לב-ריאה במודל של עכברים: גישה מוזרה

Summary

מאמר זה מתאר כיצד לבצע ריאה בעכברים. מודל חדש זה יקל על החקירה של המנגנון המולקולרי מעורבת ועוגב נזק.

Abstract

כפי ממושך לב-ריאה הופכת לחיונית יותר במהלך התערבויות הלב, קליניים לדרישה גוברת מתעוררת עבור תהליך אופטימיזציה, למזער נזק לאיבר וכתוצאה מכך מהמחזור extracorporal ממושך. מטרת מאמר זה היה להפגין מודל מתפקדת במלואה, הרלוונטית קלינית של ריאה של עכבר. אנחנו מדווחים על עיצוב המכשיר, אופטימיזציה מעגל זלוף, בטכניקה מיקרוכירורגית. מודל זה הוא מודל חריפה, אשר אינו תואם עם הישרדות בצורך לציורים דם מרובים. בגלל המגוון של כלים זמינים עבור עכברים (למשל, סמנים, הסתרה, וכו '), מודל זה יקל על חקירת המנגנון המולקולרי של נזק לאיברים ואת השפעת לב-ריאה ביחס לשני מחלות רקע.

Introduction

מאז כניסתה של לב-ריאה (משטרת שיקאגו) לתוך המרפאה, ומילא תפקיד חיוני כירורגיית¹. בניתוח לב מודרני, זמן ממושך משטרת שיקאגו חיוני לבצע שחזורים נרחבים אבי העורקים ונהלים משולב. למרות ההתקדמות הטכנולוגית היה עצום, השימוש של מחזור extracorporal מקושרת עם אינטרה -, לאחר הניתוח מערכתית, איברים המקומי נזק^2,3.

מודלים בעלי חיים גדולים פותחו כדי לחקור את התפקיד של משטרת שיקאגו על תהליכים פיזיולוגיים^4,5. אף על פי מודלים אלה סיפקו תובנות חלק משטרת שיקאגו הקשורים סיבוכים, הם מאוד יקרים, כלים (למשל, נוגדנים) מוגבלים מאוד. חלופה חסכוני יותר פותחה בחיות קטנות. מאז הפיתוח שלהם, נערכו מחקרים רבים כדי למטב דגם משטרת שיקאגו חולדות וארנבות,^5,6,7,8,9. מודלים אלה מספקים בסיס טוב עבור מדידות של תהליכי מחלה pathophysiological; עם זאת, הם עדיין לא מספיק לחקור אימונולוגיה תאית, ההורמונאלית בשל היעדר נוגדנים הרלוונטיים, ריאגנטים. זה מחליש את תפקידם בתחום זה של מחקר.

לאחרונה פיתחנו מודל העכבר של משטרת שיקאגו. בשל מגוון רחב של ריאגנטים ספציפיים העכבר ועכברים מהונדסים גנטית, העכבר מודלים הם באופן כללי המודל של בחירה עבור מחקר פיזיולוגי, מולקולרית, אימונולוגי^10,11. לפיכך, המודל שלנו יקל המחקר של משטרת שיקאגו ביחס מחלות רקע שונות כמו ישנם זנים עכברים זמין עם מחלות רלוונטיות קלינית^12,13. בהתאם לכך, מאמר זה מתאר, בפירוט כיצד לבצע משטרת שיקאגו בעכברים. חמצן ופרמטרים והמודינמיקה בפיקוח צמוד לאחר מעצר עמוק בדרכי הנשימה, מחזור הדם.

Protocol

כל הניסויים בוצעו בדרישות החוק להגנת בעלי חיים גרמנית (TierSchG), אושרו על ידי ועדת רווחת בעלי חיים מקומיים (התחתון סקסוניה המדינה משרד הגנת הצרכן ובטיחות מזון, פרוטוקול TSA 14/1556). משקל מינימלי של העכבר מתאים מודל זה הוא 25 ג

1. הכנות ממושכות

הערה: כל הפרוצדורות מתבצעות בתנאים נקי, שאינו סטרילי, עם מכשירים בלוק.

