Intrasplenic Transplantation von Leberzellen nach teilweiser Hepatektomie in NOD. SCID-Mäuse

Zusammenfassung

Wir haben ein Protokoll für die Durchführung von teilweise Hepatektomie (PHx) und Zelltransplantation über Milz in NOD beschrieben. SCID (NICKEN. CB17-Prkdc^scidj) Mäuse. In diesem Protokoll wird ein Einschnitt gemacht, zu entlarven und den linken Leberlappen folgte ein weiterer Einschnitt für die intrasplenic Transplantation von Zellen zu resezieren.

Zusammenfassung

Teilweise Hepatektomie ist eine vielseitige und reproduzierbare Methode zur Leberregeneration und die Wirkung von zellbasierten Therapie in verschiedenen pathologischen Bedingungen zu studieren. Partielle Hepatektomie erleichtert auch die erhöhte Engraftment und Proliferation von transplantierten Zellen durch beschleunigte Neovaskularisation und Zellwanderung auf der Leber. Hier beschreiben wir ein einfaches Protokoll für immungeschwächte NOD 30 % Hepatektomie und Transplantation von Zellen in der Milz ein nicht adipösen Diabetiker/schwere Ausführung kombiniert werden. SCID (NICKEN. CB17-Prkdc^scidj) Maus.

Bei diesem Verfahren werden zwei kleine Hautschnitte vorgenommen. Der erste Schnitt ist zu entlarven und den linken Leberlappen resezieren, und ein weiterer kleiner Schnitt erfolgt, die Milz für die intrasplenic Transplantation von Zellen verfügbar zu machen. Dieses Verfahren erfordert keine speziellen chirurgische Fähigkeiten nicht, und es kann in ca. 5-7 Minuten mit weniger Stress und Schmerzen, schnellere Genesung und bessere Überlebensrate abgeschlossen werden. Wir haben die Transplantation von Leberzellen isoliert von einem grün fluoreszierendes Protein (GFP) mit dem Ausdruck ihrer Maus (transgene C57BL/6-Tg (UBC-GFP) 30Scha/J) sowie Hepatozyten wie Zellen menschlichen Ursprungs (NeoHep) in teilweise Hepatectomized NOD bewiesen. SCID-Mäuse.

Einleitung

Als Alternative zur gesamten Organ-Transplantation zur Behandlung von Patienten mit schweren Lebererkrankungen wird derzeit Hepatozyten Transplantation vorgeschlagen. Es wird vermutet, dass es Patienten auf ganze Organ Transplantation¹überbrücken kann. Neben der allogenen Hepatozyten²werden xenogenen Hepatozyten³ und Hepatozyten abgeleitet von Stammzellen⁴ auch in Tiermodellen untersucht. In diesem Zusammenhang, das Homing und Engraftment ist Potenzial der transplantierten Zellen des Empfängers ein wichtiges Kriterium für zellbasierte Therapie im akuten Leberversagen (AHF).

Für die Untersuchung der Transplantation von Leberzellen oder Hepatozyten-wie Zellen⁵, entsteht AHF in einem Tiermodell durch chirurgische⁶ oder pharmakologische⁷ Verfahren durch die Transplantation von Zellen. Zu Tiermodell AHF durch pharmakologische Reagenzien, viele Hepatotoxins wie Paracetamol⁹, Carbon Titantetrachlorid¹⁰, Thioacetamide¹¹, d-Galactosamin⁸, Concanavalin A¹², Lipopolysaccharid¹³ , etc.., verwendet wurden. Aus dieser Liste jedes Reagenz erzeugt einen eindeutigen Satz von Funktionen für AHF, aber leider keinen einzigen Reagenz imitiert menschliche AHF. Darüber hinaus die AHF induziert durch Hepatotoxins dauert eine lange Zeit, die Tiere unter Dauerstress setzt, und reproduzierbare Ergebnisse sind schwer zu bekommen.

