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요약

C. 선 충 배설 운하 드 노 보 편광 막 속의 시각적 vivo에서 분석에 대 한 고유한 단일 셀 모델입니다. 이 프로토콜 표준 유전 RNAi 및 이미징 접근, 식별 및 분자 단 세포 tubulogenesis, 그리고 꼭대기 막 및 루멘 속 감독의 특성에 대 한 적응의 조합을 설명 합니다.

초록

4 선 충 C. 배설 운하는 좁은 튜브를 거의 동등 하 게 멀리 확장된 세포내 endotubes 구축 하 고 막 및 submembraneous 루멘 안정화와 함께 단일 셀에서 동물의 길이 통해 확장 꼭대기 캐릭터의 골격입니다. 배설 셀 확장의 길이 약 2, 000 번 드 노 보 편광 막 속, 세포내 루멘 morphogenesis vivo에서 평가 대 한 독특한이 모델을 만드는이 운하를 생성 및 단 세포 tubulogenesis입니다. 여기에 제시 된 프로토콜 표준 라벨, 이득 및 손실-의-기능 유전자 또는 RNA 간섭 (RNAi) 결합 하는 방법을 보여줍니다-, 그리고를 사용 하 여이 모델 기능 분자 수준에서이 프로세스를 분석 하 고 시각적으로 해 부 현미경 접근. 표기 방법의 예를 들어, 프로토콜 tubulogenesis의 실시간 분석을 위한 유전자 변형 동물 형광 성 융해 단백질의 생성을 설명합니다. 유전 접근의 예를 들어, 그것은 함수 이득 낭 성 운하 형을 수정 하도록 설계 된 시각적 RNAi 기반 상호 작용 스크린의 핵심 포인트를 강조 표시 합니다. 특정 방법을 설명 하는 방법: 레이블 및 형광 단백질; 표현 하 여 운하를 시각화 타겟된 RNAi 라이브러리를 구성 하 고 전략을 RNAi 운하 morphogenesis;의 분자 분석에 대 한 심사 시각적으로 고기;의 수정 평가 형광 현미경 검사 법;를 해 부하 여 점수 confocal 현미경 검사 법;에 의해 더 높은 해상도에서 subcellular 운하 구성 요소 특징 그리고 시각적 매개 변수를 측정. 방식은 확인 및 intracellular 루멘 phylogenetically 보존된 과정에 참여 하 고 단 세포 유전자에 대 한 선 충 C. 배설 채널의 활용에 관심이 있는 탐정에 대 한 유용 morphogenesis 튜브.

서문

모든 내부 장기의 튜브, 전송 및 가스, 액체 및 영양분의 교환 및 변화 낭비의 배설물 같은 그들의 여러 가지 기능에 대 한 중요 한 구성 됩니다. 그들의 편광된 캐릭터, 독특한 꼭대기와 lumenal 멤브레인과 이러한 특정 기능, 적응 하 고 결함 그들의 엔도-및 플라즈마 멤브레인 시스템의 속에는 인간의 질병1,2의 빈번한 원인이. 튜브는 맥 관 구조와 내부 장기의 대부분은 다세포 이며 intercellularly;는 루멘을 형성 그러나, 침 루멘을 형성, 단 세포 관, 수 예, 나타낼 만큼 인간의 모 세관 침대2의 30-50%. 비록 그들의 microdomains 튜브의 특정 기능 (예를 들어, 꼬마 장 microvilli 대 배설 운하 canaliculi에 따라 다를 수 있습니다 멀티-및 단 세포 튜브의 편광된 막 구성 면에서 유사 하다 선 충; C. 선 충 장 tubulogenesis 종이 동반 참조)3. 편광된 막 속 및 tubulogenesis의 원리는, metazoans 중 보존 하 고 유사한 분자 기계는 그들에 지시1,,24.

C. 선 충 배설 시스템 이루어져 5: 배설 셀 (EC), 덕트 세포 (DC), 셀 (PC)와 두 개의 선 셀 기 공. EC, DC 또는 PC의 절제는 바디 구멍에 한 초기 애벌레 단계5에서 동물 다 액체 축적을 발생합니다. 이 3 단 세포 관 글, 세 가지 방법으로 그들의 루멘을 만들: (EC)를 공동 화; 세포에 의해 셀 포장 결합 autocellular 접합 형성 (PC); 그리고 셀 배치 하 여 결합 autofusion (DC); 다른 메커니즘의 루멘 morphogenesis 모든 phylogenetically 보존된6,7입니다. EC, 후부 인 두 전구의 측면 왼쪽에 있는 밖으로 보내는 두 측면 확장 4 운하 anteriorly 확장 하는 확장에서 그리고 뒤로 (둘 다 오른쪽과 왼쪽 측면) 벌레의 코 및 꼬리의 끝에 각각 (그림 1)5,,68. EC에서에서 확장 약 1 µ m 2 x 1000 µ m, 동물에서 가장 큰 셀을 만들기. Subcellular 수준에 배설 채널 pseudocoelom, 향해 이동 하 고 lumenal 막 (endotube)에 의해 터널링 기저 막에서 생성 된 간단한 튜브입니다. 그것의 유일한 세포 접합;에서 덕트 lumenal 막에 연결 하는 운하 lumenal 막 운하는 그렇지 않으면 그들의 길이 (그림 1)에 따라 junctionless. 배설 운하 lumenal 막 및 그것의 submembraneous 골격 꼭대기 막의 조성과 소장, 같은 다세포 튜브의 submembraneous 골격 유사한 그들의 분자 구성에 의해 정의 된 꼭대기는 그리고 다른 (예를 들어, 평면) epithelia의. 세포질 세포, endosomal 나노미터 및 기타 (예, 골) endomembranes는 운하의 길이 따라 배포를 포함 하 여 또한, 여러 canalicular 소포-중 lumenal 막에 연결 된 상호 또는 절연-운하 세포질7,,89,10 통해 스레드는 . 이 동적 플라즈마 멤브레인/canalicular 연결 추가 채널의 막 시스템을 확장 하 고 모두 루멘 morphogenesis 및 osmoregulation10에 기여. 배설도 따라서 엔도-와 편광된 막 속의 분석 및 엔도-플라즈마 멤브레인 인터페이스의 규제에 대 한 훌륭한 모델을 제공 하는 플라즈마 세포 막의 거의 전적으로 구성 되어 있습니다. 이 단일 셀 시스템-루멘 확장명이 일치에서 운하 morphogenesis-동안 꼭대기 막의 극적인 확장 하실 수 있습니다을 안정 시키고 세포내 lumenal 막 센터는 필요에 의해 발생 하는 건축 문제를 분석 하 . 이 프로토콜에 초점을 맞추고 보다 직접 셀 움직임에서 EC의 위치를 생성 하는 신호 채널 튜브와 루멘의 구조 morphogenesis 및이 프로세스에 필요한 세포내 막 역동성의 분석에는 배설 체계 다른 세포 요소 (6에서검토) 그것의 복잡 한 연결을 구성 하 고.

