Intrasplenic trasplante de hepatocitos después de Hepatectomy parcial en cabeceo. Ratones de SCID

Resumen

Hemos descrito un protocolo para la realización de hepatectomía parcial (PHx) y trasplante de la célula vía bazo en cabeceo. SCID (CABECEO. CB17-Prkdcscid/j) ratones. En este protocolo, se realiza una incisión para exponer y resecar el lóbulo izquierdo del hígado, seguido por otra incisión para el intrasplenic trasplante de células.

Resumen

Hepatectomía parcial es un método versátil y reproducible para el estudio de la regeneración hepática y el efecto de la terapéutica celular basado en diversas condiciones patológicas. Hepatectomía parcial también facilita el engraftment aumento y proliferación de las células trasplantadas por neovascularización aceleración y migración de células hacia el hígado. Aquí, describimos un protocolo simple para realizar 30% hepatectomía y trasplante de células en el bazo de un no obeso diabético grave había combinado NOD inmunodeficiente. SCID (CABECEO. CB17-Prkdcscid/j) ratón.

En este procedimiento, se realizan dos pequeñas incisiones. La primera incisión es para exponer y resecar el lóbulo izquierdo del hígado, y otra pequeña incisión para exponer el bazo para el intrasplenic trasplante de células. Este procedimiento no requiere ninguna habilidad quirúrgica especializada y puede realizarse en 5-7 minutos con menos estrés y dolor, una recuperación más rápida y mejor supervivencia. Hemos demostrado el trasplante de hepatocitos aislados de una proteína fluorescente verde (GFP) expresando su ratón (transgénicos C57BL/6-Tg (UBC-GFP) 30Scha/J), así como los hepatocitos como células de origen humano (NeoHep) en hepatectomized parcialmente NOD. Ratones de SCID.

Introducción

Actualmente, trasplante de hepatocitos es propuesto como una alternativa al trasplante de órgano entero para tratar a los pacientes tener severos trastornos hepáticos. Se cree que puede superar a los pacientes de trasplante de órgano entero¹. Además de los hepatocitos alogénicos², hepatocitos xenogénica³ y hepatocitos derivados de las células⁴ también están siendo investigados en modelos animales. En este contexto, el engraftment y autoguiado hacia el blanco potencial de las células trasplantadas en el receptor es un criterio importante para la terapia celular basada en la insuficiencia hepática aguda (AHF).

Para investigando el trasplante de hepatocitos o de hepatocitos como las células⁵, AHF se crea en un modelo animal por quirúrgico⁶ o procedimientos farmacológicos⁷ , seguidos de transplante de células. Para hacer un modelo animal de la AHF por reactivos farmacológicos, muchas hepatotoxins como la d-galactosamina⁸, acetaminofén⁹, tetracloruro de carbono¹⁰, tioacetamida¹¹, concanavalina A¹², lipopolysaccharide¹³ , etcetera., se han utilizado. De esta lista, cada reactivo genera un conjunto de características únicas para AHF, pero lamentablemente no solo reactivo imita el humano AHF. Por otra parte, el AHF inducido por hepatotoxins lleva mucho tiempo, que pone a los animales bajo estrés crónico, y son difíciles de obtener resultados reproducibles.

Por otra parte, la intervención quirúrgica de hepatectomía parcial (PHx) es dependiente de la habilidad y la reproducibilidad es fácil de obtener después de desarrollar las habilidades necesarias. Para inducir AHF por solo la intervención quirúrgica, la resección de más del 70% del hígado se requiere; sin embargo, menos de una hepatectomía del 70% todavía puede ser utilizada para estudiar el engraftment y proliferación de trasplantar las células en el hígado para analizar su capacidad terapéutica en daño hepático¹⁴. El trasplante de hepatocitos han sido realizadas post hepatectomía por el peritoneo¹⁵, cola vena¹⁶, vena hepática¹⁷o el¹⁸del bazo. Actualmente, la infusión de la vena hepática y intrasplenic trasplante de hepatocitos son los procedimientos preferidos, ya que son fáciles de reproducir.

