem Seide 10-0 Naht. Diese Kanüle wird verwendet, um Blutproben für die Gasanalyse Blut extrahieren.
9. Nach der erfolgreichen Platzierung der arteriellen und venösen Kanülen, initiieren kardiopulmonalen Bypass durch Einschalten der Pumpe. Die Intubation zum Start des CPB beträgt ca. 45 min. Starten Sie mit einer Fließgeschwindigkeit von 0,5 mL/min, je nach systemischen Druckmessungen und Erhöhung der Durchblutung innerhalb von 2 min auf vollen Durchfluss (4-6 mL/min) durch die Erhöhung der Pumpendrehzahl.
10. Unter voller Kontrolle durchführen einer oberen Sternotomie mit scharfen Schere ab das Manubrium und 5 mm in der kaudalen Richtung gehen. Gerinnen der sternalen Kanten sofort um Blutungen zu vermeiden. Aussetzen der Aortenbogen durch Ziehen der rechten Halsschlagader in kranialer Richtung.
11. Für optimale Kontrolle, umlaufend frei Aortenbogen aus dem Thymus und umliegendes Gewebe spannen zu erleichtern. Legen Sie eine 8: 0 Seide Schleife um die Aorta ascendens. Um die Kreuzklemme für Kardioplegie platzieren, Schlaufe die Seide in kranialer Richtung besser aussetzen der Aorta ascendens.

4. Herz-Lungen-Bypass und Blut-Gas-Analyse

1. für Gas Blutanalyse (BGA), verwenden Sie Glas-Kapillarröhrchen, um 60-90 µL arterielles Blut über die Femoral Arterie Katheter zu sammeln.
   1. Eine kleine Klemme auf der Silikonschlauch und lösen Sie den Schlauch vom Katheter. Druck langsam auf die Klemme ermöglicht kontrollierte Füllung des Kapillarröhrchens.
   2. Befestigen Sie den Silikonschlauch des Katheters. Blut-Gas-Analysator für Messungen zu den folgenden Zeitpunkten Kapillarröhrchen einfügen:
      10 min nach der Einleitung der CPB mit Belüftung (BGA1)
      nach 25 min von CPB und 15 min von Atemstillstand (BGA2)
      nach 40 min von CPB und 30 min von Atemstillstand (BGA3)
      nach 55 min von CPB, 45 min der Atemwege und 20 min an Herzstillstand (BGA4)
2. durch stabile CPB fließen, Initiative Te Atemstillstand durch Anhalten Lüftung.
3. Nach Beendigung der Belüftung, stellen die Erwärmung Pad 28 º c und starten Sie topisch Kühlung das Tier auf 28 ° c Körpertemperatur innerhalb der ersten 20 Minuten Atemstillstand mit Gaze in kalten Kochsalzlösung getränkt.
4. Einmal eine Temperatur von 28 ° c erreicht wird, und nach insgesamt 30 min Atemstillstand, verwalten 0,3 mL 7,45 % KCl-Lösung in den Kreislauf der CPB Kardioplegie initiieren.
5. Für überqueren Sie Klemmen der Aorta, ziehen Sie die zuvor platzierte Seide Schleife (Schritt 3.10) in Pfeilrichtung kranialen für bessere Belichtung und legen Sie eine Mikro-Serrefine Klammer auf den aufsteigenden Teil der Aorta.
6. Führen Sie insgesamt 60 min Atemstillstand und 30 min von Herzstillstand. Entfernen Sie die Mikro-Serrefine-Klemme aus der Aorta ascendens, Reperfusion des Herzens zu initiieren. Gleichzeitig wieder lüften und wärmen Sie das Tier auf 37 ° c
7. Nach Reperfusion abgeschlossen ist und das Tier Normothermie erreicht, kündigen die CPB durch das Ausschalten der Pumpe und weiterhin überwachen physiologische Messungen (z.B. Körpertemperatur, EKG, und invasive Blutdruckmessung) für 20 min.
8. Am Ende des Experiments, das Tier in Vollnarkose (5 % Isofluran) aussaugen und sammeln Blut und Organe für die weitere Analyse ¹⁴.

