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摘要

C. 线虫排泄管是一种独特的单细胞模型, 用于可视化的体内分析从头生物极化膜。该协议描述了标准的遗传/rna 干扰和成像方法相结合, 适用于定向单细胞 tubulogenesis、顶端膜和腔生物的分子的鉴定和表征。

摘要

四C. 线虫排泄运河是狭窄的管子延伸通过动物的长度从一个单细胞, 与几乎相等地延长的细胞内 endotubes 修造和稳定流明用膜和 submembraneous顶端字符的骨架。排泄细胞扩大其长度约2000倍, 以产生这些运河, 使该模型独特的在体内评估的de 从头极化膜生物, 胞内管腔内形态发生和单细胞tubulogenesis这里介绍的协议显示了如何结合标准标记, 增益和功能的遗传或 rna 干扰, 和微观的方法, 使用这个模型, 视觉解剖和功能分析这些过程的分子水平。作为标记方法的一个示例, 该协议概述了用荧光融合蛋白生成转基因动物, 用于 tubulogenesis 的实时分析。作为一种遗传方法的例子, 它突出了视觉 RNAi-based 交互界面的关键点, 旨在改变功能囊状管的表型。所描述的具体方法是如何: 通过表达荧光蛋白来标记和可视化运河;构建有针对性的 rna 干扰文库, 并制定策略性 rna 筛选方法, 对运河形态发生的分子分析;视觉评估运河表型的改变;通过解剖荧光显微镜对其进行评分;用共焦显微镜对高分辨率亚细胞导管成分进行表征;并量化可视化参数。该方法对于有兴趣利用C. 线虫排泄管的研究人员是有用的, 用于识别和表征细胞内腔和单细胞 phylogenetically 保守过程中涉及的基因。管状形态。

引言

所有的内脏器官都是由管子组成的, 它们的各种功能非常关键, 如气体、液体和养分的运输和交换, 以及代谢废物的排泄。他们的极化特性, 具有独特的顶端和腔膜, 是适应这些特定功能, 和缺陷的生物其内膜和细胞膜系统是一个常见的原因, 人类疾病1,2。血管和内脏的大多数管是多细胞的, 形成流明 intercellularly;然而, 单细胞管, 形成流明细胞, 可以, 例如, 代表多达30-50% 人毛细血管床2。和单细胞管的极化膜在成分上是相似的, 虽然它们的微可能根据管的特定功能而有所不同 (例如, 在线虫中, 排泄管小与小肠微绒毛) 线虫;有关C. 线虫肠道 tubulogenesis)3的附随纸张。极化膜生物和 tubulogenesis 的原理在后生中保存, 而类似的分子机械则指示它们1,2,4。

线虫排泄系统由五细胞组成: 排泄细胞 (EC)、导管细胞 (DC)、孔隙细胞 (PC) 和两个腺体细胞。消融的 EC, DC 或 PC 导致体液积聚在体腔和动物死亡早期幼虫阶段5。有趣的是, 这三单细胞生物用三种不同的方式创造了它们的流明: 细胞空洞化 (EC);细胞包裹结合 autocellular 结形成 (个人计算机);与 autofusion (DC) 相结合的细胞包裹;腔内形态发生的不同机制都是 phylogenetically 保守的6,7。该 EC 位于咽后部的左外侧, 发出两个侧向延伸, 四根运河伸出来将前和向后 (在左右两侧) 延伸到蠕虫的鼻尖和尾部。分别 (图 1)5、6、8。EC 从大约1µm 延伸到 2 x 1000 µm, 使它成为动物中最大的细胞。在亚细胞水平上, 排泄管是一个简单的管, 产生从一个基膜的方向 pseudocoelom, 并通过隧道腔膜 (endotube)。运河腔膜连接到导管腔膜在其唯一的细胞间结;运河是否则 junctionless 沿他们的长度 (图 1)。排泄管腔膜及其 submembraneous 细胞骨架顶端, 其分子组成的定义, 类似的顶端膜的组成和 submembraneous 细胞骨架的多细胞管, 如肠道,和其他 (如, 扁平) 上皮细胞。细胞质细胞器, 包括内涵水泡和其他 (如, 高尔基体) endomembranes 沿运河的长度分布。此外, 多个小囊泡--或者连接到腔膜, 和/或互联, 或隔离--通过运河细胞质7,8,9,10.这种动态的等离子膜/小连接进一步扩大了运河的膜系统, 并有助于流明形态发生和渗透10。因此, 排泄管几乎完全由内膜和细胞膜组成, 为极化膜生物的分析和细胞膜界面的调节提供了良好的模型。在运河 morphogenesis-in 的顶端膜的戏剧性扩展这个单细胞系统与流明扩展一致-也允许分析因需要稳定和中心的细胞内腔膜所引起的建筑问题.本议定书的重点是分析运河管和流明的结构形态发生和细胞内膜动力学所需的这个过程, 而不是信号的细胞运动, 产生 EC 的位置在排泄系统和构造它与其他细胞元素的错综复杂的连接 (在6中进行了回顾)。

