El Canal de Excretory C. elegans como modelo de morfogénesis Lumen intracelular y En Vivo biogénesis de la membrana polarizada en una sola celda: etiquetado por fusiones de GFP, ARNi interacción pantalla e imagen

Resumen

El canal excretor de C. elegans es un modelo único de celular solo para el análisis visual en vivo de la biogénesis de la membrana de nuevo polarizado. Este protocolo describe una combinación de genético estándar/ARNi y enfoques, adaptables para la identificación y caracterización de moléculas dirección tubulogenesis unicelulares y biogénesis de la membrana y lumen apical la proyección de imagen.

Resumen

Los cuatro canales excretores de C. elegans son tubos estrechos que se extendió por la longitud del animal de una sola célula, con casi igual ahora extendido endotubes intracelular que construir y estabilizar la luz con una membrana y submembraneous citoesqueleto de carácter apical. La célula excretora amplía su longitud aproximadamente 2.000 veces para generar estos canales, haciendo este modelo único para la evaluación en vivo de de novo polarizado biogénesis de la membrana, morfogénesis lumen intracelular y unicelulares tubulogenesis. El protocolo que presentamos muestra cómo combinar la norma de etiquetado, ganancia y pérdida-de-función genética o ARN de interferencia (ARNi)-y métodos microscópicos para utilizar este modelo para diseccionar visualmente y funcionalmente analizar estos procesos a nivel molecular. Como un ejemplo de un enfoque de etiquetado, el protocolo describe la generación de animales transgénicos con proteínas fluorescentes de fusión para el análisis directo de tubulogenesis. Como un ejemplo de un enfoque genético, destaca puntos clave de una visual basada en RNAi interacción pantalla diseñada para modificar un fenotipo canal enquistada de ganancia de función. Los métodos específicos descritos son cómo: etiquetar y visualizar los canales de expresión de proteínas fluorescentes; construcción de una biblioteca específica de RNAi y estrategias ARNi de detección para el análisis molecular de la morfogénesis del canal; evaluar visualmente modificaciones de fenotipos de canal; puntuación por disección microscopía de fluorescencia; componentes subcelulares canal a resolución mayor se caracterizan por microscopía confocal; y cuantificar parámetros visuales. El enfoque es útil para el investigador que está interesado en aprovechar el canal excretor de C. elegans para la identificación y caracterización de genes implicados en los procesos filogenéticamente conservados del lumen intracelular y unicelulares morfogénesis del tubo.

Introducción

Todos los órganos internos están compuestos por tubos, cruciales para sus muchas funciones diferentes, tales como el transporte y el intercambio de gases, líquidos y nutrientes y la excreción de desechos metabólicos. Su carácter polarizado, con distintas membranas apicales lumenal, está adaptada a estas funciones específicas, y los defectos en la biogénesis de sus sistemas de endo - y de la membrana plasmática son una causa frecuente de enfermedad humana^1,2. La mayoría de los tubos de la vasculatura y de órganos internos es multicelular y forma un lumen intracelular; sin embargo, tubos unicelulares, que forman el lumen intracelular, por ejemplo, pueden representar tanto como 30-50% de camas de tubo capilar humana². Las membranas polarizadas de multi - y tubos unicelulares son similares en composición, aunque su microdominios pueden variar en base a la función específica del tubo (por ejemplo, canalículos excretores canal versus las microvellosidades intestinales en Caenorhabditis elegans de; Ver acompañando a papel en tubulogenesis intestinal C. elegans )³. Los principios de la biogénesis de la membrana polarizada y tubulogenesis se conservan entre los metazoos, y una maquinaria molecular similar dirige^1,2,4.