편광된 막과 세포내 루멘 속의 분석에 대 한 선 충 C. 단일 셀 운하 시스템의 추가 이용은 개발 시간을 통해 그것의 막의 다른 구성 요소의 세대를 분리 하는 기능 그리고 접속점입니다. EC와 복 부 폐쇄의 시간에 태어난 ventro 옆 인 두의 중간 embryogenesis5,6,8, 동안 시간 측면 운하 확장 하 고 분기 발생 동안 침전. 이것은 늦은 embryogenesis, (그림 1) L1 애벌레 단계에 계속 하는 과정 동안 앞쪽 후부 운하 확장에 의해 선행 된다. 새로 부 화 애벌레, 후부 운하 끝에 도달 하면 벌레의 중간 약, 벌레8함께 elongates 완전히 확장 꼬리에 L1 무대의 끝에 어느 시간 후 운하. 그러나 따라서 동물의 성장을의 그것을 초과 하는 속도에서 활성 채널 성장 종료 첫 번째 애벌레 단계에서, 추가 성장 추가 애벌레 단계 (L2-4) 전체 동물의 성장과 동시에 발생 합니다. 이 설정은 드 노 보 편광 막 속의 편광된 세포 분열 또는 마이그레이션 독립의 다른 단계를 분석할 기회를 제공 한다. 또한, 접속점 (에서 발생 하는 루멘 개시 전에 배아);의 어셈블리에서이 프로세스의 분리 허용 막 분극에 그들의 정확한 요구 사항을 여전히 극성 필드에 오픈 질문 이다. 마지막으로, 그것은 고유 하 게 꼭대기 기저 막 확장, 배설 운하10전 앞 후자의 프로세스에서에서 분리 합니다. C. 선 충 배설 채널 모델은 따라서 편광된 막 속의 분석에 대 한 이러한 장점의 번호를 공유 하지만 다세포 설정 (참조 실행 장 모델에 특히 유익한 보완 함께 종이 장 tubulogenesis3에).

야생-타입 운하는이 작은 벌레의 ultrathin tubules, 비록 그들의 루멘 6 수 있습니다.이 투명 한 동물에 Nomarski 광학에 의해 직접 sualized. 사실, 돌연변이 낭 성 운하 형태학 레이블이 없는 동물 해 부 현미경, tubulogenesis11에 관련 된 유전자를 식별 하기 위해 앞으로 유전 스크린에 큰 효과를 사용 하는 낮은 확대를 사용 하 여 특징 수 있습니다. 그러나 향상 된 시각화 운하의 형태와 그들의 편광된 막, cytoskeletal 구성 요소, 다른 세포내 세포 및 다른 subcellular 구조의 구별의, 라벨링 요구 하 고 높은 형광등을 전원 해 고 confocal 현미경 검사 법입니다. 비록 운하 미세 구조 포즈 다양 한 라벨 및 현미경 검사 법에 대 한 어려움, 막 및 subcellular 구성 요소는 각 구획에 고유한 특정 분자를 통해 구별 될 수 있다 및 동물 안전 하 게 장착할 수 현미경에 대 한 경우 특정 아티팩트 ( 프로토콜 및 토론참조) 소개를 피하기 위해 주의. 라벨 immunohistochemistry 고정된 표본에 의해 또는 그들의 자신의 통제 형광 성 융해 단백질을 표현 하는 유전자 변형 벌레를 생성 하 여 수행할 수 있습니다 또는 vivo에서 화상 진 찰에 대 한 배설 운하 관련 발기인. 이 프로토콜 설명는 후자의 라벨 (동반 종이3를 얼룩이 지는 항 체에 대 한 장 tubulogenesis 참조).

