התעלה Excretory C. elegans כמודל עבור מורפוגנזה לומן תאיים ו Vivo ב מקוטב ממברנה להן בתא יחיד: תיוג על ידי התכה GFP, RNAi אינטראקציה עם המסך הדמיה

Summary

התעלה excretory C. elegans הוא מודל תא בודד ייחודית לניתוח חזותי ויוו של דה נובו מקוטב ממברנה להן. פרוטוקול זה מתאר שילוב של גישות, וישימה זיהוי ואפיון של מולקולות בימוי חד־תאיות tubulogenesis, הפסגה להן קרום ו לומן סטנדרטי גנטי/RNAi והדמיה.

Abstract

התעלות excretory 4 C. elegans הינם צינורות צרים מורחב לכל אורך החיה של תא בודד, עם endotubes תאיים כמעט באותה מידה רחוק מורחב זה לבנות ולייצב את לומן עם קרום, submembraneous שלד התא אופי הפסגה. התא excretory מרחיבה את אורכו כ 2000 פעמים ליצירת תעלות אלו, מכין מודל זה ייחודי להערכה ויוו של דה נובו מקוטב ממברנה להן, מורפוגנזה לומן תאיים ו חד־תאיות tubulogenesis. פרוטוקול המוצגת כאן מראה כיצד לשלב תקן תיוג, רווח, הפסד-של-פונקציה גנטית או התערבות ב RNA (RNAi)-, וגישות מיקרוסקופיים לשימוש מודל זה כדי לנתח באופן חזותי ולנתח באופן פונקציונלי תהליכים אלה ברמה המולקולרית. כדוגמה של גישה תיוג, הפרוטוקול מתאר את הדור של חיות הטרנסגניים עם חלבונים פיוז'ן פלורסנט לניתוח בשידור חי של tubulogenesis. כדוגמה של גישה גנטיים, זה מדגיש את נקודות המפתח של חזותי מבוסס-RNAi אינטראקציה מסך המיועד לשינוי הפנוטיפ רווח-של-הפונקציה לתעלה פיברוזיס. הן השיטות הספציפיות תיאר כיצד: תווית והמחש התעלות בהבעת פלורסנט חלבונים; לבנות ספרייה RNAi יישוב ו אסטרטגיה RNAi הקרנת לניתוח מולקולרית של תעלת מורפוגנזה; מבחינה ויזואלית להעריך שינויים של תעלת פנוטיפים; ציון אותם על ידי לנתח פלורסצנטיות מיקרוסקופ; לאפיין את תעלת subcellular הרכיבים ברזולוציה גבוהה יותר על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית; ולכמת פרמטרים חזותי. הגישה היא שימושית עבור החוקר מעוניין ניצול תעלת excretory C. elegans עבור זיהוי ואפיון גנים המעורבים בתהליכי phylogenetically שנשמרת לומן תאיים ו חד־תאיות מורפוגנזה שפופרת.

Introduction

כל האיברים הפנימיים מורכבים של צינורות, חיונית עבור שלהם פונקציות שונות, כגון תחבורה, חילופי גזים, נוזלים וחומרים מזינים, את הפרשת פסולת מטבולית. אופיים מקוטב, עם ממברנות הפסגה, lumenal ברורים, מותאמת עבור פונקציות ספציפיות אלה, ויש פגמים להן המערכות שלהם אנדו - ואת קרום פלזמה הגורם השכיח של מחלות אנושיות^1,2. הרוב המכריע של צינורות של להערכת ושל האיברים הפנימיים הם multicellular ויוצרים לומן intercellularly; עם זאת, חד־תאיות צינורות, היוצרים לומן intracellularly, ניתן, לדוגמה, לייצג בדיוק כמו 30%-50% של מיטות נימי האנושי². הממברנות מקוטב של רב - וצינורות חד־תאיות דומים בהרכב, למרות microdomains שלהם עשויים להיות שונים בהתבסס על התפקוד המסוים של הצינור (למשל, תעלת excretory canaliculi לעומת microvilli מעיים ב Caenorhabditis elegans; ראה המלווה נייר על tubulogenesis מעיים C. elegans )³. עקרונות להן קרום מקוטב tubulogenesis נשמרים בין metazoans, מכונות מולקולרי דומה ומכוונת אותם^1,2,4.

מערכת excretory C. elegans מורכב של חמישה תאים: תא excretory (EC), צינור תא (DC), הנקבוביות התא (PC) ואת שני תאים בלוטת. אבלציה של EC, DC או PC גורמת להצטברות נוזלים לתוך חלל הגוף ולמות חיות את הפרפרים והעשים מוקדם⁵. מסקרן, אלה שלושה צינורות חד־תאיות ליצור שלהם לומן בשלוש דרכים שונות: על ידי תא הולו (EC); תא גלישת בשילוב עם היווצרות צומת autocellular (PC); על-ידי גלישת תא ביחד עם autofusion (DC); מנגנונים שונים של לומן מורפוגנזה כי הם phylogenetically שנשמרת^6,כל⁷. EC, הממוקם בצד הלטראלי השמאלי של הנורה בלוע האחורי, שולח שתי הרחבות לרוחב אשר התעלות ארבע להתרחב להאריך anteriorly, posteriorly (בצד שני מימין ומשמאל) קצה האף של התולעת וזנב , בהתאמה (איור 1)^5,6,8. EC נמשך כ 1 מיקרומטר 2 x 1,000 מיקרומטר, שהופך אותו התא הגדול ביותר החיה. ברמה subcellular, התעלה excretory הוא צינור פשוטה, המופקים קרום הבסיס מכוונים את pseudocoelom, ואת חפר על ידי קרום lumenal (endotube). קרום lumenal תעלת מתחבר צינור קרום lumenal בצומת רק המערכת שלה; התעלות הן אחרת junctionless לאורך שלהם אורכי (איור 1). קרום lumenal תעלת excretory שלד התא שלו submembraneous הם הפסגה, שהוגדרו על-ידי ההרכב המולקולרי שלהם, הדומה ההרכב של קרום הפסגה, שלד התא submembraneous צינוריות multicellular, כגון המעי, ושל אחרים (למשל, שטוח) epithelia. Organelles cytoplasmic, כולל endosomal vesicular, אחרים (למשל, גולג'י) endomembranes מופצים לאורך התעלה. בנוסף, שלפוחית canalicular מרובים - מחובר ממברנה lumenal, ו/או מחוברים או מבודד - מושחלים דרך תעלת הציטופלסמה^7,8,9,10 . חיבור פלזמה-ממברנה/canalicular דינמי זה עוד יותר מרחיבה את מערכת קרום של התעלה ותורם בשני לומן מורפוגנזה ו- osmoregulation¹⁰. התעלה excretory וכך מורכב כמעט כולו אנדו - ממברנות פלזמה, מתן מודל מצוין עבור הניתוח של קרום מקוטב להן ועל ויסות אנדו-ממשק קרום פלזמה. הרחבה דרמטית של קרום הפסגה במהלך מורפוגנזה תעלת - במערכת זו תא בודד חופפת לומן סיומת – גם מאפשרת לנתח את הבעיות אדריכלי הנובעים על ידי צורך לייצב ובאמצע של הממברנה lumenal תאיים . פרוטוקול זה מתמקדת על הניתוח של מורפוגנזה מבנית של התעלה צינור של לומן, את הדינמיקה ממברנה תאיים הדרושים עבור תהליך זה, ולא על האותות לכוון את התנועות תאים המייצרים בעמדה של EC מערכת excretory ולבנות אתהקשרים מורכב מאלמנטים אחרים התאית (נבדקה ב⁶).

