Искусственного кровообращения в мышиной модели: новый подход

Резюме

Этот документ описывает, как выполнять искусственного кровообращения у мышей. Эта новая модель будет способствовать изучение молекулярных механизмов, занимающихся повреждения органов.

Аннотация

Как длительное искусственного кровообращения становится более важным во время кардиологических вмешательств, клинических спрос возникает для оптимизации процедуры и минимизации орган ущерба в результате длительного экстракорпоральной циркуляции. Целью этой статьи было продемонстрировать полностью функциональной и клинически значимых модель искусственного кровообращения в мыши. Мы сообщаем о дизайн устройства, оптимизация цепи перфузии и микрохирургической техники. Эта модель является острый модель, которая не совместима с выживания вследствие необходимости для нескольких рисунков крови. Из-за ряда инструментов, доступных для мышей (например, маркеры, нокауты и т.д.) Эта модель будет способствовать расследование молекулярные механизмы повреждения органов и эффект искусственного кровообращения по отношению к другой сопутствующих заболеваний.

Введение

С момента введения искусственного кровообращения (КПБ) в клинике она сыграла важную роль в хирургии сердца¹. В современной кардиохирургии длительное время КПБ имеет важное значение для выполнения обширной реконструкции аорты и комбинированных процедур. Хотя технологические достижения были огромны, использования экстракорпоральной циркуляции связан с интра - и послеоперационной системных и местный орган ущерб^2,3.

Крупные животные модели были разработаны для расследования роли КПБ на физиологические процессы в^4,5. Хотя эти модели представление о некоторых из КПБ ассоциированных осложнений, они являются очень дорогостоящими и молекулярных инструменты (например, антитела) весьма ограничены. Была разработана более экономичную альтернативу в мелких животных. После их разработки оптимизировать модель КПБ в крыс и кроликов^5,6,,78,9были проведены многочисленные исследования. Эти модели обеспечивают хорошую основу для измерения процессов патофизиологические болезни; Однако они все еще недостаточны для расследования гуморального и клеточного иммунологии из-за отсутствия соответствующих антител и реагенты. Это ухудшает их роль в этой области исследований.

Мы недавно разработали модель мыши КПБ. Благодаря широкому выбору мыши специфические реагенты и генетически модифицированные мыши мыши модели являются в целом модель выбора для физиологических, молекулярной и иммунологических исследований^10,11. Таким образом наша модель будет способствовать изучению КПБ в отношении различных сопутствующих заболеваний, как есть много мышей штаммов с клинически значимых заболеваний^12,13. Соответственно этот документ описывает, в деталях, как выполнять КПБ в мышах. После глубокого дыхания и кровообращения ареста внимательно следить за кислорода и гемодинамики.

протокол

все эксперименты на животных были проведены в соответствии с немецкого закона о защите животных (TierSchG) и были утверждены Комитетом местных животных (Нижняя Саксония государственное управление по защите прав потребителей и безопасность пищевых продуктов, протокол TSA 14/1556). Минимальный вес мыши подходит для этой модели — 25 г.

1. предоперационная подготовка

Примечание: все процедуры осуществляются в чистой, не стерильных условиях, газобетона инструментами.

1. Место 50-60 8-cm длинный пропилена полых волокон параллельно в трубку и связаться с Т-адаптер с обеих сторон. Заполнить пространство между полых волокон и внешние отделение Т-адаптер с клеем.
   1. Разрешить по крайней мере 24 часа для клея для упрочнения. Вырезать полые волокна, которая выходит из Т-адаптер, используя стандартный микротом и натяните силиконовые трубки для соединения сайтов.
2. Вставьте 2 Fr полиуретановые канюля металла иглу 27 G (от 26G branule). Используйте хирургическое лезвие и микро ножницы под микроскопом (8-12 крат) сделать три-четыре ярусе около 0,15 см каждый в дистальной трети канюля для обеспечения оптимального венозного возврата потока.
   1. Удалить провод после завершения. Используйте ватные тампоны для тупых диссекции и Ретракция структур. Использовать марлевые тампоны (5 x 5 см ²) чтобы впитывать лишнюю жидкость для предотвращения обезвоживания тканей.
3. Подготовить грунтование тома. Для завершения добавьте 30 ед гепарина мл грунтовка решения и 2,5% v/v 8,4% раствора NaHCO ₃ для буферизации. Хранить это решение на 4 ° C до тех пор, пока используется.
4. Заполнить цепи КПБ (т.е., насос, воздушный охотник, труб и оба канюли) раствором 850 мкл грунтование через венозный катетер. После того, как заполнены, держать циркулирующих КПБ, пока животное не готова для катетеризации.