C. 线虫单细胞管系统的进一步优势对极化膜和胞内腔的分析生物是它的能力分离, 通过发展时间, 它的细胞膜的不同的组分的世代和路口。EC 出生于腹侧闭合时, 在中期胚胎发育期间腹侧咽,5,6,8, 其间出现侧向管延伸和分支。随后是晚期胚胎发生后的前段后道延长, 这一过程将持续到 L1-larval 阶段 (图 1)。在一个新孵出的幼虫中, 后管尖端达到近似的蠕虫中间, 完全延伸到尾部的 L1 阶段结束, 之后的时间运河拉长与蠕虫8。在第一个幼体阶段, 以高于动物生长速度的活性运河生长结束, 然而, 在其他幼体期 (L2–4) 中, 进一步的生长与整个动物的生长同时发生。此设置提供了一个机会来分析不同的步骤, de 从头极化膜生物独立于极化细胞分裂或迁移。此外, 它允许分离这个过程从接合 (在胚胎发生在流明开始之前);它们在膜极化中的确切要求在极性领域仍然是一个开放的问题。最后, 它唯一的分离顶端从基底膜扩张, 后者的过程前在排泄运河10。因此, C. 线虫排泄管模型是一种特别翔实的肠道模型的补充, 它在极化膜生物的分析中具有许多优点, 但在多细胞环境中执行它 (见肠道 tubulogenesis 的附文3)。

虽然野生型运河是超薄小管在这个微小的蠕虫, 他们的流明可以是 visualized 直接由 Nomarski 光学在这透明动物。实际上, 突变型的胆囊管形态可以用低放大解剖显微镜来描述, 它在前向遗传筛检中的应用对 tubulogenesis11中所涉及的基因有很大的影响。改进的可视化的运河形态学和他们的极化膜, 骨架成分, 不同的细胞器和其他亚结构的区别, 但是, 需要标记和更高的功率荧光解剖和共聚焦显微镜。虽然运河的精细结构带来了许多困难的标签和显微镜, 膜和亚细胞成分可以区分通过特定的分子每个舱室, 和动物可以安全地安装显微镜, 如果采取了某些预防措施以避免引入工件 (请参见协议和讨论)。标记可以通过免疫组织化学在固定标本, 或通过生成转基因蠕虫表达荧光融合蛋白在自己的控制下或排泄管特定促进剂为在体内成像。本协议描述后一种标记技术 (参见有关肠道 tubulogenesis 抗体染色的附文3)。

在整个开发过程中, 将在体内丢失-或功能研究与活体成像分析结合在一起的能力使线虫排泄管成为一个特别强的分子模型和单细胞 tubulogenesis 的细胞分析。向前或反向的遗传屏幕可以执行从野生类型或标记的转基因动物, 以确定运河的形态发生表型 (例如, 囊肿) 及其潜在的基因缺陷。或者, 这样的屏幕可以从突变型 (例如, 囊性管) 开始, 并识别此表型的抑制因子或增强剂, 以确定与导致突变型的基因功能交互的基因。导致突变表型的遗传缺陷可能导致损失 (例如、 via基因缺失) 或增益 (如、通过激活突变或通过引入过量的基因拷贝) 的研究功能。前瞻性突变或系统的 rna 干扰屏幕是没有先入为主的基因功能, 并允许无偏见的基因识别涉及的功能的兴趣。考虑到基因组范围内的 rna 干扰喂养库的可用性, 几乎所有的基因都可以通过在线虫中的 rna 干扰而被轻易地击倒, 这样, 任何一个感兴趣的基因或任何一组基因 (如如, 在目标屏幕中) 也可以快速探测为他们的效果在反向遗传学方法。为了演示一种可能的方法组合, 我们在这里描述一个有针对性的 rna 干扰互动屏幕, 从一个功能囊性排泄管突变体, 标记为细胞质管绿色荧光蛋白 (GFP)。突变型的表现是由过度表达的erm-1, 高度保守的C. 线虫同源的膜-肌动蛋白连接器家族 Ezrin-Radixin-Moesin (erm), 这已牵连到流明形态发生和膜组织在许多种类12。C. 线虫ERM-1 本地化到内脏器官的腔膜, 如排泄管和肠道, 并且在两个13中都需要流明形成。ERM-1 过度肌动蛋白和小泡到运河腔膜, 增加通量到流明和产生短囊管和卷曲腔膜与加厚肌动蛋白底漆9。该协议描述了如何产生具有排泄管表达的融合蛋白 (或其他蛋白质) 的转基因菌株;如何执行有针对性的 rna 干扰屏幕, 从这样的菌株开始, 以确定一个运河表型的修饰剂;以及如何通过荧光解剖和共聚焦显微镜对这些屏幕的结果进行直观的分析, 包括简单的方法来量化信息 tubulogenesis 表型。替代标记技术和 rna 干扰的细节, 调整到经常致命的 tubulogenesis 基因, 可以发现在肠道 tubulogenesis3的陪同文件。所有的方法都可以用于各种组合, 用于调查运河 tubulogenesis 的其他问题。

