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摘要

我们已经描述了一个协议, 执行部分肝切除 (phx-空港) 和细胞移植通过脾脏点头。(点头。CB17-Prkdc有缺陷的/J) 鼠标。在本议定书中, 切口是为了揭露和切除肝脏的左叶, 其次是另一个切口的脾移植细胞。

摘要

部分肝切除术是研究肝再生和细胞基础疗法在各种病理条件下的作用的一种多功能和可再生的方法。部分肝切除也促进移植细胞的植入和增殖, 加速新生血管和细胞向肝脏迁移。在这里, 我们描述了一个简单的协议, 执行30% 肝切除和移植细胞在脾脏的非肥胖糖尿病/严重联合 immunodeficient 点头。(点头。CB17Prkdc的/J) 鼠标。

在这个过程中, 做了两个小切口。第一切口是暴露和切除肝脏的左叶, 另一小切口被做暴露脾脏为脾移植细胞。这个程序不需要任何专门的外科手术技能, 它可以在5-7 分钟内完成, 减轻压力和疼痛, 更快的恢复, 更好的生存。我们已经展示了从绿色荧光蛋白 (gfp) 中分离出的肝细胞移植, 表达小鼠 (转基因 C57BL/6-Tg (不列颠哥伦比亚) 30 scha/J), 以及人源性肝细胞 (NeoHep) 在部分 hepatectomized 点头。老鼠。

引言

目前, 肝细胞移植是一种替代全器官移植治疗严重肝病患者。据信, 它可以把病人移植到全身器官,1。除了同种异体肝细胞2外, 异体肝细胞3和干细胞 (4 ) 的肝细胞也正在动物模型中进行研究。在这一背景下, 受体移植细胞的归巢和植入电位是急性肝功能衰竭 (AHF) 细胞治疗的重要标准。

为研究肝细胞或肝样细胞的移植5, AHF 是由手术的6或药理7程序在动物模型中创建的, 其次是移植细胞。通过药理试剂制作 AHF 动物模型, 许多 hepatotoxins 如 d-乳糖8、乙酰氨基酚9、四氯化碳10、硫乙酰胺11、刀豆蛋白 12、脂多糖13已使用、等。从这个列表中, 每个试剂为 AHF 生成一组独特的功能, 但不幸的是, 没有单一试剂模仿人类 AHF。此外, hepatotoxins 诱发的 AHF 时间长, 使动物处于慢性应激状态, 难以获得重现性结果。

另一方面, 部分肝切除术 (phx-空港) 的手术方法是技能依赖性的, 在培养所需技能后, 可重现性结果容易获得。仅以手术干预诱发 AHF, 需要切除超过70% 的肝脏;然而, 70% 的肝切除术仍可用于研究肝脏移植细胞的植入和增殖, 以分析其在肝损伤期间的治疗能力14。肝细胞移植术后经腹膜切除后, 经腹腔15、尾静脉16、肝静脉17或脾18。目前, 肝静脉输液和肝细胞脾移植是首选的程序, 因为它们更容易繁殖。

在本文中, 我们已经描述了30% 部分肝切除在点头的程序。(点头。CB17-Prkdcscid/J) 肝左叶切除的小鼠。其次是移植 20万 GFP 表达小鼠 (C57BL/6-Tg (不列颠哥伦比亚) 30 scha/J) 肝细胞以及人类起源 NeoHep19在脾脏。这个过程导致肝脏移植细胞的植入。这个程序是最不具侵入性和轻微疼痛的技术。

研究方案

本议定书所载程序已由新德里国家免疫学研究所机构动物伦理委员会批准。审批的串行参考编号为 IAEC#319/13.

注: 一般手术程序有很好的资源20和针对啮齿动物手术的特定协议21。对于那些第一次做动物外科手术的人来说, 建议在对动物进行手术前, 广泛地练习使用假的程序。

1. 准备

  1. 在试验之前, 保持无菌磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 或盐水准备好。
  2. 组装一个包括剪刀, 锯齿钳, 组织钳, 棉花, 棉花芽, 尼龙螺纹, 和不同的微型针持有人的手术套件。高压釜的手术套件。如果免疫受损的点头, 应特别小心。协议中包含了 "免疫" 鼠标。
  3. 执行完整的实验程序, 从准备到手术结束, 在生物安全类 I 型橱柜。
  4. 重点头。手术前6-8 周大鼠。在这项研究中使用了体重在14-18 克之间的老鼠。
  5. 用剪毛机刮上中央和有疑的腹部区域的小鼠。将脱毛膏均匀涂抹在整个区域, 用刮刀彻底除去修剪过的毛发。2-5 分钟后, 用一块湿不育棉轻轻地去除毛发。
  6. 将鼠标放在异氟醚腔内, 并解锁氧气缸的阀门。保持氧流的速率为4升/分和异氟醚汽化4% 诱导麻醉。
    1. 通过轻柔的脚趾捏, 确保鼠标被正确地麻醉。
  7. 在生物安全柜内放置一个手术板。把动物放在手术板上, 这样鼠标的腹部就会朝上, 老鼠的前部被放在与异氟醚和氧气供应相连的鼻锥内。
  8. 减少异氟醚汽化至 2%, 并保持整个手术过程。
  9. 对老鼠的皮肤进行消毒, 用70% 乙醇浸泡的无菌棉擦拭消毒。