El sistema excretor de C. elegans consiste en cinco células: la célula excretora (EC), célula del conducto (DC), poro (PC) de la célula y dos células de la glándula. Ablación de la CE, la DC o la PC causa acumulación de líquido en la cavidad del cuerpo y lo animales mueren a una temprana etapa larvaria⁵. Curiosamente, estos tres tubos unicelulares crean sus lúmenes de tres maneras diferentes: por célula de vaciamiento (CE); envoltura celular junto con la formación de la ensambladura de autocellular (PC); y por la envoltura de la célula junto con autofusion (DC); diferentes mecanismos de la morfogénesis de la luz que los filogenéticamente conservados^6,7. La CE, situada en el lado lateral izquierdo del bulbo faríngeo posterior, envía dos extensiones laterales de que los cuatro canales se ramifican para ampliar anterior y posteriormente (en el lado derecho e izquierdo) a la punta de la nariz del gusano y cola , respectivamente (figura 1)^5,6,8. La CE se extiende de aproximadamente 1 μm a 2 x 1.000 μm, lo que es la célula más grande en el animal. A nivel subcelular, el conducto excretor es un tubo simple, generado a partir de una membrana basal hacia el pseudocoelom y canalizado por una membrana lumenal (endotube). La membrana lumenal de canal se conecta a la membrana lumenal de conductos en su unión sólo intercelular; los canales son de otra manera junctionless a lo largo de su longitud (figura 1). La membrana lumenal de conducto excretor y su citoesqueleto de submembraneous son apicales, definidos por su composición molecular que se asemeja a la composición de la membrana apical y citoesqueleto de submembraneous de tubos pluricelulares, como el intestino, y de otros epitelios (por ejemplo, planos). Orgánulos citoplásmicos, incluyendo endosomal vesicular y otros (p. ej., Golgi) endomembranas se distribuyen a lo largo de la longitud del canal. Además, múltiples vesículas con canalículos - conectado a la membrana del lumenal, o interconectados o aislados - se roscan a través del canal citoplasma^7,8,9,10 . Esta conexión con plasma-membrana/canalículos dinámica más amplía sistema de membrana del canal y contribuye a ambos lumen morfogénesis y osmoregulación¹⁰. El canal excretor así consiste casi enteramente de endo - y las membranas de plasma, proporcionando un excelente modelo para el análisis de la biogénesis de la membrana polarizada y la regulación de la endo-interfaz de la membrana plasmática. La dramática expansión de la membrana apical durante la morfogénesis de la canal - en este sistema unicelular coincidente con la extensión de la luz – también permite para analizar los problemas arquitectónicos que se presenta por la necesidad de estabilizar y una membrana intracelular del lumenal del centro . Este protocolo se centra en el análisis de la morfogénesis estructural canal tubo y del lumen y la dinámica de la membrana intracelular necesaria para este proceso en lugar de las señales que dirigen los movimientos celulares que generan posición de la CE en el sistema excretor y sus intrincadas conexiones con otros elementos celulares (revisados en⁶).

Otra ventaja del sistema de canal sola célula C. elegans para el análisis de membrana polarizada y biogénesis de lumen intracelular es su capacidad para separar, a través del tiempo del desarrollo, la generación de los diferentes componentes de sus membranas y uniones. La CE nace en el momento de cierre ventral y se instala ventro-lateral de la faringe durante mediados embriogénesis^5,6,8, durante el cual tiempo canal lateral extensión y ramificación se producen. Esto es seguido por la extensión del canal antero-posterior durante la embriogénesis tardía, un proceso que continúa en la etapa larval L1 (figura 1). En una larva recién eclosionada, la punta posterior alcanza aproximadamente la mitad de la lombriz, completamente que se extiende hasta la cola al final de la fase L1, después el canal se alarga junto con el gusano⁸. Crecimiento activo de la canal a una velocidad superior a la del crecimiento del animal así termina en la primera etapa larval, sin embargo, más crecimiento se produce en paralelo con el crecimiento del animal entero durante las etapas larvales adicionales (L2-4). Esta configuración proporciona la oportunidad de analizar los diferentes pasos de biogénesis de membrana de novo polarizados independientes de la división de célula polarizada o migración. Además, permite la separación de este proceso desde el montaje de uniones (que ocurren en el embrión antes de la iniciación de lumen); su requisito exacto en la polarización de la membrana es todavía una cuestión abierta en el campo de la polaridad. Por último, únicamente separa apical de expansión de la membrana basal, este último proceso anterior a la anterior en los canales excretores¹⁰. El modelo del canal excretor de C. elegans , resulta un complemento especialmente informativo para el modelo intestinal que comparte un número de estas ventajas para el análisis de la biogénesis de la membrana polarizada pero se ejecuta en un entorno multicelular (véase el documento acompañante sobre intestinal tubulogenesis³).