研究方案

1. 用荧光融合蛋白标记 C. 线虫 排泄管 14

注意: 参见肠道 tubulogenesis 的附文 3 用于标记 原位 抗体染色程序, 适用于排泄管。请参见 表 1 , 以了解用于可视化 C. 线虫 排泄管内膜和细胞膜的分子的示例, 表 2 启动子表达式到排泄管的例子, 和 表 3 用于更全面的标记和发起人集合的资源, 包括讨论不同荧光的选择的参考.

  1. 基于限制性酶的克隆构建组织特异性荧光标记质粒 15
    注意: 请参阅 讨论 以了解其他构造方法荧光融合蛋白。
    1. 标识启动子序列 (用于转录融合) 或与其启动子 (用于平移融合) 在 WormBase 44 中的整个基因.
      注: 对于推广者, 大约1和 #8211; 3 kilobase (kb) 对于大多数 C. 线虫 基因都是足够的。平移融合蛋白也可以通过在排泄管特定启动子下放置一个感兴趣的基因来构建 (参见 表 2 ).
    2. 设计向前和反向底漆为促进者的放大 (为转录融合) 和/或一个充分的基因与促进者 (为翻译融合)。添加限制酶连接在5和 #8217; 和3和 #8217; 底漆的末端.
      注意: 选择在矢量质粒中存在的限制性酶 ( 例如 , pPD95.79) 16 。对于平移融合, 3 和 #8217; 连接器应设计为在限制酶消化和与载体结扎后, 插入密码子帧将连续与密码的荧光, 例如 , GFP。你可能需要增加1或2更多基地对典型的制约酵素连接 14 ;注意不要创建一个停止密码子.
    3. 执行聚合酶链反应 (PCR), 使用活蠕虫或野生型基因组 DNA 或 cDNA 作为模板来放大启动子或全长基因 15 .
      注意: 当使用蠕虫作为模板时, 首先溶解蠕虫在裂解缓冲 (PCR 缓冲加蛋白酶 K) 17 。混合阶段蠕虫可用作模板。饥饿的蠕虫可以用来避免细菌 DNA 的污染.
    4. 在 PCR 产品上进行琼脂糖 (1%) 凝胶电泳, 以确定放大产品的正确尺寸.
      注意: 如果带大小正确, 请继续下一步。如果生成多个频带, 则可改善放大条件以产生单波段。如果这不起作用, 切开正确的带从胶凝体和净化脱氧核糖核酸由标准方法 15 然后继续下一步.
    5. 在 PCR 产品上执行限制摘要和包含荧光 ( (如 , pPD95.79) 的矢量质粒), 采用标准方法 15 .
    6. 用凝胶电泳分离经消化的 dna, 并洗 PCR 产物和不同管中的载体 DNA 带.
    7. 用标准方法将 dna 从凝胶切片中纯化 15 。用分光光度法测定 DNA 浓度.
    8. 用标准方法结扎 PCR 产物和载体 DNA, 用标准方法将重组基因转化为合格细胞 15 .
    9. 传播10和 #956; l, 50 和 #956; l 和100和 #956; 转化细胞在三个体 Luria 肉汤 (LB) 板上补充50和 #956; 氨苄西林.
      注意: 将不同数量的细胞分散到不同的板块上, 以提高光谱的转化效率。例如, 电镀过于密集, 可能不允许孤立的殖民地, 如果转化是有效的.
    10. 在37和 #176 上孵育盘子。第二天早上, 从孵化器拿出盘子.
      注意: 如果菌落非常小, 孵育几个小时.
    11. 用标准方法从单个菌落中制备质粒 dna 15 。混合模板 DNA 和引物和发送的排序 (通常在核心服务中心执行).
    12. 读取序列并验证融合构造的完整性.
      注意: 临界: 确认插入基因与荧光标记基因之间的正确密码子框架, 用于平移融合。理想的情况下, 序列的整个基因, 以确认在 PCR 和结扎过程中没有引入突变.
    13. 为步骤1.2 生成更多的质粒 DNA (使用步骤 1.1.11).
