Puente cardiopulmonar en un modelo de ratón: un nuevo enfoque

Resumen

Este artículo describe cómo realizar la derivación cardiopulmonar en ratones. Este nuevo modelo facilitará la investigación de los mecanismos moleculares implicados en el daño del órgano.

Resumen

Como bypass cardiopulmonar prolongada se vuelve más esencial durante intervenciones cardiológicas, se presenta una demanda creciente de la clínica para la optimización del procedimiento y para reducir al mínimo daño a los órganos resultantes de la circulación extracorpórea prolongada. El objetivo de este trabajo fue demostrar un modelo completamente funcional y clínicamente relevante de puente cardiopulmonar en un ratón. Divulgamos sobre el diseño del dispositivo de optimización de circuito de perfusión y técnicas microquirúrgicas. Este modelo es un modelo agudo, que no es compatible con la supervivencia debido a la necesidad de múltiples dibujos de sangre. Debido a la gama de herramientas disponibles para los ratones (p. ej., marcadores, agujeros ciegos, etc.), este modelo facilitará la investigación sobre los mecanismos moleculares de daño del órgano y el efecto de puente cardiopulmonar en relación con otros comorbilidades.

Introducción

Desde la introducción en la clínica de puente cardiopulmonar (CPB), jugó un papel esencial en la cirugía cardíaca¹. En la cirugía cardiaca moderna, tiempo de CEC prolongado es esencial para llevar a cabo reconstrucciones aórticas extensa y procedimientos combinados. Aunque los avances tecnológicos han sido tremendos, el uso de circulación extracorpórea se asocia con intra y postoperatorias sistémicas y daño de órgano local^2,3.

Grandes modelos animales se han desarrollado para investigar el papel de la CPB en procesos fisiológicos^4,5. Aunque estos modelos han proporcionado una visión de la CPB complicaciones asociadas, son extremadamente costosos y herramientas moleculares (p. ej., anticuerpos) son muy limitadas. Una alternativa más costo-eficiente se ha desarrollado en pequeños animales. Desde su desarrollo, se han realizado múltiples estudios para optimizar un modelo CPB en ratas y conejos^5,6,7,8,9. Estos modelos proporcionan una buena base para la medición de los procesos fisiopatológicos de la enfermedad; sin embargo, son todavía insuficientes para investigar Inmunología celular y humoral debido a la falta de los correspondientes anticuerpos y reactivos. Esto deteriora su papel en este campo de investigación.

Recientemente hemos desarrollado un modelo de ratón de CPB. Debido a una gran variedad de reactivos específicos de ratón y ratones genéticamente modificados, modelos de ratón son en general el modelo de elección para la investigación fisiológica, molecular e inmunológica^10,11. Por lo tanto, nuestro modelo facilitará el estudio de la CPB en relación con diversas comorbilidades ya que hay muchas cepas de ratones con enfermedades clínicamente relevantes^12,13. Por consiguiente, este artículo describe, en detalle, cómo realizar CPB en ratones. Oxígeno y parámetros hemodinámicos son vigilados de cerca después de la detención de la profundidad respiratoria y circulatoria.

Protocolo

todos los experimentos con animales se realizaron en cumplimiento de la ley de protección Animal (TierSchG) y fueron aprobados por el Comité de bienestar de los animales locales (Baja Sajonia oficina del estado para la protección de los consumidores y seguridad alimentaria, protocolo TSA 14/1556). El peso mínimo del mouse adecuado para este modelo es de 25 g.

1. preparación preoperatoria

Nota: todos los procedimientos se llevan a cabo en condiciones limpias, no estériles, con instrumentos esterilizados.