Aunque canales de tipo salvaje son túbulos ultrafinos en este pequeño gusano, sus lúmenes pueden ser visualized directamente por la óptica Nomarski en este animal transparente. De hecho, morfologías del conducto enquistado mutante pueden ser caracterizados en animales sin etiqueta con ampliación baja disección microscopía, que se ha utilizado con gran efecto en adelantados pantallas genéticas para identificar genes implicados en la tubulogenesis¹¹. Mejor visualización de la morfología de canales y distinción de sus membranas polarizados, componentes del citoesqueleto, organelos intracelulares diferentes y otras estructuras subcelulares, sin embargo, requiere de etiquetado y más alto de energía fluorescente microscopía confocal y disección. Aunque estructura fina de los canales plantea una serie de dificultades para el etiquetado y microscopía, membranas y componentes subcelulares pueden distinguirse a través de las moléculas específicas únicas para cada compartimiento, y animales se pueden montar con seguridad para microscopía si ciertas precauciones se toman para evitar la introducción de artefactos (ver Protocolo y discusión). Etiquetado puede hacerse mediante inmunohistoquímica en muestras fijas, o mediante la generación de gusanos transgénicos expresando proteínas fluorescentes de fusión bajo el control de su propia o excretores promotores de canal específicos para proyección de imagen en vivo . Este protocolo describe el etiquetado última técnica (consulte el documento adjunto en tubulogenesis intestinal para el anticuerpo de tinción³).

La capacidad de combinar estudios de pérdida o ganancia de función en vivo en vivo imágenes de análisis en la célula de nivel a lo largo del desarrollo hace el canal excretor de C. elegans un modelo particularmente fuerte para el molecular y Análisis celular de tubulogenesis unicelulares. Avanzar o retroceder pantallas genéticas pueden realizarse a partir de un animal transgénico tipo salvaje o con etiquetado para identificar fenotipos de morfogénesis de canal (por ejemplo, quistes) y sus defectos genéticos subyacentes. Alternativamente, estas pantallas pueden iniciar con un fenotipo mutante (por ejemplo, un conducto enquistado) e identificar supresores o potenciadores de este fenotipo para identificar genes que interactúan funcionalmente con el gene que causa el fenotipo mutante. El defecto genético que causa el fenotipo mutante puede inducir una pérdida (por ejemplo, a través de canceladura del gene) o un aumento (por ejemplo, a través de una mutación activante o a través de la introducción de copias del gen exceso) de la función investigada. Adelante mutagénesis o ARNi sistemática pantallas sin ideas preconcebidas sobre la función del gen y permitan la identificación objetiva de los genes implicados en la función de interés. Teniendo en cuenta la disponibilidad de genoma-ancha de RNAi alimentación bibliotecas, casi cada gen puede ser fácilmente derribado por RNAi en la C. elegans, tal que cualquier solo gen de interés o de cualquier grupo de genes (por ejemplo, en pantallas específicas) puede también ser rápidamente sondeado por su efecto en un enfoque de genética reversa. Para demostrar una posible combinación de enfoques, aquí describimos una pantalla específica de interacción ARNi, a partir de un mutante del canal excretor enquistada de ganancia de función, con proteína fluorescente citoplásmico canal verde (GFP). El fenotipo mutante se generó por la sobreexpresión de erm-1, un altamente conservados C. elegans ortholog de la familia de vinculador de membrana-actina Ezrin-Radixin-moesina (ERM), que ha sido implicada en la morfogénesis de la luz y la membrana organización en muchas especies¹². C. elegans ERM-1 se localiza en membranas lumenal de órganos internos, como el canal excretor y el intestino y es necesario para la formación del lumen en ambos¹³. Sobreexpresión de ERM-1 recluta a actina exceso y vesículas a la membrana lumenal de canal, aumentar el flujo en el lumen y la generación de un corto canal enquistado y una membrana lumenal prensada con actina engrosada capa⁹. El protocolo describe cómo generar cepas transgénicas con expresa de canal excretor etiquetado como proteínas de fusión (u otras proteínas); Cómo hacer pantallas de ARNi dirigidas a partir de dichas cepas, para identificar los modificadores del fenotipo de un canal; y cómo analizar visualmente los resultados de tales pantallas por microscopía confocal y disección de fluorescencia, incluyendo formas sencillas de cuantificar los fenotipos tubulogenesis informativo. Alternativa etiquetado técnicas y los detalles de RNAi, ajustado a los genes tubulogenesis a menudo letal, puede encontrarse en el documento de acompañamiento en la tubulogenesis intestinal³. Todos los métodos se pueden utilizar en varias combinaciones para la investigación de otras preguntas en el canal tubulogenesis.