  2. 通过微注射 DNA 为系转化生成转基因动物 18 注: 请参阅关于引入转基因的替代技术的讨论。概述的程序可以用来产生转基因动物携带荧光融合蛋白或任何其他蛋白质的利益。例如, 一个外源蛋白可以被新引入 ( 例如 , 一个异源同源) 或一个内生蛋白可以重新引入 (例如, 到其相应的系突变的救援) 或表达生成表型 (例如, 注射的 erm-1 被用来产生过度表达的囊状管表型, 这是通过下面描述的 rna 干扰界面来进行修改的目标。
    1. 混合构造 dna (1 和 #8211; 50 ng/和 #956; l) 与标记质粒 dna (通常 100 ng/和 #956; l), 例如占主导地位的标记 rol-6 (su1006) (请参见1.2.3 标记选项).
      注意: 临界: 在排泄管中表达基因时, 必须根据经验确定注射 DNA 的浓度, 以避免引入 artefactual 表型 (囊肿、延伸缺陷、致死性), 尤其是对转基因的表达敏感。例如, 可以在浓度为 1 ng/和 #956 的质粒中制造几种混合物; l、10 ng/与 #956; l、50 ng/与 #956; l 和 100 ng/和 #956; l 与 100 ng/和 #956; l "su1006" 以测试某一可行应变的生成范围所需的表达或表型 (高浓度可能是非毒性的运河形态发生, 可能是致命的).
    2. 通过 0.22 #956; m (微米) 孔径旋转 x 离心管过滤器过滤 DNA 混合物.
      注意: 不要把管子的盖子开着, 以免灰尘堵塞注射针头.
      3. 通过标准的系转换方法, 将重组质粒 Microinject 到野生型或变种蠕虫的性腺中 (参见参考资料 18 中的过程详细信息).
      注: 标准标记质粒是, 例如: 6 (su1006), dpy-20, unc-119, pha-1 。主要的转基因像 6 (su1006) 被引入到野生类型蠕虫中, 而营救转基因被引入各自的变种。标记质粒是合作易于维护的转基因线, 因为外转基因在细胞分裂期间随机丢失 (见 1.2.8)。当注射基因编码荧光融合, 你也可以使用荧光, GFP, 本身作为标记。 rol-6 诱导蠕虫在自身周围滚动, 这通常有利于对形态表型的评估.
    3. 将注入的蠕虫转移到 大肠杆菌 种子线虫生长培养基 (NGM) 板 (如 , 5 蠕虫/板) (请参见参考资料 19 以了解标准的 C. 线虫文化和维护程序 材料表 ).
    4. 孵育板, 让后代在20和 #176 发展; C 约 3 d.
    5. 检查在解剖显微镜下的 F1 子代 (滚动) 蠕虫 (或任何其他特定的注射标记, 如 、GFP) 和拾取辊 to 单个板.
    6. 选择带有滚动 F2 动物的板, 并在解剖荧光显微镜下确认荧光的存在 (通常所有的滚轮动物都是 GFP 阳性).
      注: F2 滚筒表明了转基因线的成功生成。对于转基因传输速率, 单个行可能不同, 例如 。因此, 维护和存储几行是很有用的.
    7. 通过丰富新的标记阳性动物的盘子来维持转基因的线条.
      注: 注入的 DNA 被纳入系作为一个外数组。外阵列的传输速率是可变的, 但通常在50% 左右。因此, 为了不丢失应变, 必须手动丰富具有主导标记的线条 ( 例如 , 不通过负选择来保护线条).
    8. 在-80 和 #176 的长期存储中采用标准冻结技术冻结转基因品系; C 19 .
      注: 在外阵列上的转基因也可以通过紫外线照射将其集成到系中, 从而在另一个步骤中生成均匀线 18 。例如, 通过紫外线照射将 erm-1 集成到系中, 以获取 erm-1 [++] 应变 fgIs2 [erm-1 p:: erm-1; 6 p:: 6 (su1006)) 每种动物携带转基因, 在 RNAi-based 中使用它的要求交互屏幕如下所述。这种菌株是另外标记的细胞质排泄管 gfp 通过交叉在一个应变, 包含一个 vha-1p :: gfp 转基因 (生成的相同程序如上所述; 见参考 20 的基本遗传过程, 如交叉), 被称为 ERM-1 [++]; vha-1p :: GFP 菌株在下面.