2. Животных анестезии

1. для администрирования анестезии, поместите животное в камеру всасывание под 2,5% v/v изофлюрановая/кислородная смесь. Подтвердите надлежащее анестезии путем оценки педали вывода рефлекс, хвост щепотку рефлекс и рефлекс глаз мерцания. Применять мазь ветеринарных глаз избежать сухости глаз.
2. Место животное на потепление площадку с функцией регулирования температуры. Измерение температуры тела с зонд вставляется ректально и подключены к системе сбора данных.
3. После достижения полной анестезии, интубировать животных orotracheally с использованием пластиковых braunule 20G, вставив его устно и вставив его в трахею под визуальным контролем. Начала искусственной вентиляции легких с помощью изофлюрановая испарителем, подключенных к мыши вентилятора. В зависимости от веса животного, отрегулируйте вентиляции, таким образом, чтобы достичь дыхательный объем 250-350 мкл.
4. Для обеспечения полной анестезии, вводить подкожно 5 мг/кг массы тела животных carprofen. Рекомендуется, что концентрация изофлюрановая храниться между 1,3-2,5% кислорода. Изофлюрановая концентрация вручную может корректироваться в зависимости от стадии процедуры.

3. Хирургические процедуры

1. после того, как достигается полная анестезия и интубации, выполняют Кожный разрез средней линии шеи с тонкой ножницами, отдельных мышц в тупой моды и подвергать право яремной вены и левой сонной артерии. Во время подготовки, коагулировать малых судов с использованием ветеринарных коагулятор, подключенных к биполярный пинцет для обеспечения минимальной кровопотерей.
2. После подготовки шейных сосудов, краниально перевязать Дистальный сегмент левую общую сонную артерию на его развертывание с использованием шелковых нитей 8-0.
3. Подключение, дистальный конец канюли 27 G приток артериальной трубок с помощью силиконового соединителя (ID 0,5 мм, 1 мм OD), место 8-0 Шелковый шов скольжения узлов в проксимальном сегменте артерии и вставить кончик канюли в сонной артерии.
4. После правильного размещения кончика канюля, заранее кончик канюля, так, что она откладывает 3-4 мм проксимально аорты. Исправить кончик канюля путем обеспечения с шелковой узлов 8-0.
5. Использование микрохирургических щипцы и ножницы, выполняют тупые и острые рассечение, подвергать право яремной тупым подготовка ткани боков к ключично мышцы, недалеко от ключицы и место 8-0 шелк узел на дистальном конце и 8-0 цикла в проксимальном конце.
6. После перевязки дистального конца яремной вены, поместите кончик венозная канюля в правой яремной вены и прогресс в направлении правого предсердия и secure с использованием шелковой узел. Для оптимального венозный возврат, это может быть необходимо заранее венозной кончика в правый желудочек.
7. Как только достигается правильным канюля позиции, выполнять системные Гепаринизация путем добавления 2,5 МЕ гепарина на грамм веса животных через прямой внутривенные инъекции в яремной.
8. Для мониторинга в реальном времени инвазивного давления, иглу левой бедренной артерии. Подвергать паховой области и аккуратно отделить общие бедренной артерии от бедренной вены и бедренного нерва под 25 крат.
   1. Ligate дистальной частью бедренной артерии. Временно загородить проксимальной части с скольжения узел и сделать небольшой надрез на передней стенке с помощью микро пинцет.
   2. После этого, вставьте 1 Полиуретановые канюля Fr в бедренной артерии и закрепите его с шелком шва 10-0. Этот катетер используется для извлечения образцов крови для анализа газов крови.
9. После успешного размещения артериальной и венозной канюли, инициировать искусственного кровообращения, повернув на насосе. Время от интубации начиная КПБ является примерно 45 мин начать использовать скорость потока 0,5 мл/мин, в зависимости от системных давления измерения и увеличение потока крови в течение 2 мин до полного потока (4-6 мл/мин), увеличивая скорость насоса.
10. Под полный контроль, выполняют верхняя стернотомия, с помощью острых ножниц, начиная от рукоятка и собирается 5 мм в хвостовой направлении. Коагулировать края грудины немедленно, чтобы избежать кровотечения. Разоблачить аорты, потянув правой сонной артерии в направлении черепной.
11. Для оптимального управления, окружности бесплатно аорты из вилочковой железы и окружающих тканей для облегчения зажима. Место 8-0 шелковые петли вокруг восходящей части аорты. Чтобы поставить крест зажим для Кардиоплегия, тянуть шелковые петли в черепной направлении лучше выставить восходящей части аорты.