결합 손실 또는 이득-의-기능 학문 vivo에서 vivo에서 이미징 단일 셀에서 분석 하는 능력 개발은 전체 선 충 C. 배설 운하는 분자에 대 한 특히 강한 모델 레벨 및 단 세포 tubulogenesis의 세포 분석입니다. 정방향 또는 역방향 유전 스크린 운하 morphogenesis 고기 (예를 들어, cysts)을 식별 하는 야생-타입 또는 레이블이 유전자 변형 동물 시작 수행할 수 있습니다 그리고 그들의 기본 유전자 결함. 또는, 이러한 화면 돌연변이 표현 형 (예, 낭 성 운하)로 시작 하 고 진압 또는 증강이이 형의 유전자 돌연변이 표현 형을 일으키는 기능적으로 상호 작용 하는 유전자를 식별 식별 수 있습니다. 돌연변이 체 표현 형을 일으키는 유전적 결함 (예를들면, 유전자 삭제 통해 ) 손실 또는 이득 일으킬 수 있다 (예를 들어,를 통해 활성화 돌연변이 또는 초과 유전자의 도입을 통해) 조사 기능. 앞으로 mutagenesis 또는 체계적인 RNAi 스크린 유전자 기능에 편견 없이 고 관심의 기능에 관련 된 유전자의 편견된 식별을 허용. 라이브러리를 수 유 하는 게놈 넓은 RNAi의 가용성을 감안할 때 거의 모든 유전자 수 수 쉽게 뜨 RNAi C. 선 충에 의해 그런 관심사의 어떤 단일 유전자 또는 유전자 (예를 들어, 대상된 화면에서)의 어떤 그룹 수 있습니다 또한 신속 하 게 찾는 것 대 한 반전 유전학 접근에 그들의 효과. 접근의 가능한 조합을 보여, 우리 여기 설명 대상된 RNAi 상호 작용 화면 기능 이득 낭 성 배설 운하 돌연변이로 시작 세포질 운하 녹색 형광 단백질 (GFP)으로 표시. 돌연변이 형 음-1, 높은 보존된 C. 선 충 의 overexpression에 의해 생성 된 막 걸 링커 가족 Ezrin-Radixin-Moesin (ERM), 루멘 morphogenesis 및 막에 연루 되어 있는의 ortholog 많은 종12조직입니다. C. 선 충 음 1 배설 운하 등 소장, 내부 장기의 lumenal 막 localizes 및 두13루멘 형성에 대 한 필요 합니다. 음-1 overexpression 초과 말라와 루멘에 플럭스를 증가 하 고 짧은 낭 운하와 두꺼워 말라 undercoat9방해 lumenal 막 생성의 운하 lumenal 막에 소포를 보충 한다. 프로토콜 융합 단백질 (또는 다른 단백질); 운하 표현 배설와 유전자 변형 종자를 생성 하는 방법을 설명 합니다. 타겟된 RNAi 스크린 운하 형;의 한정자를 식별 하기 위해 이러한 긴장 시작을 수행 하는 방법 그리고 시각적으로 형광 해 고 confocal 현미경 검사 법, 유익한 tubulogenesis 고기를 계량 하는 간단한 방법을 포함 하 여 이러한 스크린의 결과 분석 하는 방법. 대체 기술 및 RNAi, 종종 치명적인 tubulogenesis 유전자 조정의 세부 사항 라벨 장 tubulogenesis3에 동반 종이에서 찾을 수 있습니다. 모든 메서드는 채널 tubulogenesis에 다른 질문의 조사에 대 한 다양 한 조합에 사용할 수 있습니다.

프로토콜

1. 형광 성 융해 단백질 14 C. 선 충 Excretory 운하 라벨

참고: 장 tubulogenesis에 함께 종이 참조 3 현장에서 항 체 절차를 배설 운하에 얼룩으로 라벨에 대 한. C. 선 충 배설 운하 엔도-및 플라즈마 막, 발기인 배설도 운전 하는 식의 예제를 보려면 표 2를 시각화 하는 데 유용 하 게 입증 하는 분자의 예제를 보려면 표 1을 참조 하 고 표 3 마커 및 발기인의 더 포괄적인 컬렉션에 대 한 리소스에 대 한 다른 fluorophores의 선택에 대해 참조를 포함 하 여.