2。有针对性的 rna 干扰库的构建与 rna 交互作用屏幕的设计修改运河表型

注意: 有针对性的 RNAi-based 基因交互作用屏幕被描述使用一个过度表达的囊状管表现型寻找相互作用的排泄管形态发生基因。ERM-1 [++] 应变 (参见步骤 1.2.9) 充当示例 9 。这种方法仅为排泄管腔形态发生的遗传分析提供了多种可能的方法之一 (参见 介绍 和 讨论 其他遗传方法)。请参阅肠道 tubulogenesis 的附文 3 和参考资料 17 , 21 , 22 , 了解 rna 干扰的背景, 详细信息程序, 调制的 rna 干扰强度 (调整到往往致命的 tubulogenesis 基因) 和讨论的技术问题连接到 rna 干扰。有关标准蠕虫区域性和维护以及 材料表 , 请参见参考 19 。

  1. 在数据库和已发布文章中搜索 ERM-1 (或其他感兴趣的基因) 交互分子.
    注: 潜在的 ERM-1 团员将包括所有实验证明在功能上、基因上或物理上与任何物种的 ERM 蛋白相互作用的所有分子, 并且/或者被预测为任何 在硅片中 这样做, 高吞吐量或系统生物学方法 (有关数据库和资源的示例, 请参见 表 3 ).
  2. 生成所有基因的列表并查找 C. 线虫 同系物在需要的地方.
    注意: 考虑将已识别基因的列表扩展到基因类, 这将考虑到感兴趣基因的功能并扩大用于识别团员的网络 ( 例如 , 对于膜-肌动蛋白链接器 ERM-1, 选择所有动和肌动蛋白相关分子).
  3. 在商业上可用的所有基因的全基因组细菌 rna 干扰库中识别相应的 rna 干扰细菌喂养克隆 (, 如 , Ahringer 基因组 C. 线虫的 rna 干扰喂养文库 21 ; 材料表 )
  4. 生成所有基因及其对应的 rna 干扰板和井号的电子表格.
  5. 在 LB/氨苄西林/四环素板上选择和条纹〜 50 rna 干扰克隆 (抗生素的选用由图书馆建设决定), 并继续, 直到生成有目标的干扰 rna 库.
    注意: 根据库大小和预计工作流, 省略生成完整库并直接进行批分析。盘子可以储存在4和 #176; C, 不超过约2周 (如果需要, re-streak 到新的板块后)。相反, 在-80 和 #176 的长期存储中, 可以在复制96井或384井格式中生成更大的冻结库; C.
  6. 在37和 #176 上孵育盘子。第二天早上, 从孵化箱中取出盘子, 并在4和 #176 储存; C.
  7. 用无菌牙签从盘子中提取干扰细菌, 将细菌与600和 #956 混合; 在1.5 毫升微中, 用氨苄西林 (50 ng/和 #956; l) 肉汤, 在37和 #176 上孵育管; C, 摇动 6 h.
    注: 在微的一侧, 通过揉搓 (牙签或微尖端), 将微生物的干扰接种到肉汤中.
  8. 种子70和 #956; 将细菌培养成每组6个好的 rna 干扰板, 重复或三份。在一夜之间孵育22和 #176 的 rna 干扰板; C.
    注意: rna 干扰板是由标准程序 ( 材料表 和参考资料 3 、 17 、 21 ) 生成的, 这里使用的是6井组织文化板格式为一个更高的吞吐量方法仍然允许微观评估运河形态发生在活动物在板材.
  9. 第二天早上, 选择 3 L4 阶段 ERM-1 [++]; vha-1p :: GFP 蠕虫在 rna 干扰板上的每一个井。
    1. 为了避免 OP50 细菌的污染 (请参见参考 19 ), 该病毒干扰第一种蠕虫在无细菌的 NGM 板上播种, 并让动物爬行约10分钟。只使用 non-starved 的健康动物.
  10. 在22和 #176 上孵育板; C 为 3 d 允许动物产生后代.
  11. 在解剖荧光显微镜下检查 F1 子代的导管表型.