יתרון נוסף של המערכת תעלה תא בודד C. elegans לניתוח של קרום מקוטב, לומן תאיים להן הוא היכולת להפריד, בזמן התפתחותית, הדור של מרכיבים שונים של ממברנות שלה לעיקולים ומעברים. הנציבות האירופית נולד בזמן הסגר הגחון לבין מתיישב ventro-רוחבית של הלוע במהלך אמצע מופרה^5,6,8, שבמהלכן זמן לרוחב התעלה והסיומת מסעף לבצע. זה ואחריו תעלת הקדמי-אחוריים סיומת במהלך מופרה מאוחר, תהליך הנמשך אל תוך L1-הזחל (איור 1). זחל בימיו, הקצה האחורי התעלה מגיע בערך באמצע של התולעת, מלא לכיוון הזנב בסוף השלב L1, לאחר זמן תעלת מאריך יחד עם תולעת⁸. תעלת פעיל הצמיחה במהירות העולה על זה של הצמיחה של החיה ובכך מסתיימת בשלב הזחל הראשון, עם זאת, בהמשך צמיחה מתרחשת במקביל עם הצמיחה של כל החיות הזחל נוספים (L2 – 4). הגדרה זו מספקת את ההזדמנות כדי לנתח שלבים שונים של דה נובו מקוטב להן קרום עצמאית של חלוקת התא מקוטב או העברה. יתר על כן, הוא מאפשר את ההפרדה של תהליך זה מההרכבה של צמתי (אשר מתרחשים העובר לפני תחילתן לומן); דרישה המדויק שלהם בתוך הממברנה קיטוב הוא עדיין שאלה פתוחה בשטח קוטביות. בסופו של דבר, זה ייחודי מפריד הפסגה של התרחבות קרום הבסיס, התהליך האחרון שלפני לשעבר תעלות excretory¹⁰. המודל תעלת excretory C. elegans ולכן הוא מהווה השלמה אינפורמטיבי במיוחד למודל מעיים משתף מספר יתרונות אלה לניתוח של קרום מקוטב להן אך מבוצע זה באווירה multicellular (ראה העיתון הנלווה על מעיים tubulogenesis³).

למרות פראי-סוג תעלות בקוריאנית ודק במיוחד בתולעת קטנה זו, לומן שלהם יכול להיות השישיsualized ישירות על-ידי Nomarski אופטיים בחיה שקוף. למעשה, ניתן לאפיין מורפולוגיות תעלת פיברוזיס המוטציות בבעלי ללא תווית באמצעות הגדלה נמוכה לנתח מיקרוסקופ, אשר שימש אפקט נהדר במסכים גנטי קדימה כדי לזהות גנים המעורבים tubulogenesis¹¹. ויזואליזציה משופרת של המורפולוגיה של תעלות, ההבחנה של הקרומים מקוטב שלהם, רכיבי cytoskeletal, organelles תאיים שונים ומבנים אחרים subcellular, עם זאת, דורש תיוג, גבוה יותר כוח פלורסנט ויבתר ו קונאפוקלית מיקרוסקופ. למרות המבנה הדק של התעלות מציב מספר קשיים על תיוג, מיקרוסקופ, ממברנות ורכיבים subcellular ניתן להבחין דרך ייחודית כל תא מולקולות ספציפיות, בעלי חיים יכול להיות בבטחה מותקן עבור מיקרוסקופ אם זהירות מסויימים נלקחים כדי למנוע החדרת חפצים (ראה פרוטוקול של דיון). תיוג יכול להיעשות אימונוהיסטוכימיה בדגימות קבוע, או על ידי יצירת תולעים הטרנסגניים המבטאים חלבונים פיוז'ן פלורסנט תחת השליטה של משלהם או excretory היזמים תעלת ספציפי עבור הדמיה ויוו . פרוטוקול זה מתאר את שיטת תיוג האחרון (ראה את העיתון הנלווה tubulogenesis מעיים עבור נוגדן מכתים³).