Protocolo

1. etiquetado del C. elegans Excretory Canal por proteínas fluorescentes de fusión ¹⁴

Nota: Consulte el documento adjunto en tubulogenesis intestinal ³ para el etiquetado en situ anticuerpo procedimientos de tinción adaptable al canal excretor. Ver cuadro 1 para ejemplos de moléculas demostrado ser útiles para la visualización de C. elegans canal excretor endo - y las membranas de plasma, tabla 2 para ejemplos de expresión de la conducción del canal excretor, promotores y Tabla 3 recursos para colecciones de marcadores y promotores más completa, incluyendo referencias sobre la selección de fluoróforos diferentes.

1. Construcción de plásmidos de marcador fluorescente específico de tejido por enzima de la restricción en clonación ¹⁵
   Nota: ver la discusión de técnicas alternativas de construcción de proteínas fluorescentes de fusión.
   1. Identificar la secuencia del promotor (para fusiones transcripcionales) o del gene entero de interés con su promotor (para fusiones traslacionales) en WormBase ⁴⁴.
      Nota: para los promotores, alrededor de 1 – 3 kilobases (kb) son suficiente para la mayoría de los genes C. elegans. Proteínas de fusión traduccional pueden también construirse colocando un gen de interés bajo un promotor específico del canal excretor (ver tabla 2).
   2. Diseño de cartillas de avance y retroceso para la amplificación de la promotora (para fusiones transcripcionales) o un gen completo con promotor (para fusiones traslacionales). Añadir enlazadores de enzima de la restricción en el 5 ’ y 3 ’ extremos de las cartillas de.
      Nota: Elija las enzimas de restricción que están presentes en el vector plásmido (e.g., pPD95.79) ¹⁶. Para fusiones de traslacionales, los 3 ’ vinculador debe diseñarse para que después de la digestión de la enzima de la restricción y la ligadura con el vector, el marco de codón de insertar será continuo con los codones del fluoróforo, por ejemplo, GFP. Uno puede necesitar añadir 1 o 2 bases más a la enzima de restricción típica enlazadores ¹⁴; Tenga cuidado de no para crear un codón de parada.
   3. Polimerasa realice la reacción en cadena (PCR) para amplificar el promotor o el gen integral utilizando gusanos vivos o tipo de ADN genómico o cDNA como plantilla ¹⁵.
      Nota: Al usar gusanos como plantilla, primero lyse gusanos de lysis buffer (tampón PCR más proteinasa K) ¹⁷. Gusanos de fase mixta se pueden utilizar como plantilla. Gusanos hambrientos pueden utilizarse para evitar la contaminación con ADN bacteriana.
   Electroforesis de productos PCR para identificar el tamaño correcto del producto amplificado del gel
   4. realizar agarosa (1%).
      Nota: Si el tamaño de banda es correcta, continúe con el paso siguiente. Si se generan múltiples bandas, mejorar las condiciones de amplificación para producir una banda. Si esto no funciona, cortan la correcta banda de gel y purificar DNA por métodos estándar ¹⁵ y luego proceda con el siguiente paso.
   5. Recopilación de restricción de realizar sobre el producto PCR y el plásmido vector que contiene el fluoróforo (e.g., pPD95.79) en tubos separados por métodos estándar ¹⁵.
   6. Separar el ADN digerido por electroforesis en gel y eluir el producto PCR y vector bandas de DNA en tubos separados.
   7. Purificar las DNAs de rodajas de gel mediante métodos estándar ¹⁵. Medir la concentración de DNA por espectrofotómetro.