4. Искусственного кровообращения и анализ газа крови

1. для анализа газов крови (BGA), использовать стеклянные капиллярные трубки для сбора 60-90 мкл артериальной крови через катетер бедренной артерии.
   1. Использовать струбциной маленький на Силиконовая трубка и отсоедините трубку от катетера. Сбросьте давление медленно на зажим, чтобы разрешить контролируемое заполнение капиллярной трубки.
   2. Прикрепить силиконовые трубки катетера. Вставьте капиллярной трубки в крови газоанализатор для измерения в следующее время:
      10 мин после начала КПБ с вентиляцией (BGA1)
      после 25 мин КПБ и 15 минут дыхания (BGA2)
      после 40 мин КПБ и 30 минут остановка дыхания (BGA3)
      после 55 мин КПБ, 45 мин респираторных и 20 мин остановки сердца (BGA4)
2. под стабильным потоком КПБ, инициатива TE дыхания, остановив вентиляции.
3. После окончания вентиляции, установите потепление площадку до 28 ° c и начать местно охлаждения животного до 28 ° c температуры тела в течение первых 20 минут дыхания с помощью Марли, смоченной в холодной соленой.
4. После достижения температуры тела 28 ºС и после всего 30 минут остановка дыхания, администрировать 0,3 мл раствора KCl 7,45% в контуре КПБ инициировать Кардиоплегия.
5. Для крест пережатие аорты, потяните ранее размещенных шелковые петли (шаг 3.10) в черепной направлении для лучшего воздействия и поместите зажим микро serrefine на восходящей части аорты.
6. Выполнить в общей сложности 60 мин остановка дыхания и сердца 30 мин. Выньте зажим микро serrefine из восходящей части аорты инициировать реперфузии сердца. Одновременно, повторно проветривать и теплые животных до 37 ° C.
7. После завершения реперфузии и животное достиг normothermia, прекратить КПБ, отключив насос и продолжать следить за физиологических измерений (например температуры тела, ЭКГ и инвазивных артериальное давление) 20 мин
8. В конце эксперимента, exsanguinate животное под полным наркозом (5% изофлюрановая) и собирать кровь и органы для дальнейшего анализа ¹⁴.

Результаты

Этот протокол описывает перфузии цепи, хирургических процедур и мониторинга физиологических параметров во время КПБ мыши. При исполнении адекватно квалифицированных микрохирург, последовательно и можно воспроизвести результаты.

Дл?...

Обсуждение

Мы разработали полностью функционирующей клинически значимых модель КПБ в мыши. С более чем тридцатью штаммов мышей, имеющих сердечно-сосудистые заболевания наша модель может быть отправной точкой для разработки новых перспективных протоколов, связанных с КПБ. Кроме того из-за множес...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sterofundin	B.Braun Petzold GmbH	PZN:8609189	priming volume, 1:1 with Tetraspan
Tetraspan 6% HES Solution	B. Braun Melsungen AG	PZN: 05565416	priming volume, 1:1 with Sterofundin
Heparin Natrium 25.000	Ratiopharm GmbH	PZN: 3029843	2.5 IU per ml of priming solution
NaHCO3 8,4% Solution	B. Braun Melsungen AG	PZN: 1579775	3% in priming solution
KCL 7.45 % Solution	B. Braun Melsungen AG	PZN: 2418577	0.1 mL for cardioplegia
Carprofen	Zoetis Inc., USA	PZN:00289615 08859153	5 mg/kg/BW
1 Fr PU Catheter	Instechlabs INC., USA	C10PU-MCA1301	carotid artery
2 Fr PU Catheter	Instechlabs INC., USA	C20PU-MJV1302	jugular vein
Vasofix Safety catheter 20G	B.Braun Medical	4268113S-01	orotracheal intubation
8-0 Silk suture braided	Ashaway Line & Twine Mfg. Co., USA	75290	ligature
Isoflurane	Piramal Critical Care Deutschland GmbH	PZN:9714675	narcosis
CLINITUBES blood capillaries	Radiomed GmbH	51750132	blood sampling 60 - 95 microliter
Spring Scissors - 6mm Blades	Fine Science Tools GmbH	15020-15	instruments
Spring Scissors - 2mm Blades	Fine Science Tools GmbH	15000-03	instruments
Halsted-Mosquito Hemostat	Fine Science Tools GmbH	13009-12	instruments
Dumont #55 Forceps	Fine Science Tools GmbH	11295-51	instruments
Castroviejo Micro Needle Holder - 9cm	Fine Science Tools GmbH	12060-02	instruments
Micro Serrefines	Fine Science Tools GmbH	18555-01	instruments
Bulldog Serrefine	Fine Science Tools GmbH	18050-28	instruments
MiniVent Ventilator for Mice (Model 845)	Harvard Apparatus	73-0044	mechanical ventilation
Isoflurane Vaporizer Drager 19.1	Drägerwerk AG & Co. KGaA		anesthesia 1.3 - 2.5%
PowerLab data acquisition device 4/35	ADInstruments Ltd, New Zealand	PL3504	invasive pressure, ECG, temperature
ABL 800 Flex	Radiometer GmbH		blood gas analysis
NMRI mice	Charles River Laboratories	Crl:NMRI(Han)	male, 30 - 35 g, 12 weeks old, housed at least 1 week before the experiment