היכולת לשלב ויוו הפסד או רווח-של-פונקציה לימודים עם ויוו הדמיה האנליזה התא הבודד רמה לאורך כל גורם פיתוח התעלה excretory C. elegans מודל חזק במיוחד מולקולרית ו ניתוח הסלולר של חד־תאיות tubulogenesis. קדימה או אחורה מסכי גנטי יכול להתבצע החל חיה הטרנסגניים פראי-סוג או שכותרתו לזהות תעלת מורפוגנזה פנוטיפים (למשל, ציסטות) פגמים הגן הבסיסי שלהם. לחלופין, מסכי כזה ניתן להתחיל עם הפנוטיפ המוטנטי (למשל, תעלה פיברוזיס), לזהות מדכאי או משפרי של פנוטיפ זה לזיהוי גנים המקיימים אינטראקציה פונקציונלית עם הגן הגורם של פנוטיפ מוטציה. הפגם הגנטי גורם של פנוטיפ מוטציה יכולה לגרום לאובדן (למשל, via -ג'ין מחיקה) או רווח (למשל, באמצעות מוטציה הפעלת או דרך המבוא של ג'ין עודף עותקים) של הפונקציה ובדוקים. מוטגנזה מכוונת קדימה או מסכי RNAi שיטתית ללא דעות קדומות על תפקוד הגן, מאפשרות זיהוי גנים המעורבים בפונקציה של עניין לא משוחדת. לאור זמינותו של ברמת הגנום RNAi האכלה ספריות, כמעט בכל גן יכול להיות בקלות הפיל ידי RNAi ב- C. elegans, כך גנטית יחיד בכל עניין או כל קבוצה של גנים (למשל, במסכים יישוב) יכול גם להיות במהירות ובחן על השפעתם בגישה הפוכה גנטיקה. להפגין שילוב אפשרי של גישות, כאן נתאר מסך יישוב אינטראקציה RNAi, החל מוטנט רווח-של-הפונקציה לתעלה excretory פיברוזיס, המסומנת חלבון פלואורסצנטי ירוק cytoplasmic התעלה (GFP). פנוטיפ מוטציה נוצר על ידי ביטוי של אמ-1, שנשמרת מאוד C. elegans ortholog של משפחת מקשר ממברנה-אקטין אזרין-Radixin-Moesin (ERM), אשר היה מעורב מורפוגנזה לומן, ממברנה ארגון מינים רבים¹². C. elegans ERM-1. רגישה לממברנות lumenal של איברים פנימיים, כגון excretory תעלת המעי, ו נדרש עבור לומן היווצרות שני¹³. ביטוי ERM-1 מגייס אקטין עודף ושלפוחיות על קרום תעלת lumenal, הגדלת השטף לתוך לומן, הפקת תעלה פיברוזיס קצר ואת קרום lumenal הכיווץ אקטין מעובה פרווה⁹. הפרוטוקול מתאר כיצד ליצור זנים הטרנסגניים עם excretory הביע תעלת שכותרתו פיוז'ן חלבונים (או חלבונים אחרים); כיצד לבצע יישוב מסכי RNAi החל זנים כאלה, כדי לזהות מודיפיקטורי הפנוטיפ התעלה; ואיך לנתח את התוצאות של מסכים כאלה באופן חזותי באמצעות מיקרוסקופ ויבתר ו קונאפוקלית פלורסצנטיות, כולל דרכים פשוטות כדי לכמת פנוטיפים tubulogenesis אינפורמטיבי. ניתן למצוא חלופה תיוג הפרטים של RNAi, התרגלו הגנים tubulogenesis לעתים מזומנות קטלנית, וטכניקות בעיתון הנלווה על מעיים tubulogenesis³. כל השיטות יכול לשמש בשילובים שונים עבור החקירה של שאלות נוספות על תעלת tubulogenesis.

Protocol

1. תיוג התעלה Excretory C. elegans מאת חלבונים פיוז'ן פלורסנט ¹⁴

הערה: לראות את הנייר הנלווה על מעיים tubulogenesis ³ סימון על-ידי בחיי עיר נוגדן מכתים הליכים ומצוידת התעלה excretory. ראו טבלה 1 לדוגמאות של מולקולות הוכח שימושית ליצירת אפקטים של C. elegans תעלת excretory אנדו - ו ממברנות פלזמה, שולחן 2 לדוגמאות של היזמים שנוסעים ביטוי התעלה excretory, ו טבלה 3 עבור משאבים עבור אוספי מקיף יותר של סמנים, היזמים, כולל הפניות דנים את מבחר שונה fluorophores.