  1. 제한 효소에 의해 조직의 특정 형광 성 감 적 플라스 미드의 건설 기반 복제 15
    참고: 건설의 대체 기술에 대 한 토론을 참조 하십시오 형광 성 융해 단백질입니다.
  2. 식별 (transcriptional 융해)에 대 한 발기인의 또는 WormBase 44 (변환 융해)에 대 한 그것의 발기인과 함께 관심의 전체 유전자의 순서
      .
      참고: 약 1, 발기인에 대 한 – 3 kilobase (kb)는 대부분 C. 선 충 유전자에 대 한 충분 한. 변환 융해 단백질 또한 배설 운하 특정 발기인에서 관심사의 유전자를 삽입 하 여 건설할 수 있다 (표 2 참조).
    1. (변환 융해)에 대 한 모터와 발기인 (transcriptional 융해)에 대 한 전체 유전자의 증폭에 대 한 정방향 및 역방향 뇌관 디자인. 5 제한 효소 링커 추가 ’와 3 ’ 뇌관의 끝.
      참고: 벡터 (예, pPD95.79) 플라스 미드 16에 존재 하는 제한 효소를 선택 합니다. 변환 융해, 3에 대 한 ’ 링커 금지 효소 소화는 벡터와 결 찰 후에, 삽입 codon 프레임 fluorophore, 예를 들어, GFP의 codons와 연속 될 것입니다 설계 한다. 하나 일반적인 제한 효소 링커 14; 1 또는 2 더 많은 기지를 추가 해야 할 수도 있습니다. 정지 codon를 만드는 것이 아니라 돌.
    2. 수행 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 발기인 또는 템플릿 15 라이브 웜 또는 야생-타입 게놈 DNA 또는 cDNA를 사용 하 여 전체 길이 유전자 증폭.
      참고: 벌레 서식 파일을 사용할 때 먼저 세포의 용 해 버퍼 (PCR 버퍼 플러스 성분을 K) 17에 벌레를 lyse. 혼합된 단계 벌레 서식 파일로 사용할 수 있습니다. 굶 어 웜 세균성 DNA로 오염 방지를 사용할 수 있습니다.
    3. (1%) 수행 agarose 젤 전기 이동 법 증폭된 제품의 정확한 크기를 확인 하기 위해 PCR 제품에.
      참고: 밴드 크기가 올바른 경우 다음 단계로 진행 합니다. 여러 밴드 생성 되는 경우 단일 밴드를 생산 하는 증폭 조건을 향상. 이 작동 하지 않으면, 젤에서 올바른 밴드를 잘라 하 고 표준 방법 15 DNA를 정화 하 고 다음 다음 단계로 진행.
    4. PCR 제품 및 표준 방법 15에 의해 별도 튜브에 fluorophore (예, pPD95.79)를 포함 하는 벡터 플라스 미드에 수행 금지 다이제스트.
    5. 소화 DNAs 젤 전기 이동 법으로 분리 하 고 PCR 제품을 elute 별도 튜브에 DNA 밴드 벡터.
    6. 표준 방법 15 젤 조각에서 DNAs를 정화. 분 광 광도 계에 의해 DNA 농도 측정.
    7. PCR 제품 선 및 표준 방법으로 DNA 벡터 및 유능한 세포에 표준 방법 15에 의해 하는 재조합 DNAs 변환.
    8. 확산 10 μ, 50 μ, 50 μ g/mL 암 피 실린 보충 하는 3 개의 개별 Luria 국물 (파운드) 접시에 변환 된 셀의 100 μ.
      참고: 다른 양의 셀 변환 효율의 스펙트럼에 대 한 다른 접시에 확산. 예를 들어, 너무 조밀 하 게 도금 수 있습니다 허용 하지 식민지의 경우 변환 효율.
    9. 하룻밤 37 ° C에서 접시를 품 어. 다음날 아침, 인큐베이터에서 번호판 꺼내.
      참고: 식민지 매우 작은 경우에, 품 어 몇 시간 더.
    10. 준비 플라스 미드 DNAs 표준 방법 15 단일 식민지에서. 서식 파일 DNA 및 뇌관을 혼합 하 고 시퀀싱 (핵심 서비스 센터에서 일반적으로 수행 됩니다) 발송.
    11. 시퀀스 읽었고 융해 구성의 무결성을 확인.
      참고: 중요: 사이 삽입 된 유전자와 형광 마커 진 번역 융해에 대 한 정확한 codon 프레임을 확인. 이상적으로, 아무 돌연변이 PCR 및 결 찰 절차 동안 도입 된 것인지 전체 유전자 시퀀싱.
    12. 생성 더 많은 플라스 미드 DNA (를 사용 하 여 단계 1.1.11) 주입 단계 1.2.
  3. 생식 변환에 대 한 DNA의 microinjection에 의해 유전자 변형 동물의 세대 18
    참고: transgenes 도입에 대 한 대체 기술에 대 한 설명을 참조 하십시오. 개요 절차는 유전자 변형 동물 형광 융해 단백질 또는 관심의 다른 단백질을 생성 하기 위해 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 외 인 단백질은 새로 도입 된 (예를 들어, 분리 ortholog) 수 또는 생 단백질을 재 (예: 구조 대는 해당 생식 돌연변이) 또는 표현 형 (예를 들어, 사출 생성 하 overexpressed 수 있습니다. 음-1의 사용 되었다 수정에 대 한 대상 역할 overexpression 낭 성 운하 표현 형을 생성 하 RNAi 상호 작용 화면 아래에서 설명).
    1. 믹스 구조 DNA (1 – 50 ng/μ) 마커 플라스 미드 DNA (일반적으로 100 ng/μ), 예를 들어 지배적인 마커 rol-6 (su1006)와 (1.2.3 표식 옵션에 대 한 참조).
      참고: 중요: 주입 된 DNA의 농도 때 artefactual 고기 (cysts, 확장 결함, 치 사 율)의 소개를 피하기 위해 실험적으로 결정 되어야 합니다은 특히 배설 운하에서 유전자 표현 transgenes의 표현에 민감 하다. 하나 만들 수 있습니다, 예를 들어, 플라스 미드의 여러 혼합물 1 ng/μ, 10 ng/μ, 50 ng/μ, 100 ng/μ rol-6(su1006)와 100 ng/μ의 농도 가능한 스트레인의 세대에 대 한 농도의 범위를 테스트 하는 원하는 식 또는 표현 형 (높은 농도 비 특히 운하 morphogenesis에 독성이 있을 가능성이 있으며 치명적인 수 있습니다).
    2. 0.22 μ m (마이크로미터) 기 공 크기 스핀-x 원심 분리기 튜브 필터를 통해 DNA 혼합물을 필터링.
      참고: 열어 놓지 마십시오 튜브의 뚜껑을 microinjection 바늘을 차단할 수 있는 먼지를 피하기 위해.
    3. 생식 변환에 대 한 표준 방법으로 야생-타입 또는 돌연변이 벌레의 생식으로 재조합 플라스 미드 microinject (절차 세부 사항에 대 한 참조 18 참조).
      참고: 표준 마커 플라스 미드는, 예를 들면: rol-6(su1006), dpy 20, unc-119, pha-1. Rol-6(su1006) 같은 지배적인 transgenes는 구출 transgenes는 그들의 각각 돌연변이로 소개 하는 반면 야생 타입 웜에 소개 된다. 표식 plasmids 공동 유전자 변형 라인의 쉬운 유지 보수를 위해 삽입 된 extrachromosomal transgenes는 세포 분열 동안 임의로 손실 이후 (1.2.8 참조). Fluorophore 융해에 대 한 인코딩을 하는 유전자를 주입 때 하나 사용할 수 있습니다 또한 fluorophore, GFP, 표식으로 자체. rol 6 유도 morphogenesis 고기의 평가 대 한 유리한 자주는 주위 롤 웜.
    4. 대장균에 주입 하는 전송 웜 시드 선 충 류 성장 매체 (NGM) 플레이트 (예를 들어, 5 웜/접시) (참조 19 표준 C. 선 충에 대 한 참조 문화 및 유지 보수 절차 및 자료의 테이블).
    5. 자손 3 약 20 ° C에서 개발 하 고 번호판을 품 어 라.
    6. 는 Rol (롤링) 벌레 (또는 어떤 다른 특정 주입 마커, 예를 들어, GFP) 해 현미경 F1 자손을 검토 하 고 롤러 t 선택o 개별 번호판.
    7. F2 동물으로 접시를 선택 하 고 해 형광 현미경으로 형광의 존재를 확인 (일반적으로 모든 롤러 동물은 GFP 긍정적인).
      참고: F2 롤러 유전자 변형 라인의 성공적인 세대를 나타냅니다. 개별 줄 수 있습니다, 예를 들어, transgene 전송 속도 관련. 그것은 따라서 유지 하 고 여러 라인을 저장 하는 데 유용.
    8. 마커 양성 동물에 대 한 새로운 번호판을 풍부 하 게 하 여 유전자 변형 라인 유지.
      참고: 삽입 된 DNA extrachromosomal 배열에서 생식에 통합 됩니다. Extrachromosomal 배열에 대 한 전송 속도 일반적으로 약 50%만 변수. 긴장을 잃고 하지, 그것은 수동으로 지배적인 마커 (예를 들면, 부정적인 선택에 의해 보안 되지 라인) 라인을 풍부 하 게 하는 중요 한 따라서.
    9. -80 ° C 19에서 장기 저장을 위한 표준 냉동 기술에 의해 유전자 변형 라인 동결.
      참고: Transgenes extrachromosomal 배열에도 통합 될 수 있는 생식으로 동질적인 라인 18를 추가 단계에서 UV 방사선에 의해. 예를 들어 음 1 음 1 + [+] 스트레인을 UV 방사선에 의해는 생식에 통합 되었다 fgIs2[erm-1p::erm-1;rol-6p::rol-6(su1006)] 모든 동물 transgene, RNAi 기반에 그것의 사용에 대 한 요구를 전달 하는 곳 상호 작용 화면 아래에서 설명 합니다. 이 긴장 또한 vha-1 p를 포함 하는 스트레인에 교차점을 통해 세포질 배설 운하 GFP에 의해 분류 되었다:: GFP transgene (동일한 절차에 의해 생성 된 위에서 설명한 대로, 기본 유전에 대 한 참조 20 참조 십자가 등 절차) 음-1 [+ +]; 라고 vha-1 p:: GFP 스트레인 아래.