1. במקום 50-60 ס מ 8 ארוך פרופילן סיבים במקביל צינור חלול והתחבר עם מתאם T משני הצדדים. למלא את החלל בין הסיבים חלול הענף החיצוני של T-המתאם עם דבק.
   1. אפשר לפחות 24 h עבור הדבק להקשיח. תעצור את צינור סיליקון אל אתרי חיבור גזורה הסיבים חלול המשתרעת החוצה המתאם-T באמצעות מיקרוטום סטנדרטי של.
2. להכניס מחט מתכת 27 G (מתוך branule 26 גרם) בצינורית פוליאוריתן 2 Fr. להשתמש בלהב כירורגי ולחזור מיקרו-מספריים תחת מיקרוסקופ (8-12 X הגדלה) כדי להפוך שלושה או ארבעה fenestrations של 0.15 סנטימטר כל בתוך השליש הדיסטלי של הצינורית כדי להבטיח אופטימלית ורידים זרימה.
   1. הסר הסמויה כאשר הושלמה. השתמש ספוגיות כותנה עמום, הכחשה של מבנים. להשתמש גזה מטליות (5 x 5 ס מ ²) כדי לספוג את עודפי הנוזלים כדי למנוע התייבשות רקמות.
3. להכין את העוצמה לקרקע. להשלמת, להוסיף 30 IU של הפארין לכל mL הטרמה v פתרון ו- 2.5% / v של פתרון 8.4% של NaHCO ₃ לאכסון. לאחסן את הפתרון הזה ב 4 ° C עד בשימוש.
4. למלא את המעגל משטרת שיקאגו (קרי, משאבה, אוויר הצייד, צנור וקנולות שני) עם פתרון לקרקע µL 850 דרך בצינורית וורידית. מילא פעם אחת, לשמור את משטרת שיקאגו מחזורי עד החיה יהיה מוכן עבור תעלות.

2. הרדמה בעלי חיים

1. כדי לנהל הרדמה, למקם את החיה תא אינדוקציה מתחת לגיל 2.5% v/v איזופלוריין/חמצן תערובת. לאשר הרדמה. ראויה על-ידי הערכת רפלקס הנסיגה פדלים הזנב קמצוץ רפלקס, רפלקס מצמוץ העין. החלת משחה בעין וטרינריים כדי למנוע יובש בעין.
2. במקום החיה על כרית חימום עם תפקוד וויסות טמפרטורה. למדוד את חום הגוף עם מכשיר בדיקה רקטאלית ושדלת מחוברים למערכת רכישת נתונים.
3. אחרי הרדמה מלאה מושגת, להנשים את orotracheally בעלי חיים באמצעות braunule פלסטיק של 20 גרם, הוספתו אורלית, דוחפים אותו לתוך קנה הנשימה תחת שליטה ויזואלית. התחל אוורור מכני באמצעות מכשיר אידוי של איזופלוריין מחובר העכבר מחובר. למכונת הנשמה. תלוי במשקל בעלי חיים, להתאים האיוורור כך מושגת בנפח של 250-350 µL.
4. כדי להבטיח מלאה שיכוך כאבים, להזריק 5 מ"ג/ק"ג משקל גוף בעלי החיים carprofen subcutaneously. מומלץ כי ריכוז איזופלוריין להישמר בין 1.3-2.5% חמצן. ריכוז איזופלוריין עשוי להיות מותאם באופן ידני בהתאם השלב של ההליך-