1. בניית רקמות פלסמידים סמן פלורסנט ספציפיים על-ידי אנזים הגבלה המבוסס על שיבוט ¹⁵
   הערה: ראו דיון על טכניקות חלופיות לבנות פיוז'ן פלורסנט חלבונים.
   1. זיהוי הרצף של האמרגן (עבור fusions תעתיק) או של הגן כל עניין עם האמרגן שלה (עבור translational fusions) ב- WormBase ⁴⁴.
      הערה: עבור היזמים, כ 1 – 3 kilobase (kb) מספיקה עבור מרבית הגנים C. elegans. ניתן לבנות חלבונים פיוז'ן translational גם על-ידי הצבת הגן עניין תחת יזם ספציפי תעלה excretory (ראה טבלה 2).
   2. עיצוב ואחורה צבעי יסוד הגברה של האמרגן (עבור fusions תעתיק) ו/או גן מלא עם יזם (עבור translational fusions). להוסיף אנזים הגבלה linkers-5 ’, 3 ’ קצוות תחל.
      הערה: בחר אנזימי הגבלה הנוכחים וקטור פלסמיד (למשל, pPD95.79) ¹⁶. עבור translational fusions, 3 ’ מקשר (linker) צריך להיות מתוכנן כך לאחר עיכול אנזים הגבלה מצדו עם וקטור, המסגרת codon הוספה יהיה רציף עם codons של fluorophore, למשל, ה-GFP. אחד ייתכן שעליך להוסיף 1 או 2 בסיסים נוספים linkers אנזים הגבלה טיפוסית ¹⁴; להקפיד כדי לא ליצור stop codon.
   תגובת שרשרת
   3. בצע פולימראז (PCR) כדי להגביר את יזם או גנים באורך מלא באמצעות תולעים חיות או פראי-סוג הדנ א cDNA כמו תבנית ¹⁵.
      הערה: בעת שימוש תולעים כתבנית, תחילה lyse תולעים פירוק מאגר (PCR מאגר בתוספת Proteinase K) ¹⁷. שלב מעורב תולעים יכול לשמש כתבנית. תולעים מורעבים יכול לשמש כדי למנוע זיהום חיידקי לדנ א.
   4. בצע agarose (1%) ג'ל אלקטרופורזה על מוצרים PCR לזיהוי הגודל הנכון של המוצר מוגבר.
      הערה: אם במידה נכונה, המשך לשלב הבא. אם להקות מרובים נוצרים, לשפר תנאים הגברה לייצר הלהקה יחיד. אם זה לא עובד, לחתוך את הלהקה הנכון של הג'ל, לטהר את ה-DNA על ידי בשיטות הרגילות ¹⁵ ולאחר מכן המשך עם הצעד הבא.
   5. בצע תקציר ההגבלה על המוצר PCR ועל את פלסמיד וקטור שמכיל את fluorophore (למשל, pPD95.79) צינורות נפרדת באמצעות בשיטות הרגילות ¹⁵.
   6. להפריד את DNAs מתעכל על ידי אלקטרופורזה בג'ל, elute את המוצר PCR, וקטור DNA להקות צינורות נפרדת.
   7. לטהר את DNAs של ג'ל פרוסות על-ידי שיטות תקן ¹⁵. למדוד את ריכוז הדנ א על ידי ספקטרופוטומטרים.
   8. מאתרים ומפסיקים את המוצר PCR, וקטור DNA על ידי בשיטות הרגילות, להפוך את DNAs רקומביננטי תאים המוסמכת על ידי בשיטות הרגילות ¹⁵.
   9. התפשט 10 μL, 50 μL ו- 100 μL של התאים טרנספורמציה על שלוש צלחות מרק לוריא (LB) בודדים בתוספת 50 אמפיצילין μg/mL-
      הערה: להפיץ כמויות שונות של תאים על גבי לוחות שונים עבור קשת של טרנספורמציה היעילות. למשל, ציפוי גם בצפיפות אינו רשאי לאפשר את הבידוד של המושבות אם השינוי הוא יעיל.
   10. דגירה הלוחות ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. למחרת בבוקר, להוציא את הצלחות מן החממה.
       הערה: אם המושבות הם קטנים מאוד, תקופת דגירה של כמה שעות.
   11. הכן פלסמיד DNAs מן המושבות יחיד על ידי שיטות תקן ¹⁵. לערבב תבנית DNA ו תחל, ולשלוח. עבור רצף (בדרך כלל מתבצעות במרכז שירות הליבה).
   12. לקרוא את רצפי, לוודא את תקינות הבונה פיוז'ן.
       הערה: קריטית: לאשר את המסגרת הנכונה codon בין גנים שנוספו סמן פלורסנט ג'ין עבור תרגום fusions. באופן אידיאלי, רצף הגן כולו כדי לאשר כי אין מוטציה הוצגה ה-PCR ושגרות מצדו.
   13. לייצר יותר פלסמיד ה-DNA (באמצעות שלב 1.1.11) של הזרקת עבור שלב 1.2.
2. דור של חיות הטרנסגניים מאת microinjection של ה-DNA של טרנספורמציה germline ¹⁸
   הערה: ראו הדיון על טכניקות חלופיות עבור היכרות עם transgenes. ההליכים מחולקת לרמות יכול לשמש כדי ליצור חיות הטרנסגניים שנושאים חלבון כימרי של זריחה או כל חלבון אחר עניין. למשל, חלבון אקסוגני יכול להיות הציג לאחרונה (למשל, ortholog heterologous) או יכול להיות שבקנדה (למשל, שלה מוטציה germline המתאימה לחילוץ) או overexpressed ליצירת הפנוטיפ (למשל, הזרקת חלבון אנדוגני erm - 1 שימש ליצירת פנוטיפ תעלת פיברוזיס של ביטוי המשמש כיעד עבור שינוי המסך אינטראקציה RNAi המתוארים להלן).
   1. מיקס לבנות DNA (1 – 50 ng/μL) עם סמן פלסמיד DNA (בדרך כלל 100 ng/μL), למשל סמן דומיננטי rol-6 (su1006) (ראה 1.2.3 עבור אפשרויות סמן).
      הערה: קריטית: ריכוז ה-DNA מוזרק להיקבע מדעית כדי למנוע את כניסתה של פנוטיפים artefactual (ציסטות, סיומת פגמים, lethality) כאשר ביטוי גנים התעלות excretory כי הם במיוחד רגיש הביטוי של transgenes. אפשר, למשל, להכין מספר תערובות של פלסמידים בריכוזים של 1 ng/μL, 10 ng/μL, 50 ng/μL ו- 100 ng/μL עם ng/μL 100 rol-6(su1006) לבחון את מגוון של ריכוזים לדור של זן בר קיימא עם הביטוי הרצוי או פנוטיפ (ריכוזים גבוהים עלולים להיות רעילים הלא ספציפית עבור תעלת מורפוגנזה ו יכול להיות קטלני).
   2. לסנן את התערובת דנ א דרך 0.22-μm (מיקרומטר) נקבובית גודל ספין-x צנטריפוגה צינור מסנן.
      הערה: אל תשאירו את המכסה של הצינור הפתוח כדי למנוע אבק שיכול לחסום את המחטים microinjection.
   3. Microinject פלסמידים רקומביננטי לתוך בלוטת המין של תולעים פראי-סוג או מוטציה על ידי בשיטות הרגילות לשינוי germline (ראה התייחסות ¹⁸ לפרטים הליך).
      הערה: תקן סמן פלסמידים הן, למשל: rol-6(su1006), dpy-20, unc-119, פא-1. Transgenes דומיננטי כמו rol-6(su1006) יוכנסו פראי סוג התולעים, ואילו transgenes להציל יוכנסו מוטציות המתאימים שלהם. סמן פלסמידים הן מוזרק משותפת עבור תחזוקה קלה של הקווים הטרנסגניים מאז extrachromosomal transgenes אובדים באופן אקראי במהלך חלוקת התא (ראה 1.2.8). כאשר הזרקת גנים קידוד עבור fluorophore fusions, אחד ניתן להשתמש גם את fluorophore, ה-GFP, המתקרא סמן. rol-6 המניע תולעים להתגלגל עצמם שבדרך כלל יתרון על ההערכה של פנוטיפים מורפוגנזה.
   4. תולעים העברה מוזרק אל Escherichia coli נזרע צלחות תולעים נימיות צמיחה בינוני (NGM) (למשל, פלטה/תולעים 5) (ראה התייחסות ¹⁹ עבור תקן C. elegans תרבות ושגרות אחזקה, טבלה של חומרים).
   5. דגירה הלוחות ולתת רומא לפתח ב- 20 ° C כ 3 ד
   6. לבחון הוא צאצא F1 תחת המיקרוסקופ ויבתר Rol תולעים (מתגלגל) (או כל הזרקה ספציפי הסמן השני, למשל GFP) ולבחור רולים tלוחות בודדים o.
   7. בחר צלחות עם מתגלגל F2 חיות ואשר נוכחותם של קרינה פלואורסצנטית תחת מיקרוסקופ פלורסצנטיות ויבתר (בדרך כלל כל החיות רולר הם GFP חיובי).
      הערה: F2 רולים מציינים הדור מוצלחת של קו מהונדס. שורות בודדות עשויה להיות שונה, למשל, לגבי קצב השידור transgene. לכן זה שימושי כדי לשמור ולאחסן כמה שורות.
   8. לשמור על הקווים הטרנסגניים על ידי העשרת את לוחיות הרישוי לבעלי סמן-חיוביים.
      הערה: ה-DNA מוזרק הוא שולב את germline כמערך extrachromosomal. קצב שידור עבור מערכים extrachromosomal הם משתנה אבל בדרך כלל בסביבות ~ 50%. כדי לא לאבד את המתח, לכן זה קריטי להעשיר באופן ידני קווים עם סמנים דומיננטי (למשל, קווים שאינו מאובטח על-ידי בחירה שלילי).
   9. להקפיא שורות הטרנסגניים בטכניקות מקפיא רגיל לאחסון לטווח ארוך ב-80 מעלות צלזיוס ¹⁹.
      הערה: Transgenes במערכים extrachromosomal גם ניתן לשלב את germline על ידי הקרנת UV ב צעד נוסף להניב הומוגני שורות ¹⁸. לדוגמה, erm-1 השתלב את germline על ידי הקרנת UV כדי להשיג את המתח ERM-1 [++] fgIs2[erm-1p::erm-1;rol-6p::rol-6(su1006)] שבו כל חיה נושאת את transgene, דרישה עבור השימוש בו מבוסס על RNAi אינטראקציה עם המסך המתוארת להלן. זן זה סומן בנוסף על ידי תעלת excretory cytoplasmic GFP דרך מעבר בזן המכיל vha-1 p:: GFP transgene (שנוצר על ידי אותם הליכים, כפי שתואר לעיל; ראה הפניה ²⁰ לטירונות גנטי הליכים כגון צלבים) מתייחסים אליה כאל ERM-1 [++]; vha-1 p:: זן GFP למטה.