2. RNAi 라이브러리 대상 및 운하 형을 수정 하는 RNAi 상호 작용 화면의 디자인

참고: 타겟된 RNAi 기반 유전자 상호 작용 화면 overexpression 낭 성 운하 형을 사용 하 여 설명 배설 작용에 대 한 검색 morphogenesis 유전자 운하. 음-1 + [+] 스트레인 (단계 1.2.9 참조) 예제 9 역할을 합니다. 이 이렇게 배설 운하 루멘 morphogenesis의 유전 분석을 위한 많은 가능한 방법의 한을 선물 한다 (다른 유전 접근에 대 한 소개 및 토론 참조). 함께 종이 장 tubulogenesis 3 및 참조 17 , , 21 22 RNAi, RNAi의 세부 사항에 대 한 배경 참조 절차, RNAi 강도 (종종 치명적인 tubulogenesis 유전자를 조정)의 변조 및 기술적인 문제의 토론 RNAi에 연결. 참조 표준 웜 문화 및 유지 보수, 자료의 테이블에 대 한 참조 19.

  1. 음-1 (또는 관심의 다른 유전자)에 대 한 검색 데이터베이스와 게시 된 기사에 있는 상호 작용 분자.
    참고: 잠재적인 음-1 인터 실험적 기능, 유전자, 또는 물리적으로 어떤 종에서 음 단백질 상호 작용을 표시 했다 또는 어떤 철에, 높은 처리량에서 예측 했다 모든 분자 포함 또는 시스템 생물학 접근 (데이터베이스 및 리소스의 예 표 3 참조).
  2. 모든 유전자의 목록을 생성 하 고 찾을 C. 선 충 homologs 필요한.
    참고: 보십시오 유전자 클래스, 관심사의 유전자의 기능을 고려 하 고 인터 식별에 대 한 그물을 넓혀에 확인 된 유전자의 목록을 확장 (예를 들어, 막 걸 링커 음-1에 대 한 모든 actins을 선택 하 고 말라 관련 분자).
  3. 식별 해당 RNAi 모든 유전자에 대 한 상업적으로 사용 가능한 게놈 넓은 세균성 RNAi 라이브러리에서 클론 먹이 세균 (예를 들어, Ahringer 게놈 C. 선 충 RNAi 라이브러리 21 먹이; 자료의 테이블)
  4. 잘 번호 해당 RNAi 접시와 그들의 모든 유전자에 대 한 스프레드시트를 생성.
  5. RNAi 클론 50 LB/암 피 실린/항생물질 접시 (항생제의 선택은 라이브러리 구조에 의해 결정 됩니다) 하루에 줄무늬가 있고 RNAi 라이브러리 생성 대상으로 될 때까지 계속 선택.
    참고: 라이브러리 크기에 따라 예상된 워크플로, 전체 라이브러리를 생성을 생략 하 고 직접 배치 분석 진행. 플레이트 4 ° C에서, 약 2 주 (필요한 경우, 그 후 새로운 접시에 다시 행진) 보다는 더 이상 저장할 수 없습니다. 반대로, 하나-80에 긴 기간 저장에 대 한 복제 96 잘 또는 384-잘 형태로 큰 냉동된 라이브러리를 생성할 수 있습니다 ° c.
  6. 하룻밤 37 ° C에서 접시를 품 어. 다음날 아침, 4에서 인큐베이터와 저장소에서 번호판을 제거 ° c.
  7. 선택 RNAi 박테리아 살 균 이쑤시개로 접시에서 혼합 박테리아 600 μ 1.5 mL microtube에 LB/암 피 실린 (50 ng/μ) 국물, 37 ° C에서 튜브를 품 어, 6 헤 대 한 동요
    참고:는 microtube의 측면을 따라 선택 (이 쑤 시 게 또는 micropipette 팁)을 문 지르고 하 여 국물에 RNAi 박테리아를 예방.
  8. 씨 70 μ 중복 되거나 triplicate 세트에서 6-잘 RNAi 플레이트의 각 음에 박테리아를 배양. 22 ° C에서 RNAi 접시를 밤새 품 어.
    참고: RNAi 접시 표준 절차 (테이블의 자료 및 참조 3 , , 17 21)에 의해 생성 되며, 여기 6 잘 조직에 운하 morphogenesis 접시에 살아있는 동물에서의 미세한 평가 대 한 허용 하는 더 높은 처리량 접근 방식에 대 한 문화 플레이트 형식.
  9. 다음 아침, 선택 3 L4 단계 음-1 [+ +]; vha-1 p:: GFP RNAi 플레이트의 각 음에 벌레.
      먼저 RNAi 방해 하는 (참조 19 참조) OP50 박테리아와 오염을 피하기 위하여
    1. 박테리아 없이 NGM 접시에 벌레 씨 고 약 10 분에 대 한 크롤 링 하는 동물. 만 비 굶 어 건강 한 동물을 사용.
  10. 자손을 생산 하는 동물을 허용 하는 3 d 22 ° C에서 번호판을 품 어.
  11. F1 자손 해 형광 현미경에서 검사 운하 고기.