Auf der anderen Seite die chirurgische Verfahren der partiellen Hepatektomie (PHx) ist Geschick abhängig, und reproduzierbare Ergebnisse sind leicht zu beschaffen, nach der Entwicklung der erforderlichen Fähigkeiten. AHF durch einen chirurgischen Eingriff allein zu induzieren, ist die Resektion von mehr als 70 % der Leber erforderlich; jedoch verpflanzt weniger als eine 70 % Hepatektomie noch genutzt werden kann, um Studie Engraftment und Proliferation von Zellen in der Leber für die Analyse ihrer therapeutischen Kapazität bei Leberschäden¹⁴. Die Transplantation von Leberzellen wurden durchgeführt Post Hepatektomie durch das Peritoneum¹⁵, Tail Vene¹⁶, Lebervene¹⁷oder die Milz-¹⁸. Derzeit Lebervene Infusion und intrasplenic Transplantation von Leberzellen das bevorzugte Verfahren, da sie leichter zu reproduzieren.

In diesem Papier haben wir ein Verfahren für eine 30 % teilweise Hepatektomie in NOD beschrieben. SCID (NICKEN. CB17-Prkdcscid/J) Mäuse, in denen die linken Leberlappen herausgeschnitten. Es folgt durch Transplantation von 0,2 Millionen GFP mit dem Ausdruck ihrer Maus (C57BL/6-Tg (UBC-GFP) 30Scha/J) Hepatozyten sowie menschlichen Ursprungs NeoHep¹⁹ in der Milz. Dieses Verfahren führt zu Engraftment der transplantierten Zellen in der Leber. Dieses Verfahren ist die wenigsten invasive und minimal schmerzhaft Technik.

Protokoll

Verfahren vorgestellt, die in diesem Protokoll wurden von der institutionellen Tier-Ethik-Kommission des nationalen Institut für Immunologie, Neu-Delhi genehmigt. Die serielle Nummer der Genehmigung ist OIEA #319/13.

Hinweis: Es gibt exzellente Ressourcen auf allgemeine Chirurgie Verfahren²⁰ und spezifische Protokolle für Nager Chirurgie²¹. Für diejenigen, die tierischen Operation zum ersten Mal empfiehlt es sich ausgiebig üben chirurgische Eingriffe auf Attrappen vor Inbetriebnahme auf Tiere.

1. Vorbereitung

1. Halten Sie vor dem Experiment sterile Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) "oder" saline bereit.
2. Montieren Sie eine Chirurgie-Kit mit Schere, gezahnte Pinzette Gewebe Zange, Baumwolle, Wattestäbchen, Nylonfäden und verschiedenen Mikro Nadelhalter. Autoklaven der Chirurgie-Kit. Besondere Sorgfalt sollte wenn ein immungeschwächter NICKEN. SCID-Maus wird in das Protokoll aufgenommen.
3. Führen Sie das komplette experimentelle Verfahren, von der Vorbereitung bis zum Ende der Operation, in der Bio-Sicherheit Klasse I Schrank.
4. Wiegen Sie ein NICKEN. SCID-Maus von ca. 6-8 Wochen vor der Operation. Mäuse mit einem Gewicht zwischen 14-18 g sind in dieser Studie verwendet.
5. Rasur der oberen Mittel- und Hypochonder Bauchregion der Maus mit dem Haarschneidegerät. Gelten Sie Haare entfernen Creme gleichmäßig in der gesamten Region mit einem Spatel die abgeschnittenen Haare vollständig zu entfernen. Entfernen Sie die Haare vorsichtig mit Hilfe eines sterilen feuchten Baumwolltuch nach 2-5 Minuten.
6. Platzieren Sie den Mauszeiger in der Kammer Isoflurane und schalte das Ventil der Sauerstoffflasche. Pflegen Sie die Sauerstoffzufuhr zum Preis von 4 L/min und Isofluran Verdampfung bei 4 %, Anästhesie zu induzieren.
   1. Stellen Sie sicher, dass die Maus richtig durch sanfte Zeh kneifen betäubt worden ist.
7. Legen Sie eine Operation Board innerhalb eines Biosafety Kabinett. Legen Sie das Tier auf dem Chirurgie-Brett, so dass der ventrale Teil der Maus nach oben zeigt und der vordere Teil der Maus sich im Inneren der Nase Kegel Isoflurane und Sauerstoff angeschlossen befindet.
8. Isofluran Verdampfung auf 2 % zu reduzieren, und während des chirurgischen Verfahrens zu erhalten.
9. Desinfizieren Sie die Haut von der Maus und durch Abwischen mit 70 % igem Ethanol getränkten sterilen Baumwolle zu sterilisieren.