2. בניית ממוקד בספריה RNAi וכן העיצוב של המסך האינטראקציה RNAi לשינוי הפנוטיפ תעלת

הערה: מסך האינטראקציה הגנטית מבוסס-RNAi יישוב מתואר המשתמשת של פנוטיפ תעלת פיברוזיס ביטוי כדי חיפוש של אינטראקציה excretory תעלת מורפוגנזה גנים. המתח ERM-1 [++] (ראה שלב 1.2.9) משמש דוגמה ⁹. גישה זו מציגה רק באחד גישות אפשריות רבות עבור ניתוח גנטי של תעלת excretory לומן מורפוגנזה (ראו מבוא ודיון. גישות גנטיות אחרות). ראית את העיתון הנלווה על tubulogenesis מעיים ³ והפניות ^{17 , 21 , 22} על רקע על RNAi, הפרטים של RNAi נהלים, אפנון של כוח RNAi (מותאם הגנים tubulogenesis לעתים מזומנות קטלנית) ודיון של בעיות טכניות מחובר RNAi. ראה התייחסות ¹⁹ תרבות תולעת רגיל, תחזוקה, טבלה של חומרים.

1. לחפש ERM-1 (או אחרות הגנים עניין) מולקולות שמעצבת מאגרי מידע, מאמרים-
   הערה: פוטנציאל ERM-1 interactors יכלול כל מולקולות אשר הוצגו ניסיוניים מבחינה תפקודית, גנטית או פיזית אינטראקציה עם חלבונים ERM בכל מין ו/או כהכרחיים לעשות זאת באמצעות כל סיליקו, תפוקה גבוהה או ביולוגיה מערכתית לגשת (ראו טבלה 3 לדוגמאות של מאגרי מידע ומשאבים).
2. ליצור רשימה של כל הגנים ולמצוא את homologs C. elegans כאשר נדרש.
   הערה: שקול הרחבת רשימת הגנים שזוהה כיתות גן, אשר לוקח בחשבון את הפונקציה של הגן עניין ומצרה את הרשת לזיהוי interactors (למשל, עבור מקשר ממברנה-אקטין ERM-1, בחר כל actins ו מולקולות הקשורות אקטין).
3. לזהות את חיידקי האכלה שיבוטים זמינים מסחרית הגנום כולו חיידקי RNAi ספריות עבור כל הגנים המתאימים RNAi (למשל, Ahringer גנומית C. elegans RNAi האכלה ספריית ²¹; טבלה של חומרים)
4. ליצור גיליון אלקטרוני עבור כל הגנים שלהם צלחת RNAi המתאימה ואת מספר טוב.
5. לבחור בעירום ~ 50 RNAi שיבוטים על צלחות ליברות/אמפיצילין/טטרציקלין (בחירה של אנטיביוטיקה נקבעת על-ידי בניית ספריה) ליום ואת המשך עד ממוקד RNAi ספריית נוצר.
   הערה: בהתאם גודל הספרייה זרימת העבודה המתוכננת, להשמיט יצירת ספרייה מלאה ולהמשיך ישירות עם ניתוח אצווה. ניתן לאחסן צלחות ב 4 ° C, לא יותר כשבועיים (במידת הצורך, מחדש בעירום על גבי לוחיות הרישוי אחרי זה). לעומת זאת, אחד ניתן ליצור ספריות קפוא גדולים יותר בתבניות 96-ובכן או 384-ובכן שכפל עבור אחסון לטווח ארוך ב-80 מעלות צלזיוס
6. דגירה הלוחות ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. למחרת בבוקר, להסיר את הלוחות של חממה וחנות ב-4 מעלות צלזיוס
7. RNAi לאסוף חיידקים מן צלחת על ידי קיסם סטרילי, מערבבים חיידקים עם 600 μL ליברות/אמפיצילין מרק (50 ng/μL) ב- 1.5 mL microtube, דגירה הצינורות ב 37 מעלות צלזיוס, לנער ה 6
   הערה: לחסן RNAi חיידקים לתוך המרק על ידי שפשוף האיסוף (tip קיסם או micropipette) לאורך צדי microtube.
ΜL
8. זרע 70 תרבותי חיידקים לתוך כל טוב של צלחות RNAi. ובכן 6 סטים כפולים או triplicate. דגירה הלוחות RNAi ב 22 ° C בלילה.
   הערה: צלחות RNAi שנוצר על ידי הליכים סטנדרטיים (טבלה של חומרים, הפניות ^{3 , 17 , 21}), כאן להשתמש בטישו 6-ובכן תרבות עיצוב הצלחת לגישה תפוקה גבוהה יותר המאפשר עדיין על הערכה מיקרוסקופיים של תעלת מורפוגנזה בבעלי חיים על הלוחות.
בוקר
9. הבא, שלב L4 פיק 3 ERM-1 [++]; vha-1 p:: GFP תולעים על גבי כל טוב של הלוחות RNAi.
   1. כדי למנוע זיהום עם חיידקים OP50 (ראה התייחסות ¹⁹) המפריעות RNAi קודם זרע התולעים לצלחת NGM ללא חיידקים ולתת את החיות לזחול בערך 10 דקות. רק להשתמש בבעלי חיים בריאים שאינם מורעבים.
10. דגירה הלוחות ב 22 ° C עבור בתלת-ממד לאפשר לבעלי חיים לייצר רומא-
11. לבחון פנוטיפים התעלה ב F1 רומא תחת המיקרוסקופ פלורסצנטיות ויבתר.