   8. Ligar el producto PCR y vector de ADN por métodos estándar y transformar el ADN recombinante en células competentes por métodos estándar ¹⁵.
   9. Extensión 10 μL, 50 μL y 100 μL de las células transformadas en tres platos individuales de caldo Luria (LB) suplementados con ampicilina 50 de μg/mL.
      Nota: Difundir diferentes cantidades de células en placas diferentes para un espectro de eficiencia de transformación. Por ejemplo, demasiado densamente la galjanoplastia no podrá permitir el aislamiento de colonias si la transformación es eficiente.
   10. Incubar las placas a 37 ° C durante la noche. A la mañana siguiente, saque las placas de la incubadora.
       Nota: Si las colonias son muy pequeñas, incubar durante varias horas más.
   11. Preparación de plásmido DNAs de colonias solo por métodos estándar ¹⁵. Mezcla de DNA de la plantilla y las cartillas y enviar para la secuencia (generalmente realizada en un centro de servicio de base).
   12. Leer las secuencias y verificar la integridad de la fusión construcción.
       Nota: crítica: confirmar el marco codón correcto entre gene insertado y gene marcador fluorescente para fusiones de traducción. Idealmente, la secuencia del gene entero para confirmar que ninguna mutación fue introducida durante los procedimientos PCR y la ligadura.
   13. Generar más DNA plasmídico (usando paso 1.1.11) para la inyección de paso 1.2.
2. Generación de animales transgénicos por microinyección de ADN para la transformación del germline ¹⁸
   Nota: ver la discusión de técnicas alternativas para la introducción de los transgenes. Los procedimientos de contorno pueden utilizarse para generar animales transgénicos que llevan una proteína de fusión de fluorescencia o cualquier otra proteína de interés. Por ejemplo, una proteína exógena puede ser recién introducido (por ejemplo, un ortholog heteróloga) o una proteína endógena puede ser reintroducida (p. ej., en su correspondiente mutante del germline para rescate) o overexpressed para generar un fenotipo (por ejemplo, inyección de de erm-1 se utilizó para generar el fenotipo de conducto enquistado de la sobreexpresión que sirve como blanco para la modificación de la pantalla de interacción de ARNi que se describe a continuación).
   1. Mezcla de construcción de ADN (1 – 50 ng/μL) con el plásmido marcador ADN (típicamente 100 ng/μL), por ejemplo el marcador dominante rol-6 (su1006) (véase 1.2.3 para opciones de marcador).
      Nota: crítica: concentración de ADN inyectado debe determinarse empíricamente para evitar introducción de fenotipos artefactuales (quistes, extensión defectos, mortalidad) cuando expresan los genes en los canales excretores que son particularmente sensible a la expresión de los transgenes. Uno puede, por ejemplo, hacer varias mezclas de plásmidos en concentraciones de 1 ng/μL, 10 ng/μL, 50 ng/μL y 100 ng/μL con 100 ng/μL rol-6(su1006) para probar una gama de concentraciones para la generación de una cepa viable con la expresión deseada o fenotipo (concentraciones altas es probables que no específicamente tóxicos para la morfogénesis del conducto y puede ser mortales).
   2. Filtrar la mezcla de ADN a través de un filtro 0,22 μm (micrómetro) poro tamaño spin x centrífuga tubo.
      Nota: No deje la tapa del tubo abierto para evitar el polvo que puede bloquear las agujas microinyección.