En este trabajo hemos descrito un procedimiento de una hepatectomía parcial del 30% en cabeceo. SCID (CABECEO. CB17-Prkdcscid/J) ratones en el que el lóbulo izquierdo del hígado es suprimido. Es seguida por el trasplante de hepatocitos de ratón (C57BL/6-Tg (UBC-GFP) 30Scha/J) expresando GFP 0,2 millones así como origen humano NeoHep¹⁹ en el bazo. Este procedimiento conduce al engraftment de células trasplantadas en el hígado. Este procedimiento es menos invasivo y una técnica mínimamente dolorosa.

Protocolo

En este protocolo los procedimientos han sido aprobados por el Comité institucional de ética Animal del Instituto Nacional de Inmunología, en Nueva Delhi. El número de serie de referencia de la aprobación es AICE #319/13.

Nota: Hay excelentes recursos en procedimientos de cirugía general²⁰ y protocolos específicos para roedores cirugía²¹. Para aquellos haciendo cirugía animal por primera vez, se recomienda ampliamente practicar procedimientos quirúrgicos en maniquíes antes de operar a los animales.

1. preparación

1. Antes del experimento, se mantenga estéril tamponada de fosfato salino (PBS) o solución salina preparada.
2. Montar un kit de cirugía contiene tijeras, pinzas dentadas, pinzas de tejido, algodón, bastoncillos de algodón, hilos de nylon y portaagujas diferentes micro. Autoclave el kit de cirugía. Debe tener especial cuidado si un GUIÑO inmuno-comprometidos. Ratón SCID está incluido en el protocolo.
3. Realizar el procedimiento experimental completo, desde la preparación hasta el final de la cirugía, en la bio-seguridad clase I gabinete.
4. Pesar un GUIÑO. Ratón SCID de 6-8 semanas antes de la cirugía. Ratones que pesen entre 14-18 g son utilizados en este estudio.
5. Afeitado de la región abdominal central e hipocondríaco superior del ratón con el recortador de vellos. Aplicar el cabello eliminación crema uniformemente en toda la región con una espátula para eliminar completamente el vello recortado. Quite los pelos con la ayuda de un trozo de algodón estéril húmedo después de 2-5 minutos.
6. Colocar el ratón en la cámara de isoflurano y abrir la válvula de la botella de oxígeno. Mantener el flujo de oxígeno a razón de 4 L/min y la vaporización de isoflurano en el 4% para inducir anestesia.
   1. Asegúrese de que el ratón ha sido anestesiado correctamente pellizcando suave del dedo del pie.
7. Coloque un tablero de cirugía dentro de una bioseguridad gabinete. Coloque el animal en el tablero de la cirugía, tal que la porción ventral del ratón es hacia arriba y la porción anterior del ratón se coloca dentro del cono de nariz conectado a la fuente de isoflurano y el oxígeno.
8. Reducir la vaporización de isoflurano al 2% y mantener durante todo el procedimiento quirúrgico.
9. Desinfectar la piel del ratón y esterilizar limpiándolo con algodón estéril empapado etanol al 70%.