3。 在体内 用荧光解剖显微镜和 Tubulogenesis 表型评分法对 线虫 排泄管进行成像

  1. 准备一个表单评分表 (示例如 表格 4 和 图5所示).
  2. 将琼脂板与蠕虫直接置于荧光 dissectin 下显微镜下, 打开盖板进行评估, 使用较低的放大倍数对焦.
    注意: 此协议描述了使用具有1.5X 和10X 目标的范围以及从3.5 到45的缩放范围 ( 材料表 ).
  3. 通过分别聚焦于每一个井来评估动物, 从1开始, 然后在盘子里工作.
    注意: 总是从控件的计算开始。例如, 模拟 (空矢量) 负控制 (HT115 的 rna 干扰细菌 (参见参考 17 , 21 ) 没有或与不相关的基因插入) 和适当的阳性对照, 例如 , 在此交互屏幕, erm-1 干扰 (抑制 erm-1 [+ +] 表型) 和 sma-1 /收缩 rna 干涉 (提高了 erm-1 [+ +] 渠道表型).
  4. 首先, 检查明亮光下的一般表型 (例如: 让/致命, Clr/清除, 教统局/胚胎致命, Dpy/无菌, Unc/不协调, 矮胖, 等 ), 通过计数动物总数和数量来量化表现动物的表型, 记录数字 (请参见 表 4 ).
    注: 对于导致可能影响运河表型评价的缺陷的基因的 knockdowns ( 例如 , 教统局,), 考虑重复实验与有条件的, 后胚胎 rna 干扰 (见附文为过程 3 ).
  5. 第二, 在荧光光下检查排泄管表型, 评分可量化表型 (如: , 运河的长度, 流明的宽度, 囊肿), 记录数字, 并在计分单上描述表现型 (参见 表格 4 ,强类 = "xfig" > 图 5 ).
    注: 更高的放大率与变焦范围是需要评估更微妙的运河表型。在低和高放大率之间来回移动, 仔细评估运河和 #8217 的长度和宽度以及任何其他的运河形态发生表型。对于简单表型的量化或 semi-quantification, 计数100动物 ( 例如 , L4s 在这个目标的 rna 干扰屏幕; 表型: 运河长 1/4, 1/2, 3/4 和完全延长后运河, 和流明直径后运河, 小囊肿 (和 #60; 1/3 的动物宽度), 大囊肿 (和 #62; 1/3 的动物宽度);请参见 表 4 ).
  6. 通过显微镜安装的数字电荷耦合器件 (CCD) 摄像机和相应的成像软件 (请参阅 材料表 )
    1. 获取图像, 以获得来自至少3不同动物的主要型式的图像,第一次打开摄像头, 打开连接的电脑, 双击图像捕获软件图标, 在低放大的情况下手动对焦一个区域, 打开相机快门.
    2. 单击 #8220; 实时预览和 #8221; 计算机屏幕上的图像捕获软件图标将计算机屏幕上的蠕虫可视化, 手动调整焦点以清晰地显示屏幕上的蠕虫, 然后单击和 #8220; 快照和 #8221; 图标, 然后单击 #8220; 保存和 #8221; 图标.
      注意: 动物在萤光下会移动得更快, 因此将一只手放在电脑鼠标上, 同时将板块移动到感兴趣的区域。然后立即单击 #8220; 快照和 #8221; 图标获取图像。通常可以通过几次尝试获得一个好的图像.
    3. 用正确的文件名保存获取的图像 (包括应变名称、rna 干扰克隆名称和日期).
      注意: 快速移动的野生型蠕虫, 细长的运河比变种人更难想象。具有囊性导管和/或其他表型的突变体可能会缓慢移动, 从而促进成像。标记质粒, 如卷, 可用于保持动物和 #8220 的成像; 在现场和 #8221, 而不是向前移动, 也可以提供一个改善的看法, 在表型与动物滚动本身.