2. chirurgische Verfahren

1. Partielle Hepatektomie
   1. Quereinschnitt von etwa 1 cm in der Haut direkt unter dem Brustbein, senkrecht an den Xiphoid Prozeß und Parallel zu den Brustkorb mit Hilfe der geraden OP Schere vornehmen.
   2. Trennen Sie vorsichtig die Haut mit der Bauchmuskel-Schicht in der Nähe der eingeritzten mit Pinzette oder sterilen angefeuchteten Wattestäbchen zu unterscheiden zwischen Haut und Bauchmuskulatur Schicht angebracht. Genießen Sie die intradermale Region mit PBS mit sterilen Wattestäbchen um Austrocknung zu entgehen.
   3. Setzen Sie Bereich der linke Lappen glatt durch eine quer Schnitt durch die Peritonealdialyse Schicht direkt unter dem Xiphoid aus. Verwenden Sie zwei angefeuchteten Wattestäbchen zu entlarven und heben Sie den linken Leberlappen.
   4. Platzieren Sie ein Wattestäbchen auf der Bauch-Seite des Schnitts, und legen Sie ein weiteres Wattetupfer auf die Membranseite. Vorsichtig drücken Sie die Spitze in Richtung der Membran platziert und geben Sie einen gleitenden Push durch die andere Spitze, heben Sie den linken Leberlappen.
   5. Stecke einen Nylonfaden mit einer Schleife durch die angehobene linke Lappen und schieben Sie die Schlaufe in Richtung zur Unterseite des linken Lappens in der Nähe der Hilum mit Hilfe der Mikro-Pinzetten oder Baumwolle-Tipps. Drücken Sie die Fadenschlinge Nylon vorsichtig an der Basis des linken Lappens.
   6. Binden Sie die beiden Enden der Nylonfaden über den oberen Teil der linken Lappen mit einem Mikrochirurgie Nadelhalter und Mikro Zange. Machen Sie zwei zusätzliche Knoten auf der anderen Seite.
   7. Der gebundene Lappen mit Hilfe der Schere zu sezieren. Versuchen Sie nicht, sehr nah an das Gewinde schneiden. Für den Fall, dass der Vorgang länger als 5 Minuten dauert, halten Sie die Bauchhöhle und die Organe feucht mit sterilen PBS, Austrocknung durch Flüssigkeitsverlust zu vermeiden.
   8. Nähen Sie das Peritoneum kontinuierliche näht mit einer 4: 0 Catgut Naht. Schließen Sie anschließend die Haut durch diskontinuierliche vernähen so schnell wie möglich.
2. Stammzelltransplantation
   Hinweis: Die GLP mit dem Ausdruck ihrer Hepatozyten wurden isoliert von transgenen Mäusen GFP (C57BL/6-Tg (UBC-GFP) 30 Scha/J), nach dem Verfahren von Lee Et al.beschrieben. ²² und Shen Et Al. ²³ Hepatozyten-ähnliche Zellen (NeoHep) der menschlichen Ursprungs unterschieden von Monozyten²⁴ dienten auch zur Transplantation. Jedoch können auch Zellen aus anderen Quellen im Protokoll verwendet werden.
   1. 0,2 Millionen lebensfähige Zellen in rund 50 µL der Iscoves geändert Dulbecco Medium (IMDM) auszusetzen, und in einer 1 mL Insulin Spritze begrenzt mit 30 G Nadel Aspirieren. Halten Sie die Spritze kalt, indem es auf Eis.
   2. Platzieren Sie den Mauszeiger in einer Weise, die der linken seitliche Teil in Richtung der Person, die die Operation nach oben zeigt. Identifizieren der Milz Gegend und quer sezieren die Haut in der Nähe der Hypochonder Region, gefolgt von einen kurzen Schnitt durch die Peritonealdialyse Schicht nur um die Milz zu entlarven.
   3. Heben Sie die Milz und halten Sie es außerhalb der Hohlraum mit Hilfe von zwei PBS Wattestäbchen angefeuchtet.
   4. Festhalten Sie die Milz mit zwei Wattestäbchen vorsichtig mit einer Hand, und legen Sie die Nadel der Spritze genau senkrecht zur Milz. Sanft die Milz durchbohren und schieben Sie die Nadel sehr langsam innen; die Nadel sollte nicht tiefer als 2 mm erhalten.
   5. Drücken Sie den Kolben der Spritze langsam um die Zellen in der Milz zu injizieren. Nach der Transplantation die Nadel der Spritze stabil zu halten und langsam von der Milz, Blutung zu vermeiden oder Verlust von Zellen zu entfernen.
   6. Nach dem Platzieren der Milz wieder in die Bauchhöhle mit dem Wattestäbchen, schließen Sie die Peritonealdialyse Schicht durch kontinuierliche Vernähen mit einem 4: 0 Catgut Naht. Nähen Sie die Haut diskontinuierlich mit der selben Naht. Vermeiden Sie die Verwendung von Wunde Clips zum Verschließen der Haut; Stattdessen schließen sie durch einen 4: 0-Naht. Die Wunde Clips schränken die natürliche Bewegung der Maus, und oft Clips locker und schnell herauskommen.