2. quirúrgico

1. Hepatectomía parcial
   1. Realizar una incisión transversal de aproximadamente 1 cm en la piel justo debajo del esternón, perpendicular en el proceso de xiphoid y paralelo a la caja torácica, con la ayuda de tijeras de operación recta.
   2. Separe suavemente la piel atada con la capa del músculo abdominal en las cercanías de la zona Incisa con puntas de algodón estéril humedecido para distinguir entre la piel y la capa de músculo abdominal o fórceps. Empape la región intradérmica con PBS utilizando puntas de algodón estéril para evitar la desecación.
   3. Exponga el área del lóbulo izquierdo suavemente haciendo una incisión transversal a través de la capa peritoneal justo por debajo del xifoides. Utilizar dos puntas de algodón humedecido para exponer y levantar el lóbulo izquierdo del hígado.
   4. Una de las puntas de algodón en el lado abdominal del corte y otra punta de algodón en el lado del diafragma. Suavemente presione la punta a hacia el diafragma y dar un impulso corredero por el otro extremo para levantar el lóbulo izquierdo del hígado.
   5. Deslice un hilo de nylon con un bucle el lóbulo izquierdo levantado y deslice el lazo hacia la base del lóbulo izquierdo cerca del hilio con la ayuda de los consejos micro pinzas o algodón. Presione suavemente el bucle de hilo de nylon a la base del lóbulo izquierdo.
   6. Atar dos extremos del hilo de nylon en la parte superior del lóbulo izquierdo con un Portaagujas de microcirugía y las micro pinzas. Hacer dos nudos adicionales en el otro lado.
   7. Disecan hacia fuera del lóbulo atado con la ayuda de tijeras. No intente cortar muy cerca del hilo. En caso de que el procedimiento dura más de 5 min, mantener la cavidad peritoneal y órganos húmedos con PBS estéril para evitar la desecación debido a la pérdida de líquidos.
   8. Coser el peritoneo utilizando sutura continua sutura Catgut 4-0. Posteriormente, cerca de la piel por la sutura discontinua lo antes posible.
2. Trasplante de la célula
   Nota: Los hepatocitos expresan GFP fueron aislados de ratones transgénicos GFP (C57BL/6-Tg (UBC-GFP) 30 Scha/J), según el procedimiento descrito por Lee et al. ²² y Shen et al. ²³ hepatocito-como las células (NeoHep) de origen humano diferenciado de monocitos²⁴ también fueron utilizadas para el trasplante. Sin embargo, las células derivadas de otras fuentes pueden utilizarse también en el protocolo.
   1. Suspender las células viables 0,2 millones en alrededor de 50 μl de medio de modificado Dulbecco de Iscove (IMDM) y aspirar en una jeringa de insulina 1 mL con aguja de 30 G. Mantenga la jeringa fría puesta en hielo.
   2. Colocar el ratón de manera que la parte lateral izquierda se enfrenta hacia la persona que realiza la cirugía. Identificar el área esplénico y transversalmente disecar la piel cerca de la región hipocondríaco, seguida de una corta incisión a través de la capa peritoneal para exponer el bazo.
   3. Levante el bazo suavemente y mantener que fuera de la cavidad con la ayuda de dos PBS humedecido puntas de algodón.
   4. Sostenga el bazo cuidadosamente con las dos puntas de algodón en una mano y coloque la aguja de la jeringa vertical exactamente en el bazo. Perforar el bazo y empuje la aguja muy lentamente en el interior; la aguja no debe recibir más de 2 mm.
   5. Empuje el émbolo de la jeringa lentamente para inyectar las células en el bazo. Después del trasplante, mantener estable la aguja de la jeringa y retire lentamente desde el bazo para evitar sangrado o pérdida de las células.
   6. Después de colocar el bazo hacia la cavidad peritoneal con las puntas de algodón, cerca de la capa peritoneal continua de sutura con una sutura de Catgut 4-0. Coser la piel discontinuo con la misma sutura. Evitar el uso de clips de herida para el cierre de la piel; en cambio, cerrarla por una sutura de 4-0. Los clips de herida restringen el movimiento natural del ratón, y a menudo clips soltarse y salen rápidamente.

3. postoperatorio cuidado

1. Tras el cierre de la piel, limpie los alrededores de los sitios de sutura con solución de yodo (betadine) usando una punta de algodón estéril.
2. Inyectar una dosis de antibiótico cefotaxima como 600 mg/kg de peso (típicamente 12 mg cefotaxima en 100 μl de solución salina y el ratón) corporal por vía intraperitoneal utilizando jeringa de 1 mL.
3. Dar dosis diarias de analgésico Meloxicam 1 mg/kg peso corporal (típicamente 12 μg Meloxicam en 100 μl de solución salina y el ratón) a los animales por vía intraperitoneal, hasta tres días después de la cirugía.
4. Después de la terminación de la cirugía, detener el flujo de gas isoflurano y volver a colocar el ratón en la jaula individualmente ventilada.

4. euthanization y caracterizaciones

1. Después de las variables experimentales (1 día y 10 días post cirugía), eutanasia a los ratones según las pautas del ética animal institucional.
2. Recoger la sangre por hemorragia terminal los animales, pinchar el plexo terminal ocular.
3. Aislar el suero de la sangre.

Resultados

Proliferación de hepatocitos después de hepatectomy parcial 30%: La proliferación de hepatocitos en el resto de hígado después de hepatectomy 30% fue examinada por inmunohistoquímica (IHC) para un marcador de proliferación celular, Ki-67. Un día post hepatectomía, los ratones fueron sacrificados, los lóbulos de hígado restantes fueron suprimidos y se obtuvieron secciones de la parafina. Las secciones fueron teñidas con anticuerpos Ki-67, seguido por etiquetado con rábano peroxidasa (HRP) con...

