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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Abbiamo descritto un protocollo per l'esecuzione di epatectomia parziale (PHx) e trapianto di cellule via della milza nel cenno del capo. SCID (CENNO DEL CAPO. CB17-Prkdcscid/j) topi. In questo protocollo, un'incisione è fatta per esporre e resecare il lobo sinistro del fegato seguito da un'altra incisione per il trapianto di cellule intrasplenic.

Abstract

Hepatectomy parziale è un metodo versatile e riproducibile per studiare la rigenerazione del fegato e l'effetto di terapeutica delle cellule basata in varie circostanze patologiche. Epatectomia parziale facilita anche la maggiore attecchimento e la proliferazione delle cellule trapiantate da neovascolarizzazione accelerante e migrazione delle cellule verso il fegato. Qui, descriviamo un semplice protocollo per eseguire 30% hepatectomy e trapianto di cellule nella milza di un diabetico non obeso/grave combinata NOD immunodeficienti. SCID (CENNO DEL CAPO. CB17-Prkdcscid/j) mouse.

In questa procedura, due piccole incisioni sono fatte. La prima incisione è quello di esporre e resecare il lobo sinistro del fegato, e un'altra piccola incisione è fatta per esporre la milza per il trapianto di cellule intrasplenic. Questa procedura non richiede alcuna abilità chirurgiche specializzate, e può essere completato in 5-7 minuti con meno stress e dolore, recupero più veloce e migliore sopravvivenza. Abbiamo dimostrato il trapianto di epatociti isolati da una proteina fluorescente verde (GFP) esprimendo mouse (transgenici C57BL/6-Tg (UBC-GFP) 30Scha/J), come pure dell'epatocita come cellule di origine umana (NeoHep) in parzialmente epatectomizzati NOD. Topi SCID.

Introduzione

Attualmente, il trapianto dell'epatocita è proposto come alternativa al trapianto d'organo intero per trattare i pazienti con gravi disturbi del fegato. Si ritiene che esso possa colmare pazienti per trapianto di organo intero1. Oltre il trapianto allogenico epatociti2, epatociti xenogenica3 ed epatociti derivati da cellule staminali4 sono anche indagati in modelli animali. In questo contesto, l'homing e attecchimento potenziale delle cellule trapiantate nel destinatario è un criterio importante per la terapia cellulare basata nell'insufficienza epatica acuta (AHF).

Per indagare il trapianto di epatociti o dell'epatocita-come le cellule5, AHF viene creato in un modello animale da chirurgica6 o farmacologici7 procedure, seguite da trapianto di cellule. Per rendere un modello animale di AHF di reagenti farmacologici, molti epatotossine come d-galattosamina8, acetaminofene9, tetracloruro di carbonio10, thioacetamide11, concanavalina A12, Lipopolisaccaride13 , ecc., sono stati utilizzati. Da questa lista, ogni reagente genera un insieme unico di funzionalità per AHF, ma purtroppo nessun singolo reagente imita gli AHF umano. Inoltre, gli AHF indotto da epatotossine richiede molto tempo, che mette gli animali in condizioni di stress cronico, e risultati riproducibili sono difficili da ottenere.

D'altra parte, l'intervento chirurgico di epatectomia parziale (PHx) è dipendente di abilità e risultati riproducibili sono facili da ottenere dopo lo sviluppo di competenze richieste. Per indurre AHF tramite intervento chirurgico da solo, la resezione di più del 70% del fegato è richiesta; Tuttavia, meno di un'epatectomia 70% ancora possa essere utilizzata per studiare l'attecchimento e la proliferazione di trapiantate cellule nel fegato per analizzare le loro capacità terapeutiche durante i danni al fegato14. Il trapianto di epatociti sono stati eseguiti post epatectomia attraverso il peritoneo15, coda vena16, vena epatica17o la milza18. Attualmente, infusione della vena epatica e intrasplenic trapianto di epatociti sono le procedure di comodo, come sono più facili da riprodurre.

In questo articolo, abbiamo descritto una procedura per una 30% di epatectomia parziale in NOD. SCID (CENNO DEL CAPO. CB17-Prkdcscid/J) topi in cui viene asportato il lobo sinistro del fegato. È seguito da trapianto di epatociti di mouse (C57BL/6-Tg (UBC-GFP) 30Scha/J) che esprimono GFP 0,2 milioni nonché di origine umana NeoHep19 nella milza. Questa procedura conduce all'attecchimento delle cellule trapiantate nel fegato. Questa procedura è meno invasiva e una tecnica minimamente dolorosa.