   3. Microinject plásmidos recombinantes en la gónada de gusanos tipo salvaje o mutantes por métodos estándar de transformación de la línea germinal (ver referencia ¹⁸ para detalles).
      Nota: Los plásmidos marcador estándar son, por ejemplo: rol-6(su1006), dpy-20, unc-119, pha-1. Los transgenes dominantes como rol-6(su1006) se introducen en gusanos del tipo salvaje, que rescate los transgenes se introducen en sus respectivos mutantes. Los plásmidos de marcador son co-inyección para un fácil mantenimiento de las líneas transgénicas ya que los transgenes extracromosómicos se pierden al azar durante la división celular (ver 1.2.8). Cuando la inyección de genes que codifican para el fluoróforo fusiones, se puede también utilizar el fluoróforo, GFP, sí mismo como marcador. rol-6 induce gusanos a rodar alrededor de sí mismos que a menudo es ventajoso para la evaluación de fenotipos morfogénesis.
   4. Transferencia inyectado gusanos en Escherichia coli sembradas las placas de medio de crecimiento de nematodos (NGM) (p. ej., placa de gusanos 5) (ver referencia ¹⁹ para estándar C. elegans procedimientos de cultivo y mantenimiento y Tabla de materiales).
   5. Incubar las placas y dejar progenie desarrollar a 20 ° C para aproximadamente 3 d.
   6. Examinar la progenie F1 con el microscopio de disección para gusanos (balanceo) de Rol (o cualquier otra inyección específico marcador, por ejemplo, GFP) y selección de rodillos tplacas individuales o.
   7. Seleccionar las placas con el balanceo los animales F2 y confirmar la presencia de fluorescencia con un microscopio de fluorescencia disección (todos los animales de rodillo son generalmente GFP positiva).
      Nota: F2 rodillos indican la generación exitosa de una línea transgénica. Líneas individuales pueden ser diferentes, por ejemplo, con respecto a la tasa de transmisión del transgen. Por lo tanto es útil mantener y almacenar varias líneas de.
   8. Mantener las líneas transgénicas enriqueciendo nuevas placas para marcador positivo animales.
      Nota: El ADN inyectado se incorpora en la línea germinal como una matriz Extracromosómica. Las tasas de transmisión para las matrices extracromosómicas son variables pero generalmente alrededor de ~ 50%. Para no perder la cepa, por lo tanto, es fundamental para enriquecer manualmente líneas con marcadores dominantes (p. ej., líneas no aseguradas por selección negativa).
   9. Congelación de líneas transgénicas por técnicas de congelación estándar para el almacenamiento a largo plazo a-80 ° C ¹⁹.
      Nota: Transgenes en arreglos de discos extracromosómicas puede también integrarse en la línea germinal por la irradiación UV en un paso adicional para producir líneas homogéneas ¹⁸. Por ejemplo, erm-1 fue integrado en la línea germinal por la irradiación de UV para obtener la cepa de MTC-1 [++] fgIs2[erm-1p::erm-1;rol-6p::rol-6(su1006)] donde cada animal lleva el transgen, un requisito para su uso en RNAi pantalla de interacción se describe a continuación. Esta cepa fue etiquetada además por canal excretor citoplásmico GFP via cruce en una cepa que contiene un vha - 1P:: GFP transgen (generada por los mismos procedimientos señalados anteriormente; ver referencia ²⁰ básica genética procedimientos tales como cruces) y se conoce como ERM-1 [++]; VHA - 1P:: cepa GFP abajo.