Discusión

Hepatectomía parcial es una técnica establecida para investigar la regeneración hepática y hepatectomía excesiva se divulga para imitar el modelo de AHF. Entre los modelos animales de AHF, roedores, especialmente ratones, son el modelo más investigado. Para obtener un modelo de daño hepático en ratones, hasta una hepatectomía del 70% se ha divulgado con una buena supervivencia tasa^25,26. Sin embargo en nude y otro ratón inmunodeficiente, una hepatectom?...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gas Anesthesia System	Ugo Basile; Italy	211000
Weighing machine	Goldtech ; India		Local Procurement
Biological safety cabinet ( Class I)	Kartos international;  India		Local Procurement
Hair Trimmer	Panasonic ;  Japan	ER-GY10
Straight operating scissor with sharp /sharp blades	Major Surgicals; India		Local Procurement
Forceps with Serrations	Major Surgicals; India		Local Procurement
Micro needle holders  straight & curved	Mercian ;  England	BS-13-8
1 ml insulin syringe with 30G *5/16 needles	Dispo Van; India
1 ml syringe with 26 G * 1/2 needle	BD ; US	REF 303060
Nylon Threads	Mighty ; India		(1-0) Local Procurement
MERSUTURES 4-0 Sterilised Surgical Needled Suture	Ethicon, Johnson & Johnson, India	NW 5047
TRUGUT 76 cm 4-0 absorbable surgical suture	Sutures India Pvt. Ltd; India	SN 5048	Sterilised Surgical Needled Suture Catgut Chromic
Cotton Buds	Pure Swabs Pvt Ltd ;  India		Local Procurement
Surgical Tape	3M India ; India	1530-1	Micropore Surgical Tape
Microtome	Histo-Line Laboratories, Italy	MRS3500
Shandon Cryotome E Cryostat	Thermo Electron Corporation ; US
Confocal laser scanning microscope	Carl Zeiss ; Germany	LSM 510 META
Bright Field Microscope	Olympus, Japan	LX51
Automated analyser	Tulip, Alto Santracruz, India	Screen Maaster 3000	Biochemical analyser for liver functional test
Flow Cytometer	BD ; US	BD FACSverse	Assesment of presence of cells post transplantation
Veet hair removal cream	Reckitt Benckiser , India
FORANE	Abbott ; US		isoflurane USP 99.9%
Taxim	AlKem ; India		cefotaxime sodium injection
Povidone-Iodine solution	Win-Medicare;  India		Betadine
Paraformaldehyde	Himedia; India	GRM 3660
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)	Life technologies, Thermo Fisher scientific ; US	12200-036
Sucrose	Sigma ; US	S0389
Tissue-Tek	Sakura; US	25608-930	O.C.T compound
DAPI	Himedia; India	MB 097
anti-Albumin goat Polyclonal	Thermo Scientific,Pierce, US	PA126081
anti-connexin 32/GJB1 Polyclonal	abcam, UK	ab64609-500
antiGFP rabbit polyclonal	Santa Cruz biotechnology; US	SC 8334
Alexa Fluor 594 donkey anti-goat	Molecular Probes , Thermo Fisher Scientific ;  US	A11058
Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep	Molecular Probes , Thermo Fisher Scientific ;  US	A11015
Alexa Fluor 594 chicken anti rabbit	Molecular Probes , Thermo Fisher Scientific ;  US	A21442
Goat anti rabbit IgG HRP	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific; US	65-6120
anti-Ki67 antibody	abcam, UK	ab15580
Antigen Unmasking Solution, Citric acid base	Vector laboratories, US	H-3300
ProLong Diamond antifade mountant	Life technologies, Thermo Fisher scientific ; US	P36966
SGOT (ASAT) KIT	Coral Clinical System, India
SGPT (ALAT) KIT	Coral Clinical System, India
Alkaline Phosphatase Kit (DEA)	Coral Clinical System, India
Hematoxylin Solution, Mayer's	Sigma ; US	MHS16
Eosin Y solution, alcoholic	Sigma ; US	HT110132
DPX Mountant	Sigma ; US	6522
Melonex (Pain Killer)	Intas Pharmaceuticals Ltd; India		Meloxicam injection
DAB enhanced liquid substrate system tetrahydrochloride	Sigma ; US	D3939