Protocollo

Le procedure presentate in questo protocollo sono state approvate dal comitato di etica animale istituzionale dell'Istituto nazionale di immunologia, Nuova Delhi. Il numero di riferimento seriale dell'approvazione è IAEC n. 319/13.

Nota: Ci sono ottime risorse su procedure di chirurgia generale20 e protocolli specifici per la chirurgia del roditore21. Per quelli che fanno chirurgia animale per la prima volta, è consigliabile per ampiamente pratica procedure chirurgiche su manichini prima di operare sugli animali.

1. preparazione

  1. Prima dell'esperimento, mantenere la soluzione salina sterile tamponata al fosfato (PBS) o salino pronto.
  2. Assemblare un kit chirurgico contenente forbici, forcipe dentato, pinze, cotone, cotton fioc, fili di nylon e porta aghi micro differenti. Sterilizzare in autoclave il kit chirurgico. Dovrebbe prestare particolare attenzione se un cenno di immuno-compromessi. Mouse di SCID è incluso nel protocollo.
  3. Eseguire la procedura sperimentale completa, dalla preparazione alla conclusione della chirurgia, della bio-sicurezza classe gabinetto.
  4. Pesare un cenno del capo. Mouse di SCID di 6-8 settimane prima dell'intervento. In questo studio vengono utilizzati topi pesano fra 14-18 g.
  5. Radere la regione centrale e ipocondriaca addominale superiore del mouse con il tagliacapelli. Applicare la crema in modo uniforme in tutta la regione di epilazione con una spatola per rimuovere completamente i peli tagliati. Rimuovere i peli delicatamente con l'aiuto di un pezzo di cotone sterile bagnato dopo 2-5 min.
  6. Posizionare il mouse nella camera di isoflurano e sbloccare la valvola della bombola di ossigeno. Mantenere il flusso di ossigeno al ritmo di 4 L/min e la vaporizzazione di isoflurane al 4% per indurre l'anestesia.
    1. Assicurarsi che il mouse è stato anestetizzato correttamente pizzicando punta delicata.
  7. Collocare una tavola di chirurgia all'interno di una biosicurezza armadio. Metti l'animale sul Consiglio di chirurgia, tale che la porzione ventrale del mouse è rivolto verso l'alto e la parte anteriore del mouse è posizionata all'interno del cono di naso collegato all'alimentazione isoflurano e ossigeno.
  8. Ridurre la vaporizzazione di isoflurane al 2% e mantenerla durante tutta la procedura chirurgica.
  9. Disinfettare la pelle del mouse e sterilizzarlo strofinando con cotone sterile imbevuto di etanolo al 70%.