3. postoperative Pflege

1. Wischen Sie nach dem Schließen der Haut, die Umgebung der beiden Naht Standorte mit Jod-Lösung (Betadine) mit einem sterilen Wattetupfer.
2. Eine Dosis von Antibiotika Cefotaxim zu injizieren, da 600 mg/kg (in der Regel 12 mg Cefotaxim in 100 µL der Saline/Maus) intraperitoneal des Körpergewichts mit 1 mL Spritze.
3. Geben Sie tägliche Dosen von Schmerzmittel Meloxicam als 1 mg/kg Körpergewicht (in der Regel 12 µg Meloxicam in 100 µL der Saline/Maus), um das Tier intraperitoneal, für bis zu drei Tage nach der Operation.
4. Stoppen Sie nach Beendigung der Operation wird der Gasstrom Isofluran zu und platzieren Sie den Mauszeiger wieder zurück in die individuell belüfteten Käfig.

4. Euthanization und Charakterisierungen

1. Nach der experimentellen Endpunkte (1 Tag und 10 Tage nach der Operation) einschläfern Sie die Mäuse nach den institutionellen Tierethik-Richtlinien.
2. Sammeln Sie Blut durch die Tiere, Punktion der okulären terminal Plexus unheilbar Blutungen.
3. Serum aus dem Blut zu isolieren.

Ergebnisse

Hepatozyten Verbreitung nach 30 % teilweise Hepatektomie: Die Verbreitung von Hepatozyten in den verbleibenden nach 30 % Hepatektomie Leber wurde durch immunhistochemische (IHC) Färbung für eine Verbreitung Zellmarkierung, Ki-67 geprüft. Tages-Post Hepatektomie, die Mäuse wurden eingeschläfert, die verbleibenden Leber Lappen wurden herausgeschnitten und Paraffin Abschnitte wurden erhalten. Die Abschnitte wurden mit Ki-67-Antikörper, gefolgt von Etikettierung mit Meerrettich-Peroxidase (HRP) konjugi...