3. אין ויוו הדמיה של התעלה Excretory C. elegans על-ידי קרינה פלואורסצנטית לנתח מיקרוסקופ והניקוד של פנוטיפים Tubulogenesis

1. הכנת גיליון הניקוד פנוטיפ (לדוגמה שמוצג בטבלה 4 ו איור 5 ).
2. מניחים על צלחת אגר עם תולעים ישירות מתחת dissectin ידי קרינה פלואורסצנטיתg מיקרוסקופ, המכסה פתוח של הצלחת להערכה, להשתמש הגדלה נמוכה יותר להתמקד.
   הערה: פרוטוקול זה מתאר את השימוש טווח ועם 1.5 X 10 X יעדים, טווח זום מ 3.5 45 (טבלה של חומרים).
3. להעריך בעלי חיים על ידי התמקדות אחד טוב בנפרד, החל מ- 1 טוב, ולעבוד את הצלחת.
   הערה: תמיד להתחיל עם ההערכה של פקדים. למשל, מעושה (וקטורית ריק) שלילי שליטה (HT115 RNAi חיידקים (ראו הפניות ^{17 , 21}) בלי או עם מוסף ג'ין לא קשורים), המתאים חיובי שולט, למשל, ב מסך זה האינטראקציה, erm-1 RNAi (מעלימה את פנוטיפ ERM-1 [++]) ו- sma-1 / spectrin RNAi (מגביר את פנוטיפ תעלת ERM-1 [++]).
4. לבחון תחילה, כללי פנוטיפים לעין תחת אור בהיר (לדוגמה: תן/קטלני, Clr/נקה, Emb/עובריים קטלני, סטי/סטרילי, Unc/הקואורדינציה, Dpy/שמנמנה, וכו '), לכמת את גן # מושגים בסיסיים על ידי ספירת מספר הכולל חיות ומספר של בעלי חיים פנוטיפ, להקליט את המספרים (ראה טבלה 4).
   הערה: עבור נפילות של גנים גורם פגמים שעשויים להשפיע על הערכה של תעלת פנוטיפים (למשל, Emb, סטי), לשקול לחזור על הניסוי עם מותנה, פוסט עובריים RNAi (ראה המלווה נייר עבור שגרות ³ ).
5. שנית, לבחון תעלת excretory פנוטיפים תחת אור ניאון, ציון פנוטיפים לכימות (למשל, אורך התעלה, רוחב של לומן, ציסטות), להקליט את המספרים ולתאר פנוטיפים על גיליון הניקוד (ראה טבלה 4, < מחלקה חזקה = "xfig" > איור 5).
   הערה: הגדלה גבוהה יותר עם טווח הזום נדרש להעריך פנוטיפים תעלת עדינים יותר. לנוע הלוך ושוב בין הגדלה נמוך וגבוה להעריך בזהירות את התעלה ’ s אורך, רוחב, כל פנוטיפ מורפוגנזה השני של התעלה. כימות או כימות למחצה של פנוטיפים פשוטה, לספור 100 בעלי חיים (למשל, L4s זה מסך RNAi יישוב; פנוטיפים: תעלה באורך של 1/4, 1/2, 3/4, מלא של תעלות האחורי, והסיומת לומן בקוטר של תעלות אחורי, קטן ציסטות (< 1/3 מרוחב בעלי חיים), ציסטות גדולות (> 1/3 של רוחב חיות); ראה טבלה 4).
6. ידרשו תמונות של הפנוטיפים הדומיננטית לפחות 3 בעלי חיים שונים על ידי מיקרוסקופ רכוב מצלמה דיגיטלית תשלום מצמידים מכשיר (CCD), תוכנת הדמיה המתאימה (ראה טבלה של חומרים)
   1. לרכוש תמונות, תחילה להפעיל את המצלמה, המחשב המצורפת, לחץ פעמיים על סמל התוכנה לכידת התמונה, להתמקד על שטח של צלחת תולעת באופן ידני תחת הגדלה נמוכה ולפתוח תריס המצלמה.
   2. לחץ על “ מקדימה חיה ” סמל של תוכנה ללכידת תמונה על מסך המחשב כדי להמחיש את התולעים על מסך המחשב, להתאים את המוקד באופן ידני כדי בבירור להמחיש את התולעים על המסך ולאחר מכן לחץ “ הצמד ” הסמל, ואז לחץ “ שמור ” סמל.
      הערה: חיות יעברו מהר תחת אור ניאון, לכן לשמור יד אחת על עכבר המחשב מוכן תוך כדי הזזת את הצלחת לתוך האזור עניין עם היד השנייה. מיד ולחץ “ הצמד ” סמל לרכוש את התמונה. בדרך כלל ניתן לרכוש תמונה טובה עם נסיונות מספר.
   3. לשמור את התמונות רכשה עם שם קובץ נכונה (כולל שם זן, RNAi שיבוט שם ותאריך).
      הערה: תולעים פראי-סוג נע מהר יותר עם תעלות דק וארוך קשים יותר לשיקוף יותר מוטציות. מוטציות עם פיברוזיס תעלות ו/או אחרים פנוטיפים צפויים לנוע באיטיות, למוצא הדמיה. סמן פלסמידים כגון שבעזרתם יכול להיות שימושי עבור הדמיה על ידי שמירה על בעלי חיים “ על המקום ” ולא זז קדימה, ויש אולי גם מספק תצוגה משופרת על פנוטיפ עם החיה מתגלגל סביב עצמו.