2. intervento chirurgico

  1. Epatectomia parziale
    1. Fare un'incisione trasversale di circa 1 cm nella pelle appena sotto il sterno, perpendicolare al processo xifoideo e parallelamente la gabbia toracica, con l'aiuto di Forbici rette operative.
    2. Separare delicatamente la pelle attaccata con lo strato del muscolo addominale in prossimità della zona incisa con forcipe o punte sterili di cotone inumidito di distinguere tra pelle e strato del muscolo addominale. Godetevi la regione intradermica con PBS usando suggerimenti di cotone sterile per evitare il disseccamento.
    3. Esporre l'area del lobo sinistro senza problemi facendo un'incisione trasversale attraverso lo strato peritoneale appena sotto al xifoideo. Utilizza due punte di cotone inumidito per esporre e sollevare il lobo sinistro del fegato.
    4. Inserire una punta di cotone sul lato addominale del taglio e inserire un'altra punta di cotone sul lato del diaframma. Delicatamente premere la punta posizionata verso il diaframma e dare una Spinta scorrevole dall'altra punta per sollevare il lobo sinistro del fegato.
    5. Infilare un filo di nylon con un ciclo attraverso il lobo sinistro sollevato, quindi il ciclo verso la base del lobo di sinistra vicino al hilum con l'aiuto delle punte micro-forcipe o cotone. Spingere delicatamente verso il basso il loop di filo di nylon alla base del lobo di sinistra.
    6. Legare due estremità del filo di nylon nella parte superiore del lobo di sinistra usando il forcipe micro e un porta-aghi microchirurgia. Fare due nodi aggiuntivi sul lato opposto.
    7. Sezionare il lobo legato con l'aiuto di forbici. Non tentare di tagliare molto vicino il thread. Nel caso in cui la procedura dura più di 5 min, mantenere la cavità peritoneale e organi umido con PBS sterile per evitare disidratazione a causa della perdita di liquidi.
    8. Cucire il peritoneo di sutura continua utilizzando una sutura in Catgut 4-0. Successivamente, chiudere la pelle suturando discontinuo nel minor tempo possibile.
  2. Trapianto di cellule
    Nota: Gli epatociti che esprimono GFP sono stati isolati da topi transgenici GFP (C57BL/6-Tg (UBC-GFP) 30 Scha/J), secondo la procedura descritta da Lee et al. 22 e Shen et al. 23 hepatocyte-come le cellule (NeoHep) di origine umana differenziati dai monociti24 sono state utilizzate anche per il trapianto. Tuttavia, le cellule derivate da altre fonti possono essere utilizzate anche nel protocollo.
    1. Sospendere 0,2 milioni cellule vitali in circa 50 µ l di per volta Dulbecco di Iscove Medium (IMDM) e aspirare in una siringa da insulina 1 mL con ago 30g. Tenere la siringa freddo mettendo sul ghiaccio.
    2. Posizionare il mouse in modo che la parte laterale sinistra rivolto verso l'alto verso la persona che effettua l'intervento chirurgico. Identificare l'area splenica e sezionare trasversalmente la pelle vicino alla regione ipocondriaca, seguita da una breve incisione attraverso lo strato peritoneale solo per esporre la milza.
    3. La milza di sollevare delicatamente e tenere di fuori della cavità con l'aiuto di due PBS inumidito punte in cotone.
    4. Tenere la milza attentamente con due punte in cotone in una mano e inserire l'ago della siringa esattamente verticale alla milza. Delicatamente bucare la milza e spingere l'ago molto lentamente all'interno; l'ago non dovrebbe ottenere più profondo di 2 mm.
    5. Abbassare lentamente il pistone della siringa per iniettare le cellule della milza. Dopo il trapianto, mantenere stabile l'ago della siringa e rimuoverlo lentamente dalla milza per evitare sanguinamenti o perdita di cellule.
    6. Dopo aver posizionato la milza indietro nella cavità peritoneale con le punte di cotone, chiudere il livello peritoneale suturando continuo con una sutura in Catgut 4-0. Cucire la pelle in maniera discontinua con la sutura stessa. Evitare l'uso di ferita clip per la chiusura della pelle; invece, chiuderlo facendo una sutura 4-0. Le clip di ferita limitano il naturale movimento del mouse, e spesso clip si allentano e uscire rapidamente.

3. post-operatorio

  1. Dopo aver chiuso la pelle, pulire i dintorni di entrambi i siti di sutura con soluzione di iodio (betadine) utilizzando una punta di cotone sterile.
  2. Iniettare una dose di antibiotica cefotaxime come 600 mg/kg di peso (in genere 12 mg cefotaxime in 100 µ l di soluzione salina/mouse) corporeo intraperitonealmente usando la siringa da 1 mL.
  3. Dare dosi giornaliere di Meloxicam analgesico come 1 mg/kg di peso corporeo (in genere 12 µ g Meloxicam in 100 µ l di soluzione salina/mouse) all'animale intraperitonealmente, fino a tre giorni dopo l'intervento chirurgico.
  4. Dopo il completamento della chirurgia, fermare il flusso di gas isoflurano e posizionare il mouse nella gabbia individualmente ventilata.

4. euthanization e caratterizzazioni

  1. Dopo i punti finali sperimentali (1 giorno e 10 giorni dopo l'intervento), eutanasia i topi secondo le linee guida istituzionali etica animale.
  2. Raccogliere il sangue mediante terminalmente sanguinamento gli animali, perforando il plesso terminale oculare.
  3. Isolare il siero dal sangue.

Risultati

Proliferazione degli epatociti dopo hepatectomy parziale del 30%: La proliferazione degli epatociti nei rimanenti del fegato dopo epatectomia 30% è stata esaminata secondo immunoistochimica (IHC) per un indicatore di proliferazione delle cellule, Ki-67. Un giorno post epatectomia, i topi sono stati sacrificati, i lobi del fegato restanti sono stati asportati e sezioni della paraffina sono state ottenute. Le sezioni sono state macchiate con anticorpo Ki-67, seguita da etichettatura con anticorpo secondar...