3. ניתוחים

1. לאחר צנרור והרדמה מלאה מושגת, לבצע חתך בעור קו האמצע בצוואר עם מספריים חדות בסדר להפריד בין השרירים בצורה בוטה, לחשוף את ומוחלף הנכון ואת העורק השמאלי. במהלך ההכנה, מצב של קרישת כלי שיט קטנים באמצעות של coagulator וטרינרי מחובר מלקחיים דו-קוטבי כדי להבטיח אובדן דם מזערית חסר.
2. לאחר הכנה של כלי צוואר, cranially מאתרים ומפסיקים החלק הדיסטלי של העורק תרדמני נפוצות השמאלי כדי שלו נגע הסתעפות בעזרת תפרים משי 8-0-
3. התחבר במהירות קשר לסוף דיסטלי בצינורית 27 G אל הצנרת תזרים העורקים באמצעות מחבר סיליקון (0.5 מ מ ID, 1 מ מ OD), מקום 8-0 בתפר משי להחליק על המקטע proximal של העורק, וכן הוספה קצה הצינורית לתוך העורק הראשי.
4. לאחר מיקום נכון של קצה הצינורית, לקדם את הטיפ בצינורית כך זה מטילה 3-4 מ"מ הציר הקרוב עד לקשת אבי העורקים. לתקן את הטיפ בצינורית נאבטח עם קשרים משי 8-0-
5. באמצעות השתלה מלקחיים ומספריים, לבצע ניתוח בוטה וחד, לחשוף ומוחלף על נכון על ידי הכנה בוטה של רוחבית לרקמת שריר שריר הצוואר, ליד עצם הבריח, ומניחים קשר ממשי של 8-0 בבית בקצה הדיסטלי של 8-0 לולאה בקצה הפרוקסימלית.
6. לאחר מצדו של סוף דיסטלי של ומוחלף על, המקום קצה בצינורית וורידית ומוחלף נכון, התקדמות לקראת אטריום ימין ומאובטח באמצעות הקשר משי. על החזר ורידי אופטימלית, ייתכן צורך לקדם את הטיפ ורידים לתוך החדר הימני.
7. פעם המיקום הנכון בצינורית מושגת, לבצע heparinization מערכתית על-ידי הוספת 2.5 IU של הפארין לגרם של bodyweight בבעלי חיים באמצעות הזרקה תוך ורידי ישירה לתוך ומוחלף על.
8. לניטור לחץ פולשנית בזמן אמת, נקרר עורק הירך השמאלית. לחשוף את אזור המפשעה ולהפריד בעדינות עורק הירך משותפת מן הירך ווריד הירך עצב תחת הגדלה X 25.
   1. Ligate החלק הדיסטלי של עורק הירך. באופן זמני occlude החלק צינתור עם תגית-קשר, עושים חתך קטן בדופן הקדמי באמצעות מיקרו-מלקחיים.
   2. לאחר מכן, הכנס Fr 1 פוליאוריתן בצינורית לתוך עורק הירך ואבטח אותו עם משי 10-0 בתפר. בצינורית זה משמש כדי לחלץ דוגמיות דם עבור בדיקות גזים בדם.
9. לאחר השמה מוצלחת של קנולות ובורידים, ליזום ריאה על-ידי הפעלת המשאבה. הזמן של צנרור ההתחלתי של משטרת שיקאגו הוא כ 45 דקות התחל באמצעות קצב זרימה של 0.5 mL/min, בהתאם ללחץ מערכתי מדידות להגביר זרימת הדם בתוך 2 דקות לזרימה מלאה (4-6 mL/min) על ידי הגדלת המהירות משאבת.
10. תחת פיקוח מלא, לבצע sternotomy העליון באמצעות מספריים חדות החל מ. המנובריום והולכים 5 מ מ בכיוון סימטרית. מצב של קרישת חסר את הקצוות בחזה ובצלעות מיד כדי למנוע דימום. לחשוף את קשת אבי העורקים על ידי משיכת עורק התרדמה הימני לכיוון הגולגולת.
11. בקרה אופטימלית, circumferentially בחינם את קשת אבי העורקים התימוס, הרקמה הסובבת כדי להקל על מחבר חובק למעקה. מקום 8-0 משי סיבובים סביב אבי העורקים. כדי למקם את המלחציים צלב על הלב, משוך הלולאה משי בכיוון הגולגולת כדי לחשוף יותר של אבי העורקים.

4. לב-ריאה וניתוח גז דם

1. עבור בדיקות גזים בדם (הבי), השתמש זכוכית צינורות קפילר לאסוף דם עורקי µL 60-90 דרך הצנתר בעורק הירך.
   1. להשתמש במלחצת קטנים לאורך צינור סיליקון ולנתק את הצנרור של הקטטר. שחרור הלחץ לאט על המלחציים כדי לאפשר מילוי מבוקרת צינור קפילרי.
   2. לחבר צינור סיליקון כדי הצנתר. להכניס צינורות קפילר במנתח גז דם למדידות בנקודות זמן הבאים:
      10 דקות לאחר החניכה של משטרת שיקאגו עם אוורור (BGA1)
      לאחר 25 דקות של משטרת שיקאגו, 15 דקות של דום נשימה (BGA2)
      לאחר 40 דקות של משטרת שיקאגו, 30 דקות של דום נשימה (BGA3)
      לאחר 55 דקות של משטרת שיקאגו, 45 דקות של נשימה ו- 20 דקות של דום (BGA4)
2. תחת זרם יציב משטרת שיקאגו, הקפד טה דום נשימה שעצרתם את האוורור.
3. לאחר סיום של אוורור, משטח התחממות כדור הארץ מוגדר 28 ºC ולהתחיל את הגארדיאן קירור החיה לטמפרטורת הגוף ºC 28 במרחק 20 דקות הראשונות של דום נשימה באמצעות גזה ספוגה תמיסת מלח קר.
4. ברגע טמפרטורת גוף של 28 ºC מושגת, ואחרי סך של 30 דקות של דום נשימה, לנהל mL 0.3 של 7.45% אשלגן כלורי פתרון לתוך המעגל משטרת שיקאגו ליזום הלב.
5. עבור לחצות מחבר חובק למעקה של אבי העורקים, משוך את הלולאה משי הקודם שמוקם (שלב 3.10) בכיוון הגולגולת של חשיפה טובה יותר, במקום מלחציים מיקרו-serrefine על החלק העולה של אבי העורקים.
6. לבצע סך של דום נשימה 60 דקות ו- 30 דקות של דום. הסר את המלחציים מיקרו-serrefine אבי העורקים ליזום פגיעה reperfusion של הלב. בו זמנית, מחדש לאוורר וחם החיה אל 37 מעלות צלזיוס.
7. לאחר פגיעה reperfusion הושלמה, החיה הגיעה normothermia, לסיים את משטרת שיקאגו על-ידי כיבוי המשאבה ולהמשיך לעקוב אחר מדידות פיזיולוגיות (למשל חום הגוף, אק ג, לחץ דם פולשנית) במשך 20 דקות
8. בסוף הניסוי, תדמם החיה בהרדמה מלאה (5% איזופלוריין) ולאסוף דם ואיברים נוספים ניתוח ¹⁴.