4。高分辨率激光扫描共聚焦显微镜下的 线虫 排泄管的成像

  1. 安装活动动物
      在棉签的顶端或尖端放置少量油脂或凡士林食指, 并传播油脂产生一个直径为6和 #8211 的超薄圈; 8 毫米在一个干净的玻璃幻灯片中间.
    1. 将6和 #956; L 5% 利多卡因溶液 (麻醉剂) 微到圆圈中.
      注: 在水中溶解利多卡因粉可制成利多卡因溶液。用 M9 缓冲区 19 ( 材料表 ) 稀释为5%。对排泄管的分析是至关重要的, 以避免常见的固定性溶液 (如叠氮化钠), 导致囊肿破裂, 并诱导导管表型.
    2. 从一个 rna 干扰板中选取几个动物, 并将它们放入利多卡因溶液中, 通过浸入蠕虫拾取 19 进入解决方案.
      注意: 优选地挑选特定阶段的动物, 以均匀的厚度使其更易于安装。动物可以在解剖荧光显微镜上预先选定.
    3. 将 22 mm x 22 mm 的片放在玻璃滑梯上; 让它轻轻地落到油脂圈上.
      注意: 不要对片施加任何物理压力, 这可能损害运河的形态, 特别是在突变体或 rna 干扰治疗蠕虫与运河和可能其他表型。因此, 避免一个厚的油脂圈是重要的;理想的动物被轻轻夹在玻璃滑梯和盖板之间.
    4. 在玻璃幻灯片的磨砂一侧写上样品的名称。立即采取幻灯片的共焦显微镜分析运河表型和获取图像.
      注意: 延迟可能导致运河囊肿的损坏或管腔形态的改变.
  2. 获取共焦图像
      将幻灯片放在共焦显微镜的采样阶段, 将蠕虫集中在低放大倍数 (10X) 上.
    2. 查看和选择60X 和/或100X 目标下的动物, 检查排泄管和 #8217 的细胞和亚单位表型, 如 , 囊肿的腔形和直径, 大小和形状; 或标记为分析的亚细胞成分, 如 , 顶端/腔膜, 基底膜, 细胞质, 内涵与小泡, 其他细胞器 (参见 讨论 , 图 2 , 和 图 4 ).
    3. 获取感兴趣的特定表型的图像.
      注: 本协议描述使用激光扫描共聚焦显微镜 ( 材料表 )。要解决瘦 线虫 排泄管中的亚细胞组分, 需要更高的放大目标 (60X 到 100X)。一个旋转盘共焦显微镜可以用来获取时间推移图像, 但提供较少的 confocality (请参见 讨论 )。
      1. 获取共焦图像, 打开计算机, 双击共聚焦显微镜软件, 然后单击特定激光图标选择激光.
      2. 单击 #8220; 扫描和 #8221; 图标在计算机屏幕上可视化聚焦蠕虫, 通过调整激光强度软件, 然后再次点击和 #8220; 扫描和 #8221; 图标停止扫描, 然后点击和 #8220; 捕获和 #8221; 图标捕获图像, 然后单击并 #8220; 保存和 #8221; 图标.
      3. 保存具有正确文件名的图像, 包括 rna 干扰克隆名称、应变名称和日期.
        注意: 图像可以作为单个和多个部分 ( 例如 , 10 和 #8211; 15 节沿 z-axis) 获取。剖切允许3D 可视化。获取投影图像并在需要时单独保存 (视显微镜而定)。为了获得最佳分辨率, 使用低增益的激光设置, 不要太多地打开针孔, 并为每个图像添加数个平均值 (参见参考 23 , 24 以进行共焦成像的一般性讨论)。请注意在饱和度以下的亮度下获取图像, 以便在需要时通过成像软件进行修改 (最好使用未修改的图像).
      4. 获取或的图像乘以标记的运河 ( 如 绿色、红色和蓝色), 通过单击多个激光图标, 但使用顺序扫描来避免通道之间的出血 (关键共存研究).
        注意: 您可能需要考虑顺序扫描所需的时间 (这也会导致相应的照片漂白增加) 并修改扫描仪设置。不要从一张幻灯片中扫描超过30分钟的动物, 以避免不对运河形态的影响。如果需要更长的扫描, 请安装新的幻灯片.
      5. 获取相应的差分干涉光学 (DIC)/Nomarski 图像, 特别是当量化管长和流明直径相对于蠕虫和 #8217; s 体长和直径。通过点击和 #8220 叠加荧光和 Nomarski 图像; 叠加和 #8221; 图标以演示地标 ( 图 1D 和 图 4A 和 #8211;D ).
    4. 用于量化, 通过 ImageJ 软件测量感兴趣的标记组件的荧光强度 25 ( 图 5C )。

结果

本协议描述如何使用C. 线虫排泄运河, 以视觉和分子分析单细胞 tubulogenesis 和细胞内腔形态发生在一个单一的细胞。在他们从 mid-embryogenesis 到成年, 四排泄运河继续扩展他们的侧和顶端/腔膜连同他们的小和内涵膜系统, 提供一个独特的模式在体内分析de 从头极化膜生物 (图 1)。通过表达特定的荧光融合蛋白 (在协议1节中描述), 亚细...

讨论

线虫 "遗传多样性、透明性、简单的体计划和不变的细胞谱系都使其成为分析形态发生的良好模型。该协议描述了如何结合标准的遗传操作和成像研究, 以利用2微米薄的线虫排泄运河研究极化膜和细胞内腔生物在一个单一的细胞管。

标签
C. 线虫排泄管可以用荧光融合蛋白的表达进行标记, 允许活体分析 (此处描述), 或通过抗体或化学染色 (见...