4. הדמיה של התעלה Excretory C. elegans ברזולוציה גבוהה על ידי לייזר סורק מיקרוסקופיה קונפוקלית

1. הרכבה בעלי חיים
   1. למקם כמות זעירה של גריז או וזלין בקצה ספוגית כותנה או על הקצה אינדקס באצבע, מורחים את המשחה כדי ליצור עיגול ודק במיוחד בקוטר של ~ 6 – 8 מ מ באמצע זכוכית נקי.
   2. מקום 6 μL 5% לידוקאין פתרון (הרדמה) לתוך העיגול באמצעות בנייה micropipette.
      הערה: פתרון לידוקאין המניות יכולה להיעשות על ידי המסת אבקה לידוקאין במים. לדלל כדי 5% עם M9 מאגר ¹⁹ (טבלה של חומרים). זה קריטי לניתוח של התעלה excretory כדי למנוע את הנייח פתרונות נפוצים (כגון אזיד הנתרן) שגורמים ציסטות להיקרע, זירוז זה תעלת פנוטיפים.
   3. לבחור מספר בעלי חיים מן צלחת RNAi, ומניחים אותם בתוך תמיסת לידוקאין מאת immerging לבחור את התולעת ¹⁹ בתוך תמיסת.
      הערה: רצוי לאסוף חיות ספציפיות בשלב זה יקל על הרכבה אפילו על ידי עובי אחיד. בעלי חיים יכול להיות בחר על המיקרוסקופ פלורסצנטיות ויבתר.
   4. מקום coverslip 22 מ"מ x 22 מ"מ על גבי השקופית זכוכית; תן לזה בעדינות להתפשר על גבי המעגל גריז.
      הערה: אינן חלות כל לחץ פיסי על coverslip אשר עלול לגרום נזק מורפולוגיה התעלה, בפרט מוטציות או תולעים RNAi מטופלים עם תעלת ואולי פנוטיפים אחרים. לכן חשוב להימנע מעגל גריז עבה; אידיאלי לבעלי חיים הם בעדינות דחוקה בין שקופיות זכוכית מכסה.
   5. לכתוב את שמו של המדגם על הצד עמומה של השקופית זכוכית. מיד לקחת את השקופיות מיקרוסקופ קונפוקלי לניתוח של תעלת פנוטיפ וכדי לרכוש תמונות.
      הערה: עיכובים עלול לגרום לנזק של תעלת ציסטות או שינוי תעלת לומן מורפולוגיה.
2. Acquiring תמונות קונאפוקלית
   1. מקום השקופית על הבמה מדגם של מיקרוסקופ קונפוקלי, למקד את התולעים בהגדלה נמוכה (10 X).
   2. תצוגה ובחר חיות תחת 60 X ו/או מטרות X 100, לבחון את התעלה excretory ’ s סלולריים ו פנוטיפים subcellular, למשל, צורה לומן, קוטר, הגודל והצורה של ציסטות; או הרכיבים subcellular תוויות לניתוח, למשל, הפסגה/lumenal ממברנה, קרום הבסיס, הציטופלסמה, endosomal לעומת canalicular שלפוחית, organelles אחרים (ראה דיון, איור 2 ו- 4 באיור).
   3. ידרשו תמונות של פנוטיפ ספציפי עניין.
      הערה: פרוטוקול זה מתאר את השימוש בלייזר (טבלה של חומרים) מיקרוסקופ קונפוקלי סורק. כדי לפתור את רכיבי subcellular דק C. elegans נדרשים תעלות excretory, הגדלה גבוהה יותר מטרות (60 X 100 X). מיקרוסקופ קונפוקלי ספינינג-דיסק יכול לשמש כדי לרכוש זמן לשגות תמונות אבל מספק פחות confocality (ראה דיון).
      1. לרכוש תמונות וידאו, הפעל את המחשב, לחץ פעמיים על התוכנה מיקרוסקופ קונפוקלי ובחר הלייזר על ידי לחיצה על סמל בלייזר ספציפי.
      2. לחץ “ סריקה ” סמל כדי להמחיש את התולעת ממוקד על מסך המחשב, להתאים את עוצמת לייזר דרך התוכנה, ולחץ שוב על “ סרוק ” סמל כדי לעצור סריקה ולאחר מכן לחץ על “ ללכוד ” סמל כדי ללכוד את התמונה ולאחר מכן לחץ על “ להציל ” סמל.
      3. לשמור תמונות עם שם קובץ נכונה וכוללים RNAi שיבוט שם, זן שם ותאריך.
         הערה: תמונות ניתן לרכוש יחידה, מקטעים מרובים (למשל, 10 – סעיפים 15 לאורך ציר z). חלוקתה מאפשר לוויזואליזציה תלת-ממדית. לרכוש הקרנת תמונות ולשמור בנפרד במידת הצורך (בהתאם מיקרוסקופ). רזולוציה אופטימלית, השתמש בהגדרות לייזר עם רווח נמוך, לא לפתוח חריר מדי ולהוסיף כמה בממוצע לכל תמונה (ראו הפניות ^{23 , 24} לדיון כללי קונאפוקלית הדמיה). לטפל כדי לרכוש תמונות על הבהירות להלן רמת רוויה כדי לאפשר שינוי על-ידי הדמיה בתוכנה, אם נדרש (רצוי להשתמש יבוצעו בהם שינויים תמונות)-
      4. לרכוש תמונות של זוגיות - או להכפיל את תעלות עם תוויות (למשל ירוק, אדום וכחול) באותו אופן, על ידי לחיצה על סמלים לייזר מרובים, אך להשתמש סריקה רציפה כדי למנוע דימום-דרך בין ערוצים (קריטי ללימודי הסבת שיתוף).
         הערה: אחד ייתכן שיהיה עליך לקחת בחשבון הזמן הנדרש עבור סריקה רציפה (אשר גם התוצאות תואמת להגדיל תמונה הלבנת) ולשנות הגדרות הסורק. אל תסרוק חיות משקופית אחת במשך יותר מ 30 דקות מרבי כדי למנוע השפעות לא ספציפי על תעלת מורפולוגיה. הר שקופית חדשה אם נדרשת סריקה יותר.
      5. לרכוש התערבות דיפרנציאלית המתאימים אופטיקה (DIC) / Nomarski תמונות, במיוחד אם לכימות תעלה קוטר אורך ו לומן ביחס התולעת ’ אורך הגוף s וקוטר. כיסוי פלורסצנטיות ותמונות Nomarski על ידי לחיצה על “ כיסוי ” סמל להפגין ציוני דרך ( 1D איור, איור 4A – ד).
   4. על כימות, למדוד את עוצמת קרינה פלואורסצנטית של רכיב שכותרתו עניין ImageJ תוכנה ²⁵ ( איור 5C).