1. Lugar 50-60 8 cm largo propileno hueco fibras en paralelo en un tubo y conecte con un adaptador en T en ambos lados. Llene el espacio entre las fibras huecas y la rama externa del adaptador en T con pegamento.
   1. Permitir al menos 24 horas para el pegamento se endurezca. Cortar las fibras huecas que se extiende hacia fuera desde el adaptador de T usando un micrótomo estándar y tirar el tubo de silicona los sitios de conexión.
2. Inserte una aguja metálica de 27 G (de un branule de 26G) en una cánula de poliuretano Fr 2. Utilice una hoja quirúrgica y micro tijeras bajo el microscopio (aumento de X 8-12) para hacer tres o cuatro huecos de aproximadamente 0,15 cm en el tercio distal de la cánula para asegurar óptima venosa volver flujo.
   1. Quitar el alambre terminada. Usar bastoncillos de algodón para la disección Roma y retracción de las estructuras. Utilizar torundas de Gasa (5 x 5 cm ²) para absorber exceso de líquido para evitar deshidratación del tejido.
3. Prepare el volumen de cebado. Para finalizar, Añadir 30 UI de heparina por mL de solución y 2,5% v/v de una solución de 8,4% de NaHCO ₃ para el almacenamiento en búfer de cebado. Almacenar esta solución a 4 ° C hasta su uso.
4. Llenar el circuito de CEC (es decir,, bomba, trampas de aire, tubería y ambas cánulas) con solución de cebado de 850 μl a través de la cánula venosa. Una vez rellenado, mantener el CPB de circulación hasta que el animal esté listo para la canulación.

2. Anestesia de animales

1. para administrar anestesia, colocar al animal en una cámara de inducción debajo del 2.5% mezcla de oxígeno/isoflurano v/v. Confirmar adecuada anestesia evaluar el reflejo pedal retirada, cola pizca reflejo y reflejo de abrir y cerrar de ojos. Aplique ungüento veterinario ojo para evitar la sequedad del ojo.
2. Colocar el animal en un cojín de calentamiento con la función de regulación de temperatura. Medir temperatura con una sonda insertada por vía rectal y conectarse al sistema de adquisición de datos.
3. Después de anestesia completa, intubar al animal orotracheally usando un braunule de plástico 20G, insertar por vía oral y empujándolo en la tráquea bajo control visual. Iniciar la ventilación mecánica utilizando un vaporizador de isoflurano conectado a un ventilador de ratón. Según el peso de los animales, ajustar la ventilación para que se logre un volumen de 250-350 μl.
4. Para asegurar la analgesia completa, inyectar en forma subcutánea 5 mg/kg peso animal carprofen. Se recomienda que la concentración de isoflurano mantenerse entre 1.3-2.5% de oxígeno. Concentración de isoflurano puede ajustarse manualmente dependiendo de la etapa del procedimiento de.