תוצאות

פרוטוקול זה מתאר את מעגל זלוף, ניתוחים, וניטור של פרמטרים פיזיולוגיים במהלך משטרת שיקאגו של עכבר. כאשר מבוצעת על ידי microsurgeon מיומן בצורה הולמת, התוצאות בעקביות ובאופן reproducibly מתקבלים.

כדי לשמור על רקמות נאותה זלוף, הלחץ בעורקים רשע נשמרת תמ?...

Discussion

. פיתחנו תפקוד מלא הרלוונטית קלינית מודל של משטרת שיקאגו בעכבר... עם יותר משלושים זני עכברים שיש מחלות לב וכלי דם, המודל שלנו יכול להיות נקודת התחלה לפיתוח פרוטוקולים פוטנציאליים חדשים הקשורים משטרת שיקאגו. יתר על כן, בשל שפע של ריאגנטים ספציפיים העכבר ועכברים נוק-אאוט, מודל זה רק לא נחליף א?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sterofundin	B.Braun Petzold GmbH	PZN:8609189	priming volume, 1:1 with Tetraspan
Tetraspan 6% HES Solution	B. Braun Melsungen AG	PZN: 05565416	priming volume, 1:1 with Sterofundin
Heparin Natrium 25.000	Ratiopharm GmbH	PZN: 3029843	2.5 IU per ml of priming solution
NaHCO3 8,4% Solution	B. Braun Melsungen AG	PZN: 1579775	3% in priming solution
KCL 7.45 % Solution	B. Braun Melsungen AG	PZN: 2418577	0.1 mL for cardioplegia
Carprofen	Zoetis Inc., USA	PZN:00289615 08859153	5 mg/kg/BW
1 Fr PU Catheter	Instechlabs INC., USA	C10PU-MCA1301	carotid artery
2 Fr PU Catheter	Instechlabs INC., USA	C20PU-MJV1302	jugular vein
Vasofix Safety catheter 20G	B.Braun Medical	4268113S-01	orotracheal intubation
8-0 Silk suture braided	Ashaway Line & Twine Mfg. Co., USA	75290	ligature
Isoflurane	Piramal Critical Care Deutschland GmbH	PZN:9714675	narcosis
CLINITUBES blood capillaries	Radiomed GmbH	51750132	blood sampling 60 - 95 microliter
Spring Scissors - 6mm Blades	Fine Science Tools GmbH	15020-15	instruments
Spring Scissors - 2mm Blades	Fine Science Tools GmbH	15000-03	instruments
Halsted-Mosquito Hemostat	Fine Science Tools GmbH	13009-12	instruments
Dumont #55 Forceps	Fine Science Tools GmbH	11295-51	instruments
Castroviejo Micro Needle Holder - 9cm	Fine Science Tools GmbH	12060-02	instruments
Micro Serrefines	Fine Science Tools GmbH	18555-01	instruments
Bulldog Serrefine	Fine Science Tools GmbH	18050-28	instruments
MiniVent Ventilator for Mice (Model 845)	Harvard Apparatus	73-0044	mechanical ventilation
Isoflurane Vaporizer Drager 19.1	Drägerwerk AG & Co. KGaA		anesthesia 1.3 - 2.5%
PowerLab data acquisition device 4/35	ADInstruments Ltd, New Zealand	PL3504	invasive pressure, ECG, temperature
ABL 800 Flex	Radiometer GmbH		blood gas analysis
NMRI mice	Charles River Laboratories	Crl:NMRI(Han)	male, 30 - 35 g, 12 weeks old, housed at least 1 week before the experiment