תוצאות

פרוטוקול זה מתאר כיצד להשתמש התעלות excretory C. elegans חזותי, מולקולרי לניתוח tubulogenesis חד־תאיות ו לומן תאיים מורפוגנזה בתא יחיד. במהלך השלוחה שלהם מימי אמצע מופרה לבגרות, התעלות excretory ארבע ממשיכים להרחיב שלהם basolateral וממברנות הפסגה/lumenal יחד עם שלהם canalicular endosomal endomembrane מערכת, מת...

Discussion

רב-תכליתיות גנטי של C. elegans , שקיפות, תוכנית פשוטה גוף וכל השושלת הקבועה תא שרד מודל מצוין עבור הניתוח של מורפוגנזה פרוטוקול זה מתאר כיצד לשלב מניפולציות גנטיות סטנדרטי הדמיה מחקרים כדי לנצל 2 מיקרון דק C. elegans תעלות excretory ללמוד ממברנה מקוטב ו לומן תאיים להן בשפופרת תא בודד.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cloning
Plasmid pPD95.75	Addgene	Cat. No. 37464
PCR Kit	Qiagen	Cat. No. 27106
Ligation kit	New England Biolabs	Cat. No. E2611L
DNA marker	Thermo Scientific	Cat. No. SM1331
Agarose DNA grade	Fisher Scientific	Cat. No. BP164-100
Competent cells	New England Biolabs	Cat. No. C2987H
Tris	Fisher Scientific	Cat. No. BP154-1
EDTA	Sigma	Cat. No. ED-1KG
Acetic acid	Fisher Scientific	Cat. No. A38S-500
Ethidium bromide	Fisher Scientific	Cat. No. BP1302-10
Equipments
PCR machine	MJ Research	Cat. No. PTG-200
Centrifuge	Eppendorf	Cat. No. 5415C
Water Bath	Precision Scientific	Cat. No. 666A3
Gel running instrument	Fisher Scientific	Cat. No. 09-528-165
Gel running power supply	Fisher Scientific	Cat. No. 45-000-465
Molecular Imager Gel Doc XR System	Bio-Rad	Cat. No. 1708195EDU
Nanodrop Spectrophotometer	Thermo Scientific	Cat. No. ND1000
C. elegans related1			1see reference19 for standard C. elegans culture and maintenance procedures.
LB Medium and plates2			2see reference19 for protocols.
Tryptone	Acros Organics	Cat. no. 611845000
Yeast Extract	BD Biosciences	Cat. no. 212750
NaCl	Sigma	Cat. no. S7653
Bacto Agar	BD Biosciences	Cat. no. 214040
Ampicillin	Sigma	Cat. no. A0116
Tetracycline	Fisher Scientific	Cat. no. BP912
M9 Medium2			2see reference19 for protocols.
NaCl	Sigma	Cat. no. S7653
KH2PO4	Sigma	Cat. no. P0662
Na2HPO4	Sigma	Cat. no. S7907
MgSO4	Sigma	Cat. no. M2773
NGM plates 2			2see reference19 for protocols.
NaCl	Sigma	Cat. no. S7653
Peptone	BD Biosciences	Cat. no. 211677
Tryptone	Acros Organics	Cat. no. 611845000
Bacto Agar	BD Biosciences	Cat. no. 214040
MgSO4	Sigma	Cat. no. M2773
CaCl2	Sigma	Cat. no. C3881
Cholesterol	Sigma	Cat. no. C8667
K2HPO4	Sigma	Cat. no. P3786
KH2PO4	Sigma	Cat. no. P0662
RNAi plates3			3see reference21 for protocols.
NaCl	Sigma	Cat. no. S7653
Peptone	BD Biosciences	Cat. no. 211677
Tryptone	Acros Organics	Cat. no. 611845000
Bacto Agar	BD Biosciences	Cat. no. 214040
MgSO4	Sigma	Cat. no. M2773
CaCl2	Sigma	Cat. no. C3881
Cholesterol	Sigma	Cat. no. C8667
K2HPO4	Sigma	Cat. no. P3786
KH2PO4	Sigma	Cat. no. P0662
IPTG	US Biological	Cat. no. I8500
Carbenicillin	Fisher Scientific	Cat. no. BP2648
NaOH	Fisher Scientific	Cat. no. SS266-1
Sodium hypochlorite	Fisher Scientific	Cat. no. 50371500
Bacteria
OP50 bacteria	CGC
HT115 bacteria	CGC
Genome-wide RNAi libraries
Ahringer genome-wide RNAi feeding library (ref21,58,59)	Source BioScience
C. elegans ORF-RNAi feeding library (ref60)	Source BioScience
Imaging related
Lidocaine	MP Biomedicals,LLG	Cat. no. 193917
Materials
Vacuum Grease Silicone	Beckman	Cat. no. 335148
Microscope slides	Fisher Scientific	Cat. no. 4448
Tissue culture plate, 6 well	Corning Inc.	Cat. no. 08-772-33
Equipment
SMZ-U dissecting microscope (Nikon)
SZX12 dissecting microscope (Olympus), equipped with a high-power stereo fluorescence attachment (Kramer Scientific), CCD camera with Q capture software and X-Cite fluorescent lamp (Photonic Solutions).
TCS SL Laser-scanning confocal microscope (Leica Microsystem)
C2 laser-scanning confocal mounted on an ECLIPSE Ti-E inverted microscope (Nikon)