3. Procedimientos quirúrgicos

1. después de intubación y anestesia completa, realizar una incisión en la piel de la línea media hasta el cuello con unas tijeras bien afiladas, separar músculos de una manera contundente y exponer la vena yugular derecha y arteria carótida izquierda. Durante la preparación, coagular pequeños vasos utilizando un coagulador veterinaria conectado a fórceps bipolares para la pérdida de sangre mínima.
2. Después de la preparación de los vasos yugulares, cranially ligar el segmento distal de la arteria carótida común izquierda hasta su bifurcación con las suturas de seda 8-0.
3. Conectar el extremo distal de una cánula de 27 G a la tubería de la entrada arterial usando un conector de silicona (identificación de 0,5 mm, 1 mm OD), lugar 8-0 sutura seda deslizamiento nudos en el segmento proximal de la arteria y coloque la punta de la cánula en la arteria carótida.
4. Después de la colocación correcta de la punta de la cánula, haga avanzar la punta de la cánula para que pone 3-4 mm proximal al arco aórtico. Fijar la punta de la cánula por asegurar con nudos de seda 8-0.
5. Usando fórceps microsurgical y tijeras, realizar disección Roma y aguda, exponer la vena yugular derecha por contundente preparación del tejido lateralmente al músculo esternocleidomastoideo, cerca de la clavícula y colocar un nudo de seda 8-0 en el extremo distal y un 8-0 lazo en el extremo proximal.
6. Después de la ligadura del extremo distal de la vena yugular, coloque la punta de la cánula venosa en la vena yugular derecha y progresos en la aurícula derecha y segura utilizando el nudo de seda. Para el óptimo retorno venoso, puede ser necesario avanzar la punta venosa en el ventrículo derecho.
7. Una vez lograda la posición correcta de la cánula, realizar heparinización sistémica mediante la adición de 2,5 UI de heparina por gramo del peso del cuerpo animal vía inyección intravenosa directa en la vena yugular.
8. Para monitoreo de presión invasiva en tiempo real, canule la arteria femoral izquierda. Exponer la ingle y suavemente separar la arteria femoral común de la vena femoral y nervio femoral bajo 25 aumentos.
   1. Ligan la parte distal de la arteria femoral. Ocluir la parte proximal con un deslizar-nudo temporalmente y hacer una pequeña incisión en la pared anterior con micro pinzas.
   2. Luego, inserte una cánula poliuretano 1 de Fr en la arteria femoral y asegúrelo con una seda sutura de 10-0. Esta cánula se utiliza para extraer muestras de sangre para gasometría arterial.
9. Tras la exitosa colocación de las cánulas arteriales y venosas, iniciar la derivación cardiopulmonar por encender la bomba. El tiempo de intubación a partir de CPB es aproximadamente 45 minutos comenzar a utilizar un flujo de 0,5 mL/min, dependiendo de las mediciones de la presión sistémica y aumentar el flujo sanguíneo dentro de 2 minutos (4-6 mL/min) caudal al aumentar la velocidad de la bomba.
10. Bajo control completo, realizar una esternotomía superior utilizando unas tijeras afiladas desde el manubrio y va de 5 mm en la dirección caudal. Coagular los bordes esternales inmediatamente para evitar sangrado. Exponer el arco aórtico tirando en dirección craneal de la arteria carótida derecho.
11. Para un control óptimo, libre circunferencial del arco aórtico por el timo y los tejidos circundantes para facilitar la sujeción. Colocar un lazo de seda 8-0 alrededor de la aorta ascendente. Para colocar la pinza cruzada para cardioplejía, tire del lazo de seda en la dirección craneal para mejor exponer la aorta ascendente.

4. Bypass cardiopulmonar y gasometría arterial

1. para análisis de gases sanguíneos (BGA), utiliza tubos capilares de vidrio para recolectar 60-90 μl sangre arterial mediante el catéter de la arteria femoral.
   1. Utilice una pequeña pinza en el tubo de silicona y separe el tubo del catéter. Libere la presión lentamente en la pinza para permitir llenado controlado del tubo capilar.
   2. Vuelva a colocar el tubo de silicona para el catéter. Inserte los tubos capilares en el analizador del gas de sangre para la medición en los siguientes momentos:
      10 minutos después de la iniciación de CPB con ventilación (BGA1)
      después de 25 min de CPB y 15 min de parada respiratoria (portátiles: BGA2)
      después de 40 min de CPB y 30 min de parada respiratoria (BGA3)
      después de 55 min de CPB, 45 min de respiratorio y 20 minutos del fallo cardiaco (BGA4)
2. bajo flujo estable de la CPB, inicia paro respiratorio te deteniendo ventilación.
3. Después de la terminación de la ventilación, la cubierta térmica de colchón a 28 º c y empezar tópicamente refresca el animal a la temperatura corporal de 28 º c dentro de los primeros 20 minutos de paro respiratorio mediante una gasa empapada en solución salina fría.
4. Una vez que se logra una temperatura corporal de 28 º c y después de un total de 30 min de parada respiratoria, administrar 0.3 mL de solución de KCl de 7.45% en el circuito de CEC para iniciar cardioplejía.
5. Cruz de pinzamiento de la aorta, tire del lazo de seda previamente colocado (paso 3.10) en dirección craneal para la mejor exposición y poner una pinza de micro-serrefine en la parte ascendente de la aorta.
6. Realizar un total de detención respiratoria de 60 min y 30 min de un paro cardíaco. Quite la abrazadera micro serrefine de la aorta ascendente para iniciar la reperfusión del corazón. Al mismo tiempo, volver a ventilar y calentar el animal a 37 ° C.
7. Después de la reperfusión es terminada y el animal ha llegado a normotermia, terminar la CPB apagando la bomba y seguimiento medidas fisiológicas (e.g. temperatura, ECG y presión arterial invasiva) durante 20 min
8. Al final del experimento, exsanguinate el animal bajo anestesia completa (5% isoflurano) y recoger la sangre y órganos para más análisis ¹⁴.