Diskussion

Partielle Hepatektomie ist eine etablierte Methode zur Untersuchung Leberregeneration und übermäßige Hepatektomie wird berichtet, dass der AHF-Modell zu imitieren. Tiermodelle der AHF gehören Nagetiere, insbesondere Mäuse, das am besten untersuchte Modell. Um eine Schädigung der Leber-Modell bei Mäusen bis zu einer 70 % Hepatektomie zu erhalten wurde mit einer guten überleben Rate^25,26gemeldet. Aber nackt und andere immungeschwächte Maus, eine 70 % Hepat...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gas Anesthesia System	Ugo Basile; Italy	211000
Weighing machine	Goldtech ; India		Local Procurement
Biological safety cabinet ( Class I)	Kartos international;  India		Local Procurement
Hair Trimmer	Panasonic ;  Japan	ER-GY10
Straight operating scissor with sharp /sharp blades	Major Surgicals; India		Local Procurement
Forceps with Serrations	Major Surgicals; India		Local Procurement
Micro needle holders  straight & curved	Mercian ;  England	BS-13-8
1 ml insulin syringe with 30G *5/16 needles	Dispo Van; India
1 ml syringe with 26 G * 1/2 needle	BD ; US	REF 303060
Nylon Threads	Mighty ; India		(1-0) Local Procurement
MERSUTURES 4-0 Sterilised Surgical Needled Suture	Ethicon, Johnson & Johnson, India	NW 5047
TRUGUT 76 cm 4-0 absorbable surgical suture	Sutures India Pvt. Ltd; India	SN 5048	Sterilised Surgical Needled Suture Catgut Chromic
Cotton Buds	Pure Swabs Pvt Ltd ;  India		Local Procurement
Surgical Tape	3M India ; India	1530-1	Micropore Surgical Tape
Microtome	Histo-Line Laboratories, Italy	MRS3500
Shandon Cryotome E Cryostat	Thermo Electron Corporation ; US
Confocal laser scanning microscope	Carl Zeiss ; Germany	LSM 510 META
Bright Field Microscope	Olympus, Japan	LX51
Automated analyser	Tulip, Alto Santracruz, India	Screen Maaster 3000	Biochemical analyser for liver functional test
Flow Cytometer	BD ; US	BD FACSverse	Assesment of presence of cells post transplantation
Veet hair removal cream	Reckitt Benckiser , India
FORANE	Abbott ; US		isoflurane USP 99.9%
Taxim	AlKem ; India		cefotaxime sodium injection
Povidone-Iodine solution	Win-Medicare;  India		Betadine
Paraformaldehyde	Himedia; India	GRM 3660
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)	Life technologies, Thermo Fisher scientific ; US	12200-036
Sucrose	Sigma ; US	S0389
Tissue-Tek	Sakura; US	25608-930	O.C.T compound
DAPI	Himedia; India	MB 097
anti-Albumin goat Polyclonal	Thermo Scientific,Pierce, US	PA126081
anti-connexin 32/GJB1 Polyclonal	abcam, UK	ab64609-500
antiGFP rabbit polyclonal	Santa Cruz biotechnology; US	SC 8334
Alexa Fluor 594 donkey anti-goat	Molecular Probes , Thermo Fisher Scientific ;  US	A11058
Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep	Molecular Probes , Thermo Fisher Scientific ;  US	A11015
Alexa Fluor 594 chicken anti rabbit	Molecular Probes , Thermo Fisher Scientific ;  US	A21442
Goat anti rabbit IgG HRP	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific; US	65-6120
anti-Ki67 antibody	abcam, UK	ab15580
Antigen Unmasking Solution, Citric acid base	Vector laboratories, US	H-3300
ProLong Diamond antifade mountant	Life technologies, Thermo Fisher scientific ; US	P36966
SGOT (ASAT) KIT	Coral Clinical System, India
SGPT (ALAT) KIT	Coral Clinical System, India
Alkaline Phosphatase Kit (DEA)	Coral Clinical System, India
Hematoxylin Solution, Mayer's	Sigma ; US	MHS16
Eosin Y solution, alcoholic	Sigma ; US	HT110132
DPX Mountant	Sigma ; US	6522
Melonex (Pain Killer)	Intas Pharmaceuticals Ltd; India		Meloxicam injection
DAB enhanced liquid substrate system tetrahydrochloride	Sigma ; US	D3939