2. 手术方法

  1. 部分肝切除术
    1. 在胸骨下方的皮肤上进行横向切口, 垂直于剑突过程, 并与胸腔平行, 在直操作剪刀的帮助下。
    2. 用镊子或无菌湿棉小贴士轻轻地将与腹部肌肉层相连的皮肤与皮肤和腹部肌肉层分开。用无菌棉花小贴士浸泡皮区, 避免脱水。
    3. 通过在剑突下方的腹膜层进行横切口, 使左叶的面积平滑。使用两个湿润的棉花小贴士来暴露和举起肝脏的左叶。
    4. 将棉花尖放在切口的腹部一侧, 再将另一条棉花尖放在隔膜侧。轻轻按下放置在隔膜上的尖端, 并给出一个滑动推的另一尖端, 以解除肝脏左叶。
    5. 通过在微钳或棉花小窍门的帮助下, 通过在左叶上滑动一条带环的尼龙线, 并将环滑向靠近脐部的左叶底部。轻轻地向下推尼龙线循环到底部的左叶。
    6. 用显微外科针架和微钳将尼龙线的两端系在左叶顶部。在另一侧增加两个结节。
    7. 用剪刀把绑的裂片解剖出来。不要试图切断非常接近线程。如果手术时间超过5分钟, 保持腹膜腔和器官湿润与无菌 PBS, 以避免因液体流失而脱水。
    8. 用4-0 线线缝合法缝合腹膜。随后, 通过不连续缝合, 尽快关闭皮肤。
  2. 细胞移植
    注: 根据李et(C57BL/6-Tg) 所描述的程序, 荧光蛋白表达肝细胞与转基因 gfp 小鼠 (30 Scha/J) 分离。22和沈et al。23与单核细胞 (24 ) 分化的人源肝样细胞 (NeoHep) 也用于移植。然而, 从任何其他来源获得的细胞也可以在议定书中使用。
    1. 在 Iscove 修饰 Dulbecco 的培养基 (IMDM) 的大约50µL 中悬浮20万个可行细胞, 并将其吸入1毫升胰岛素注射器, 30G 针。把注射器放在冰上, 把它放凉。
    2. 放置鼠标的方式, 左侧面部分朝上执行手术的人。确定脾区, 横向解剖周围的忧郁症地区的皮肤, 其次是通过腹膜层的短切口, 只是为了暴露脾脏。
    3. 轻轻抬起脾脏, 并在两个 PBS 湿棉花小贴士的帮助下, 把它放在腔外。
    4. 一只手用两根棉花尖小心翼翼地握住脾脏, 将注射器的针头精确地垂直于脾脏。轻轻刺穿脾脏, 将针慢慢地推入体内;针不应该比2毫米更深。
    5. 慢慢推下注射器的活塞, 将细胞注入脾脏。移植后, 保持注射器针稳定, 并从脾脏中慢慢取出, 以避免出血或细胞丢失。
    6. 用棉尖将脾脏放回腹膜腔后, 通过连续缝合4-0 条线缝合腹膜层。用同样的缝线缝合皮肤间断。避免使用伤口夹来闭合皮肤;相反, 用4-0 缝合线关闭它。伤口剪辑限制了鼠标的自然运动, 经常剪辑变得松散, 迅速出来。

3. 术后护理

  1. 关闭皮肤后, 使用无菌棉尖, 用碘溶液 (betadine) 擦拭缝合部位的周围环境。
  2. 注射一剂量抗生素头孢噻肟为600毫克/千克体重 (通常12毫克头孢噻肟100µL 生理盐水/小鼠) 腹腔使用1毫升注射器。
  3. 每日剂量止痛 Meloxicam 为1毫克/千克体重 (通常12µg Meloxicam 100 µL 生理盐水/小鼠) 到动物腹腔, 在手术后三天。
  4. 手术完成后, 停止异氟醚气体的流动, 把鼠标放回单独通风的笼子里。

4. Euthanization 和刻画

  1. 实验结束后 (1 天10天后手术), 弄死小鼠根据机构动物伦理准则。
  2. 收集血液由末期流血的动物, 刺穿眼球末端丛。
  3. 从血液中分离出血清。