3. Vivo에서 C. 선 충 Excretory 운하 형광 해 부 현미경 검사 법 그리고 Tubulogenesis 고기의 점수에 의해 이미징

  1. 준비 형 채 점 시트 (표 4에 표시 된 예제와 그림 5 ).
  2. 장소 바로 형광 dissectin 아래 벌레와 함께 한 천 배지g 현미경, 평가, 접시의 오픈 뚜껑 사용 초점을 더 낮은 확대.
    참고:이 프로토콜 1.5 X와 10 배 목표와 3.5에서 45 (자료 테이블)의 확대/축소 범위는 범위 사용에 설명 합니다.
  3. 잘 별도로 각각에 초점을 맞추고, 잘 1부터 시작 하 여 동물을 평가 하 고 접시에 아래로 일.
    참고: 항상 컨트롤의 평가 함께 시작 합니다. 예를 들어, mock (빈 벡터) 컨트롤 (HT115 RNAi 박테리아 (참조 참조 17 , 21) 없이 또는 비관련된 유전자 삽입) 부정 및 긍정적인 적절 한 제어 하는, 예를 들어에서 이 상호 작용 화면, 음-1 (음-1 + [+] 형 억제) 하는 RNAi 및 sma-1 / spectrin RNAi (음-1 + [+] 운하 형 강화).
  4. 먼저, 검사 일반 고기 밝은 빛 아래에서 볼 수 (예: 하자/치명적인, Clr/지우기, Emb/배아 치명적인, Ste/살 균, Unc/uncoordinated, Dpy/땅 딸 보, 등), 동물 및 수의 총 수를 계산 하 여 표현 형을 계량 표현 형을 가진 동물의 기록 번호 (표 4 참조).
    참고: 운하 고기 (예, Emb, Ste)의 평가 영향을 미칠 수 있습니다 결함을 일으키는 유전자의 knockdowns 고려 조건으로 실험을 반복, 게시물 배아 RNAi (참조 절차 3 종이 동반 ).
  5. 둘째, 형광 조명 아래에서 배설 운하 고기 검사, 같지는 고기 (예, 운하의 길이, 루멘, cysts의 폭) 점수, 숫자를 기록 및 채 점 시트에 고기를 설명 (표 4, 참조 하십시오 강력한 클래스 "xfig" = > 그림 5).
    참고: 높은 확대 범위 확대와 더 많은 미묘한 운하 고기 평가 하 필요 합니다. 낮은 확대 신중 하 게 평가 하는 운하 사이 앞뒤로 이동 ’ s 길이 폭 및 다른 운하 morphogenesis 표현 형. 부 량 또는 간단한 고기의 반 정량화, 포함 100 동물 (예를 들어이 타겟된 RNAi 스크린에 L4s; 고기: 채널 1/4, 1/2, 3/4의 길이 및 전체 후부 운하의 확장 및 후부 운하의 루멘 직경 작은 cysts (< 동물 폭의 1/3), 큰 cysts (> 동물 폭의 1/3); 표 4 참조).
  6. 현미경에 의해 적어도 3 다른 동물에서 주된 고기의 취득 이미지 탑재 디지털 전 하 결합 소자 (CCD) 카메라와 해당 이미징 소프트웨어 (재료의 표 참조)
    1. 이미지, 먼저 카메라에, 연결 된 컴퓨터를 켜고, 이미지 캡처 소프트웨어 아이콘 더블 클릭, 낮은 배율에서 수동으로 벌레 플레이트의 영역을 집중 하 고 켜십시오 카메라 셔터.
    2. 클릭는 “ 실시간 미리 보기 ” 화면에 벌레를 시각화 명확 하 게 클릭을 수동으로 초점을 조정 하는 아이콘의 컴퓨터 화면에 벌레를 시각화 하기 위해 컴퓨터 화면에 이미지 캡처 소프트웨어는 “ 스냅 ” 아이콘, 다음 클릭에 “ 저장 ” 아이콘.
      참고: 동물 형광 조명 아래에서 빠르게 이동 됩니다 따라서 계속 한 손으로 컴퓨터 마우스에 준비 접시는 다른 한 손으로 관심의 영역으로 이동 하는 동안. 즉시 클릭 합니다 “ 스냅 ” 아이콘 이미지를 얻으려고. 그것은 일반적으로 몇 가지 시도와 좋은 이미지를 획득 가능.
    3. 적절 한 파일 이름으로 획득된 이미지 저장 (스트레인 이름, RNAi 클론 이름 및 날짜 포함).
      참고: 얇고 긴 운하와 함께 빠르게 움직이는 야생-타입 벌레는 돌연변이 보다 이미지를 더 어렵습니다. 낭 성 운하 또는 다른 고기 돌연변이 이미징 촉진 천천히, 가능성이 있다. Rol 같은 플라스 미드 마커 수 이미징에 대 한 동물을 유지 하 여 “ 자리에 ” 보다는 이동 앞으로, 동물 자체에 주위 압 연과 표현 형에 있는 향상 된 보기를 제공할 수 있습니다.