Ergebnisse

Dieses Protokoll beschreibt die Perfusion Schaltung, chirurgische Eingriffe und die Überwachung der physiologischen Parameter während CPB einer Maus. Wenn von einem angemessen qualifizierten Mikrochirurg durchgeführt, werden die Ergebnisse konstant und reproduzierbar erzielt.

Um ausreichende Gewebedurchblutung zu erhalten, wird der mittlere arterielle Druck immer zwischen 40 und 60 MmHg durch Anpassung des CPB Blutfluss und H...

Diskussion

Wir haben eine voll funktionsfähige klinisch relevante Modell des CPB in eine Maus entwickelt. Mit mehr als 30 Stämme von Mäusen mit Herz-Kreislauf-Krankheiten wäre unser Modell einen Ausgangspunkt für die Entwicklung neuer Interessenten Protokolle im Zusammenhang mit CPB. Darüber hinaus aufgrund der Fülle von Maus-spezifischen Reagenzien und Ko-Out Mäuse, dieses Modell kann nicht nur die aktuellen Rattenmodell der CPB ersetzen aber erleichtert Sezieren von den molekularen Mechanismen CPB-bezogene Organschäden. ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sterofundin	B.Braun Petzold GmbH	PZN:8609189	priming volume, 1:1 with Tetraspan
Tetraspan 6% HES Solution	B. Braun Melsungen AG	PZN: 05565416	priming volume, 1:1 with Sterofundin
Heparin Natrium 25.000	Ratiopharm GmbH	PZN: 3029843	2.5 IU per ml of priming solution
NaHCO3 8,4% Solution	B. Braun Melsungen AG	PZN: 1579775	3% in priming solution
KCL 7.45 % Solution	B. Braun Melsungen AG	PZN: 2418577	0.1 mL for cardioplegia
Carprofen	Zoetis Inc., USA	PZN:00289615 08859153	5 mg/kg/BW
1 Fr PU Catheter	Instechlabs INC., USA	C10PU-MCA1301	carotid artery
2 Fr PU Catheter	Instechlabs INC., USA	C20PU-MJV1302	jugular vein
Vasofix Safety catheter 20G	B.Braun Medical	4268113S-01	orotracheal intubation
8-0 Silk suture braided	Ashaway Line & Twine Mfg. Co., USA	75290	ligature
Isoflurane	Piramal Critical Care Deutschland GmbH	PZN:9714675	narcosis
CLINITUBES blood capillaries	Radiomed GmbH	51750132	blood sampling 60 - 95 microliter
Spring Scissors - 6mm Blades	Fine Science Tools GmbH	15020-15	instruments
Spring Scissors - 2mm Blades	Fine Science Tools GmbH	15000-03	instruments
Halsted-Mosquito Hemostat	Fine Science Tools GmbH	13009-12	instruments
Dumont #55 Forceps	Fine Science Tools GmbH	11295-51	instruments
Castroviejo Micro Needle Holder - 9cm	Fine Science Tools GmbH	12060-02	instruments
Micro Serrefines	Fine Science Tools GmbH	18555-01	instruments
Bulldog Serrefine	Fine Science Tools GmbH	18050-28	instruments
MiniVent Ventilator for Mice (Model 845)	Harvard Apparatus	73-0044	mechanical ventilation
Isoflurane Vaporizer Drager 19.1	Drägerwerk AG & Co. KGaA		anesthesia 1.3 - 2.5%
PowerLab data acquisition device 4/35	ADInstruments Ltd, New Zealand	PL3504	invasive pressure, ECG, temperature
ABL 800 Flex	Radiometer GmbH		blood gas analysis
NMRI mice	Charles River Laboratories	Crl:NMRI(Han)	male, 30 - 35 g, 12 weeks old, housed at least 1 week before the experiment