结果

30% 部分肝切除术后肝细胞增殖:用免疫组化 (IHC) 染色 Ki-67 细胞增殖标记物, 观察30% 肝切除术后剩余肝脏中肝细胞的增殖。一天后肝切除, 小鼠被安乐死, 其余肝叶切除, 石蜡切片获得。切片染色的 Ki-67 抗体, 其次是标签与辣根过氧化物酶 (HRP) 共轭二级抗体。以二氨基联苯胺为基质, 用于开发褐色色素以识别染色细胞。细胞核被用苏木精染色, 并在20X 物镜下观察。图 1

讨论

部分肝切除术是一种研究肝再生的方法, 据报道过度肝切除是模拟 AHF 模型。在 AHF 动物模型中, 啮齿动物, 特别是小鼠, 是研究最多的模型。为了获得小鼠肝脏损伤模型, 多达70% 的肝切除已报告具有良好的存活率25,26。然而, 在裸和其他 immunodeficient 鼠, 70% 例肝切除被报告为致命, 动物死亡24小时内27。

米切尔和 Willenbr...

披露声明

作者没有什么可透露的。

致谢

这项工作得到了印度政府生物技术部向新德里国家免疫学研究所提供的核心赠款的支持。巴塔查尔吉博士目前的讲话是胃肠病学、肝病和营养科, 洛杉矶儿童医院。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
Gas Anesthesia SystemUgo Basile; Italy211000
Weighing machineGoldtech ; IndiaLocal Procurement
Biological safety cabinet ( Class I)Kartos international;  IndiaLocal Procurement
Hair TrimmerPanasonic ;  Japan ER-GY10 
Straight operating scissor with sharp /sharp bladesMajor Surgicals; IndiaLocal Procurement
Forceps with SerrationsMajor Surgicals; IndiaLocal Procurement
Micro needle holders  straight & curved Mercian ;  England BS-13-8
1 ml insulin syringe with 30G *5/16 needles Dispo Van; India
1 ml syringe with 26 G * 1/2 needleBD ; US REF 303060
Nylon Threads  Mighty ; India(1-0) Local Procurement
MERSUTURES 4-0 Sterilised Surgical Needled SutureEthicon, Johnson & Johnson, IndiaNW 5047
TRUGUT 76 cm 4-0 absorbable surgical sutureSutures India Pvt. Ltd; IndiaSN 5048Sterilised Surgical Needled Suture Catgut Chromic
Cotton BudsPure Swabs Pvt Ltd ;  IndiaLocal Procurement
Surgical Tape3M India ; India1530-1Micropore Surgical Tape
MicrotomeHisto-Line Laboratories, ItalyMRS3500
Shandon Cryotome E CryostatThermo Electron Corporation ; US
Confocal laser scanning microscopeCarl Zeiss ; Germany LSM 510 META
Bright Field MicroscopeOlympus, JapanLX51
Automated analyserTulip, Alto Santracruz, IndiaScreen Maaster 3000Biochemical analyser for liver functional test
Flow CytometerBD ; US BD FACSverseAssesment of presence of cells post transplantation
Veet hair removal cream Reckitt Benckiser , India
FORANEAbbott ; USisoflurane USP 99.9% 
TaximAlKem ; Indiacefotaxime sodium injection
Povidone-Iodine solution Win-Medicare;  IndiaBetadine
ParaformaldehydeHimedia; IndiaGRM 3660
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)Life technologies, Thermo Fisher scientific ; US12200-036
SucroseSigma ; USS0389
Tissue-TekSakura; US25608-930O.C.T compound
DAPIHimedia; IndiaMB 097
anti-Albumin goat PolyclonalThermo Scientific,Pierce, USPA126081
anti-connexin 32/GJB1 Polyclonalabcam, UKab64609-500
antiGFP rabbit polyclonal Santa Cruz biotechnology; USSC 8334
Alexa Fluor 594 donkey anti-goat Molecular Probes , Thermo Fisher Scientific ;  USA11058
Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep Molecular Probes , Thermo Fisher Scientific ;  USA11015
Alexa Fluor 594 chicken anti rabbit Molecular Probes , Thermo Fisher Scientific ;  USA21442
Goat anti rabbit IgG HRPInvitrogen, Thermo Fisher Scientific; US 65-6120
anti-Ki67 antibodyabcam, UKab15580
Antigen Unmasking Solution, Citric acid baseVector laboratories, USH-3300
ProLong Diamond antifade mountantLife technologies, Thermo Fisher scientific ; USP36966
SGOT (ASAT) KITCoral Clinical System, India
SGPT (ALAT) KITCoral Clinical System, India
Alkaline Phosphatase Kit (DEA)Coral Clinical System, India
Hematoxylin Solution, Mayer'sSigma ; USMHS16
Eosin Y solution, alcoholicSigma ; USHT110132
DPX Mountant Sigma ; US6522
Melonex (Pain Killer)Intas Pharmaceuticals Ltd; IndiaMeloxicam injection 
DAB enhanced liquid substrate system tetrahydrochlorideSigma ; USD3939

参考文献

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