4. C. 선 충 Excretory 운하 Confocal 레이저 스캐닝 현미경으로 높은 해상도 영상

면봉의 끝에 또는의 끝에
  1. 기름 또는 석유 젤리의 작은 금액을 놓고
    1. 살아있는 동물을 장착 합니다 손가락을 확산의 직경을 가진 ultrathin 원을 생성 하 그리스 ~ 6 – 깨끗 한 유리 슬라이드 중간 8 m m.
    2. 장소 6 μ 5 %lidocaine 솔루션 (마 취)는 micropipette에 의해 동그라미로.
      참고: lidocaine 재고 솔루션 lidocaine 가루 물에 용 해 하 여 만들 수 있습니다. M9 버퍼 19 (자료 테이블) 5%로 희석. 그것은 일반적인 동원 정지 솔루션 (예: 나트륨 아 지 드) 파열 cysts 원인과 그 운하 고기 유도 피하기 위해 배설 채널의 분석에 대 한 중요.
    3. RNAi 접시에서 여러 가지 동물을 선택 하 고 솔루션으로 웜 선택 19 immerging 여 lidocaine 솔루션으로 그들을 배치.
      참고: 선호 단계 특정 동물을 균일 한 두께 여도 장착을 용이 하 게 합니다를 선택 합니다. 동물 해 형광 현미경에 미리 선택 되어 있습니다.
    4. 유리 슬라이드에 22 x 22 mm coverslip 장소; 부드럽게 그리스 원에 정착 하자.
      참고: coverslip 운하 형태학, 특히 돌연변이 또는 운하와 가능 하 게 다른 고기 취급 RNAi 웜 손상 될 수 있습니다 어떤에 어떤 물리적 압력을 적용 되지 않습니다. 그것을 피하기 위해 두꺼운 그리스 원; 따라서 중요 한은 이상적으로 동물은 부드럽게 사이 끼여 유리 슬라이드와 커버 슬립.
    5. 젖 빛 유리 슬라이드에 샘플의 이름을 작성합니다. 바로 운하 형의 및 이미지 분석을 위한 공초점 현미경 슬라이드를.
      참고: 지연 운하 cysts의 손상 될 수 있습니다 또는 운하 루멘 형태학 변화.
  2. 시스템적 confocal 이미지
    1. 슬라이드 confocal 현미경의 샘플 단계에, 초점을 낮은 확대율 (10 배)에서 웜.
      2. 60 X / 100 X 목표 아래 보기와 선택
    2. 동물 검사 배설 운하 ’ s 세포 및 subcellular 고기, 예, 루멘 모양 및 직경, 크기와 모양 cysts; 또는 subcellular 구성 요소 분석, 대 한 분류의 예를 들어, 꼭대기/lumenal 막, 기저 막, 세포질, endosomal canalicular 소포 대, 다른 세포 (토론, 그림 2 및 그림 4 참조).
    3. 관심의 특정 표현 형의 취득 이미지.
      참고:이 프로토콜 검사 confocal 현미경 (자료 테이블) 레이저의 사용을 설명 합니다. 얇은 선 충 C. subcellular 구성 요소를 해결 하기 위해 배설 운하, 더 높은 확대 목표 (100 X 60 X)이 필요 합니다. 회전 디스크 confocal 현미경 시간 경과 이미지를 사용할 수 있지만 적은 confocality를 제공 합니다 (내용 참조).
      1. Confocal 이미지를 수집 하는 컴퓨터를 켜고, confocal 현미경 소프트웨어를 두 번 클릭 하 고 특정 레이저 아이콘 클릭 하 여 레이저를 선택.
      2. 클릭은 “ 스캔 ” 아이콘 컴퓨터 화면에 초점 맞춘된 웜 시각화을 통해 레이저 강도 조정 합니다 소프트웨어, 그리고 다시 클릭 “ 스캔 ” 아이콘 검색을 중지 한 후 클릭을 “ 캡처 ” 아이콘 이미지를 다음에 클릭을 “ 저장 ” 아이콘.
      3. 적절 한 파일 이름으로 이미지를 저장 하 고 RNAi 복제 이름, 날짜, 스트레인 이름 등.
        참고: 이미지는 단일 및 여러 섹션으로 취득 될 수 있다 (예를 들어, 10 – z 축 따라 15 섹션). 단면화 3D 시각화 수 있습니다. 투영 이미지 고 (현미경)에 따라 필요한 경우 별도로 저장 합니다. 최적 해상도 대 한 설정을 사용 하 여 레이저 낮은 이득, 작은 구멍을 너무 많이, 열 없고 여러 이미지 당 평균 추가 (참조에 대 한 일반적인 내용은 confocal 영상 23 , 24 참조). (가급적 사용 수정 되지 않은 이미지) 필요한 경우 이미징 소프트웨어에 의해 수정에 대 한 있도록 채도 수준 아래 밝기에서의 이미지 처리.
      4. 의 더블-이미지 또는 여러 레이저 아이콘을 클릭 하 여 같은 방식으로 레이블된 운하 (예: 녹색, 빨강, 그리고 파랑)를 곱하면 하지만 채널 (공동 지역화 연구에 대 한 중요 한) 사이 도련 통해 피하려고 순차적 검색 사용.
        참고: 하나 고려 (이 또한 결과에 해당 사진 표백 증가)를 순차적으로 검색 하는 데 필요한 시간 및 스캐너 설정을 수정 해야 합니다. 채널 형태에 난다 효과 방지 하려면 최대 30 분 이상에 대 한 하나의 슬라이드에서 동물을 검색 하지 않습니다. 더 이상 검색 하는 것이 필요한 경우 새 슬라이드를 탑재.
      5. 취득 해당 미분 간섭 광학 (DIC) Nomarski 이미지, 측정 하는 경우에 특히 운하 길이 루멘 직경 벌레에 관하여 / ’ s 몸 길이 직경. 클릭 하 여 오버레이 형광 및 Nomarski 이미지 “ 오버레이 ” 랜드마크를 보여주는 아이콘 ( 그림 1D 및 그림 4A – D).
    4. 정량화를 위한 ImageJ 소프트웨어 25 ( 그림 5C) 관심의 표시 구성의 형광 강도 측정.