Resultados

Este protocolo describe el circuito de perfusión, procedimientos quirúrgicos y el seguimiento de los parámetros fisiológicos durante la CEC de un ratón. Cuando es realizada por un microsurgeon adecuadamente capacitado, los resultados son consistente y reproducible obtenidos.

Para mantener la perfusión adecuada del tejido, la presión arterial media se mantiene siempre entre 40 y 60 mmHg ajustando el flujo de sangre CPB y a...

Discusión

Hemos desarrollado un modelo clínico relevante totalmente funcional de CPC en un ratón. Con más de 30 cepas de ratones con enfermedades cardiovasculares, nuestro modelo podría ser un punto de partida para el desarrollo de nuevos protocolos prospectivos relacionados con el CPB. Por otra parte, debido a la gran cantidad de reactivos específicos de ratón y ratones knockout-hacia fuera, este modelo no sólo puede sustituir el actual modelo de rata de CPB pero facilitará la disección de los mecanismos moleculares impl...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sterofundin	B.Braun Petzold GmbH	PZN:8609189	priming volume, 1:1 with Tetraspan
Tetraspan 6% HES Solution	B. Braun Melsungen AG	PZN: 05565416	priming volume, 1:1 with Sterofundin
Heparin Natrium 25.000	Ratiopharm GmbH	PZN: 3029843	2.5 IU per ml of priming solution
NaHCO3 8,4% Solution	B. Braun Melsungen AG	PZN: 1579775	3% in priming solution
KCL 7.45 % Solution	B. Braun Melsungen AG	PZN: 2418577	0.1 mL for cardioplegia
Carprofen	Zoetis Inc., USA	PZN:00289615 08859153	5 mg/kg/BW
1 Fr PU Catheter	Instechlabs INC., USA	C10PU-MCA1301	carotid artery
2 Fr PU Catheter	Instechlabs INC., USA	C20PU-MJV1302	jugular vein
Vasofix Safety catheter 20G	B.Braun Medical	4268113S-01	orotracheal intubation
8-0 Silk suture braided	Ashaway Line & Twine Mfg. Co., USA	75290	ligature
Isoflurane	Piramal Critical Care Deutschland GmbH	PZN:9714675	narcosis
CLINITUBES blood capillaries	Radiomed GmbH	51750132	blood sampling 60 - 95 microliter
Spring Scissors - 6mm Blades	Fine Science Tools GmbH	15020-15	instruments
Spring Scissors - 2mm Blades	Fine Science Tools GmbH	15000-03	instruments
Halsted-Mosquito Hemostat	Fine Science Tools GmbH	13009-12	instruments
Dumont #55 Forceps	Fine Science Tools GmbH	11295-51	instruments
Castroviejo Micro Needle Holder - 9cm	Fine Science Tools GmbH	12060-02	instruments
Micro Serrefines	Fine Science Tools GmbH	18555-01	instruments
Bulldog Serrefine	Fine Science Tools GmbH	18050-28	instruments
MiniVent Ventilator for Mice (Model 845)	Harvard Apparatus	73-0044	mechanical ventilation
Isoflurane Vaporizer Drager 19.1	Drägerwerk AG & Co. KGaA		anesthesia 1.3 - 2.5%
PowerLab data acquisition device 4/35	ADInstruments Ltd, New Zealand	PL3504	invasive pressure, ECG, temperature
ABL 800 Flex	Radiometer GmbH		blood gas analysis
NMRI mice	Charles River Laboratories	Crl:NMRI(Han)	male, 30 - 35 g, 12 weeks old, housed at least 1 week before the experiment