披露声明

作者声明他们没有竞争的金融利益。

致谢

我们感谢 m. Buechner (堪萨斯大学, 堪萨斯州, 美国), k Nehrke (罗切斯特大学医学中心, 罗切斯特, 纽约, 美国), 和线虫遗传学中心, 由国家卫生研究院资助, 研究基础设施办公室程序 (P40 OD010440)。这项工作得到了资助, NIH GM078653, MGH 是224570和223809至 iii

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
Cloning
Plasmid pPD95.75AddgeneCat. No. 37464
PCR KitQiagenCat. No. 27106
Ligation kitNew England BiolabsCat. No. E2611L
DNA markerThermo ScientificCat. No. SM1331
Agarose DNA gradeFisher ScientificCat. No. BP164-100
Competent cellsNew England BiolabsCat. No. C2987H
TrisFisher ScientificCat. No. BP154-1
EDTASigmaCat. No. ED-1KG
Acetic acidFisher ScientificCat. No. A38S-500
Ethidium bromideFisher ScientificCat. No. BP1302-10
Equipments
PCR machine MJ ResearchCat. No. PTG-200 
CentrifugeEppendorf Cat. No. 5415C
Water BathPrecision Scientific Cat. No. 666A3 
Gel running instrumentFisher ScientificCat. No. 09-528-165
Gel running power supplyFisher ScientificCat. No. 45-000-465
Molecular Imager Gel Doc XR SystemBio-RadCat. No. 1708195EDU
Nanodrop SpectrophotometerThermo ScientificCat. No. ND1000
C. elegans related11see reference27 for standard C. elegans culture and maintenance procedures.
LB Medium and plates22see reference24 for protocols.
Tryptone Acros OrganicsCat. no. 611845000
Yeast ExtractBD BiosciencesCat. no. 212750
NaClSigmaCat. no. S7653
Bacto Agar BD BiosciencesCat. no. 214040
AmpicillinSigmaCat. no. A0116
TetracyclineFisher ScientificCat. no. BP912
M9 Medium22see reference24 for protocols.
NaClSigmaCat. no. S7653
KH2PO4SigmaCat. no. P0662
Na2HPO4SigmaCat. no. S7907
MgSO4SigmaCat. no. M2773
NGM plates 22see reference24 for protocols.
NaClSigmaCat. no. S7653
Peptone BD BiosciencesCat. no. 211677
Tryptone Acros OrganicsCat. no. 611845000
Bacto Agar BD BiosciencesCat. no. 214040
MgSO4SigmaCat. no. M2773
CaCl2SigmaCat. no. C3881
Cholesterol SigmaCat. no. C8667
K2HPO4 SigmaCat. no. P3786
KH2PO4SigmaCat. no. P0662
RNAi plates33see reference60 for protocols.
NaClSigmaCat. no. S7653
Peptone BD BiosciencesCat. no. 211677
Tryptone Acros OrganicsCat. no. 611845000
Bacto Agar BD BiosciencesCat. no. 214040
MgSO4SigmaCat. no. M2773
CaCl2SigmaCat. no. C3881
Cholesterol SigmaCat. no. C8667
K2HPO4 SigmaCat. no. P3786
KH2PO4SigmaCat. no. P0662
IPTG US BiologicalCat. no. I8500
CarbenicillinFisher ScientificCat. no. BP2648
NaOHFisher ScientificCat. no. SS266-1
Sodium hypochloriteFisher ScientificCat. no. 50371500
Bacteria
OP50 bacteriaCGC
HT115 bacteriaCGC
Genome-wide RNAi libraries
Ahringer genome-wide RNAi feeding library (ref29,49)Source BioScience
C. elegans ORF-RNAi feeding library (ref50)Source BioScience
Imaging related
LidocaineMP Biomedicals,LLGCat. no. 193917
Materials
Vacuum Grease SiliconeBeckmanCat. no. 335148
Microscope slides Fisher ScientificCat. no. 4448
Microscope coverslips (22×22-1）Fisher ScientificCat. no. 12-542-B
Tissue culture plate, 6 well Corning Inc.Cat. no. 08-772-33
Equipment
SMZ-U dissecting microscope (Nikon)
SZX12 dissecting microscope (Olympus), equipped with a high-power stereo fluorescence attachment (Kramer Scientific), CCD camera with Q capture software and X-Cite fluorescent lamp (Photonic Solutions).
TCS SL Laser-scanning confocal microscope (Leica Microsystem)
C2 laser-scanning confocal mounted on an ECLIPSE Ti-E inverted microscope (Nikon)

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