결과

이 프로토콜에는 시각과 분자로 분석 단 세포 tubulogenesis 및 단일 셀에서 세포내 루멘 morphogenesis C. 선 충 배설 운하를 사용 하는 방법을 설명 합니다. 성인 기 중반 embryogenesis의 시간에서 그들의 확장, 동안 4 개의 배설 운하 그들의 basolateral 및 그들의 canalicular 및 endosomal endomembrane 시스템을 제공 하는 독특한 모델을 함께 꼭대기/lumenal 막 확장 계속 드 노 보 의 <...

토론

C. 선 충 유전 다양성, 투명성, 간단한 몸 계획, 고정 세포 계보는 우수한 morphogenesis의 분석 모델 만들. 이 프로토콜 표준 유전 조작 및 이미징 결합 하는 방법을 설명 합니다 2 미크론의 활용 연구 얇은 편광된 막과 세포내 루멘 속 단일 셀 튜브에서 연구 선 충 C. 배설 운하.

라벨
C. 선 충 배설 운하 허용 하는 라이브 분석 (여기에 설명 된), 형?...

공개

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

감사의 말

우리 엠 부 (캔자스의 대학, 캔사스, 미국), K. Nehrke (로체스터 대학 의료 센터, 로체스터, 뉴욕, 미국), 꼬마 유전학 센터, 건강의 국가 학회, 연구 인프라의 투자 감사 프로그램 (P40 OD010440)입니다. 이 작품은 NIH GM078653, MGH는 224570 V.G.에 SAA 223809 교부 금에 의해 지원 되었다

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Cloning
Plasmid pPD95.75AddgeneCat. No. 37464
PCR KitQiagenCat. No. 27106
Ligation kitNew England BiolabsCat. No. E2611L
DNA markerThermo ScientificCat. No. SM1331
Agarose DNA gradeFisher ScientificCat. No. BP164-100
Competent cellsNew England BiolabsCat. No. C2987H
TrisFisher ScientificCat. No. BP154-1
EDTASigmaCat. No. ED-1KG
Acetic acidFisher ScientificCat. No. A38S-500
Ethidium bromideFisher ScientificCat. No. BP1302-10
Equipments
PCR machine MJ ResearchCat. No. PTG-200 
CentrifugeEppendorf Cat. No. 5415C
Water BathPrecision Scientific Cat. No. 666A3 
Gel running instrumentFisher ScientificCat. No. 09-528-165
Gel running power supplyFisher ScientificCat. No. 45-000-465
Molecular Imager Gel Doc XR SystemBio-RadCat. No. 1708195EDU
Nanodrop SpectrophotometerThermo ScientificCat. No. ND1000
C. elegans related11see reference27 for standard C. elegans culture and maintenance procedures.
LB Medium and plates22see reference24 for protocols.
Tryptone Acros OrganicsCat. no. 611845000
Yeast ExtractBD BiosciencesCat. no. 212750
NaClSigmaCat. no. S7653
Bacto Agar BD BiosciencesCat. no. 214040
AmpicillinSigmaCat. no. A0116
TetracyclineFisher ScientificCat. no. BP912
M9 Medium22see reference24 for protocols.
NaClSigmaCat. no. S7653
KH2PO4SigmaCat. no. P0662
Na2HPO4SigmaCat. no. S7907
MgSO4SigmaCat. no. M2773
NGM plates 22see reference24 for protocols.
NaClSigmaCat. no. S7653
Peptone BD BiosciencesCat. no. 211677
Tryptone Acros OrganicsCat. no. 611845000
Bacto Agar BD BiosciencesCat. no. 214040
MgSO4SigmaCat. no. M2773
CaCl2SigmaCat. no. C3881
Cholesterol SigmaCat. no. C8667
K2HPO4 SigmaCat. no. P3786
KH2PO4SigmaCat. no. P0662
RNAi plates33see reference60 for protocols.
NaClSigmaCat. no. S7653
Peptone BD BiosciencesCat. no. 211677
Tryptone Acros OrganicsCat. no. 611845000
Bacto Agar BD BiosciencesCat. no. 214040
MgSO4SigmaCat. no. M2773
CaCl2SigmaCat. no. C3881
Cholesterol SigmaCat. no. C8667
K2HPO4 SigmaCat. no. P3786
KH2PO4SigmaCat. no. P0662
IPTG US BiologicalCat. no. I8500
CarbenicillinFisher ScientificCat. no. BP2648
NaOHFisher ScientificCat. no. SS266-1
Sodium hypochloriteFisher ScientificCat. no. 50371500
Bacteria
OP50 bacteriaCGC
HT115 bacteriaCGC
Genome-wide RNAi libraries
Ahringer genome-wide RNAi feeding library (ref29,49)Source BioScience
C. elegans ORF-RNAi feeding library (ref50)Source BioScience
Imaging related
LidocaineMP Biomedicals,LLGCat. no. 193917
Materials
Vacuum Grease SiliconeBeckmanCat. no. 335148
Microscope slides Fisher ScientificCat. no. 4448
Microscope coverslips (22×22-1）Fisher ScientificCat. no. 12-542-B
Tissue culture plate, 6 well Corning Inc.Cat. no. 08-772-33
Equipment
SMZ-U dissecting microscope (Nikon)
SZX12 dissecting microscope (Olympus), equipped with a high-power stereo fluorescence attachment (Kramer Scientific), CCD camera with Q capture software and X-Cite fluorescent lamp (Photonic Solutions).
TCS SL Laser-scanning confocal microscope (Leica Microsystem)
C2 laser-scanning confocal mounted on an ECLIPSE Ti-E inverted microscope (Nikon)

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