Discussione

Hepatectomy parziale è una tecnica consolidata per inquirenti rigenerazione del fegato e hepatectomy eccessivo è segnalato per imitare il modello AHF. Tra modelli animali di AHF, roditori, soprattutto topi, sono il modello più ricercato. Per ottenere un modello di disturbo al fegato in topi, fino a un hepatectomy di 70% è stato segnalato con una buona sopravvivenza tasso25,26. Tuttavia in altri mouse immunodeficiente e nudo, un hepatectomy di 70% è stato seg...

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato supportato dalla concessione core ricevuta dal dipartimento di biotecnologia, governo dell'India per l'Istituto nazionale di immunologia, Nuova Delhi. Indirizzo attuale di Dr. Bhattacharjee è divisione di gastroenterologia, Epatologia e nutrizione, Ospedale Los Angeles dei bambini.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Gas Anesthesia SystemUgo Basile; Italy211000
Weighing machineGoldtech ; IndiaLocal Procurement
Biological safety cabinet ( Class I)Kartos international;  IndiaLocal Procurement
Hair TrimmerPanasonic ;  Japan ER-GY10 
Straight operating scissor with sharp /sharp bladesMajor Surgicals; IndiaLocal Procurement
Forceps with SerrationsMajor Surgicals; IndiaLocal Procurement
Micro needle holders  straight & curved Mercian ;  England BS-13-8
1 ml insulin syringe with 30G *5/16 needles Dispo Van; India
1 ml syringe with 26 G * 1/2 needleBD ; US REF 303060
Nylon Threads  Mighty ; India(1-0) Local Procurement
MERSUTURES 4-0 Sterilised Surgical Needled SutureEthicon, Johnson & Johnson, IndiaNW 5047
TRUGUT 76 cm 4-0 absorbable surgical sutureSutures India Pvt. Ltd; IndiaSN 5048Sterilised Surgical Needled Suture Catgut Chromic
Cotton BudsPure Swabs Pvt Ltd ;  IndiaLocal Procurement
Surgical Tape3M India ; India1530-1Micropore Surgical Tape
MicrotomeHisto-Line Laboratories, ItalyMRS3500
Shandon Cryotome E CryostatThermo Electron Corporation ; US
Confocal laser scanning microscopeCarl Zeiss ; Germany LSM 510 META
Bright Field MicroscopeOlympus, JapanLX51
Automated analyserTulip, Alto Santracruz, IndiaScreen Maaster 3000Biochemical analyser for liver functional test
Flow CytometerBD ; US BD FACSverseAssesment of presence of cells post transplantation
Veet hair removal cream Reckitt Benckiser , India
FORANEAbbott ; USisoflurane USP 99.9% 
TaximAlKem ; Indiacefotaxime sodium injection
Povidone-Iodine solution Win-Medicare;  IndiaBetadine
ParaformaldehydeHimedia; IndiaGRM 3660
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)Life technologies, Thermo Fisher scientific ; US12200-036
SucroseSigma ; USS0389
Tissue-TekSakura; US25608-930O.C.T compound
DAPIHimedia; IndiaMB 097
anti-Albumin goat PolyclonalThermo Scientific,Pierce, USPA126081
anti-connexin 32/GJB1 Polyclonalabcam, UKab64609-500
antiGFP rabbit polyclonal Santa Cruz biotechnology; USSC 8334
Alexa Fluor 594 donkey anti-goat Molecular Probes , Thermo Fisher Scientific ;  USA11058
Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep Molecular Probes , Thermo Fisher Scientific ;  USA11015
Alexa Fluor 594 chicken anti rabbit Molecular Probes , Thermo Fisher Scientific ;  USA21442
Goat anti rabbit IgG HRPInvitrogen, Thermo Fisher Scientific; US 65-6120
anti-Ki67 antibodyabcam, UKab15580
Antigen Unmasking Solution, Citric acid baseVector laboratories, USH-3300
ProLong Diamond antifade mountantLife technologies, Thermo Fisher scientific ; USP36966
SGOT (ASAT) KITCoral Clinical System, India
SGPT (ALAT) KITCoral Clinical System, India
Alkaline Phosphatase Kit (DEA)Coral Clinical System, India
Hematoxylin Solution, Mayer'sSigma ; USMHS16
Eosin Y solution, alcoholicSigma ; USHT110132
DPX Mountant Sigma ; US6522
Melonex (Pain Killer)Intas Pharmaceuticals Ltd; IndiaMeloxicam injection 
DAB enhanced liquid substrate system tetrahydrochlorideSigma ; USD3939

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