2. Construcción de una biblioteca de ARNi objetivo y diseño de una pantalla de interacción de RNAi para modificar un fenotipo de Canal

Nota: una pantalla específica interacción genética basada en RNAi se describe que utiliza un fenotipo de conducto enquistado de sobreexpresión a búsqueda de genes de morfogénesis de interacción canal excretor. La cepa de MTC-1 [++] (vea el paso 1.2.9) sirve como ejemplo ⁹. Este enfoque presenta sólo uno de muchos posibles enfoques para el análisis genético de la morfogénesis de lumen del canal excretor (véase la Introducción y la discusión para otros enfoques genéticos). Consulte el documento adjunto en tubulogenesis intestinal ³ y referencias ^{17 , 21 , 22} de fondo en ARNi, detalles de RNAi procedimientos, modulación de fuerza de RNAi (ajustado a los genes tubulogenesis a menudo letal) y la discusión de problemas técnicos conexión a ARNi. Ver referencia ¹⁹ de gusano estándar cultura y mantenimiento y tabla de materiales.

1. Moléculas interactuantes buscar ERM-1 (u otro gen de interés) en las bases de datos y artículos publicados.
   Nota: Interactianos de ERM-1 potencial incluiría todas las moléculas que experimentalmente se demostraron que genéticamente, físicamente o funcionalmente interactuar con las proteínas ERM en cualquier especie o fueron predichas por cualquier de silico, alto rendimiento o enfoque de Biología de sistemas (ver tabla 3 para ver ejemplos de bases de datos y recursos).
2. Generar una lista de todos los genes y encontrar homólogos de C. elegans cuando sea necesario.
   Nota: Considerar ampliar la lista de genes identificados para las clases de gene, que toma en cuenta la función del gen de interés y amplía la red para la identificación de interactianos (p. ej., el vinculador de membrana-actina ERM-1, seleccione todas las actinias y moléculas de actina).
3. Identificar el ARNi correspondiente alimentación de clones disponibles comercialmente genoma bacteriano RNAi las bibliotecas para todos los genes bacteriano (p. ej., Ahringer genómica C. elegans ARNi alimentación biblioteca ²¹; Tabla de materiales)
4. Generar una hoja de cálculo para todos los genes y su correspondiente placa de RNAi y número bien.
5. Selección y raya ~ 50 clones de ARNi en placas de LB/ampicilina/tetraciclina (elección del antibiótico se determina por la construcción de la biblioteca) por día y continuar hasta dirigido ARNi biblioteca genera.
   Nota: Dependiendo del tamaño de la biblioteca y flujo de trabajo previsto, omitir la generación de una biblioteca y continuar directamente con el análisis de lote. Las placas pueden almacenarse a 4 ° C, durante no más de aproximadamente 2 semanas (si es necesario, volver a raya en placas nuevas después de eso). Por el contrario, uno puede generar grandes bibliotecas congeladas en replicados formatos bien 96 o 384 pocillos para almacenamiento a largo plazo a -80 ° C.
6. Incubar las placas a 37 ° C durante la noche. A la mañana siguiente, quitar placas de incubadora y almacén a 4 ° C.
7. ARNi recoger las bacterias de una placa por un palillo de dientes estéril, mezclar bacterias con 600 μL de caldo LB/ampicilina (50 ng/μL) microtubos de 1.5 mL, incubar los tubos a 37 ° C, agitar durante 6 h.
   Nota: Inocular bacterias de RNAi en el caldo frotando el pico (punta de un palillo o una micropipeta) a lo largo del lado del microtubo.
8. Semilla de 70 μL cultiva bacterias en cada pozo de 6 bien placas de ARNi en sets duplicados o triplicados. Incubar las placas de ARNi a 22 ° C durante la noche.
   Nota: Placas de RNAi son generadas por procedimientos estándar (Tabla de materiales y referencias ^{3 , 17 , 21}) y utilizadas aquí en un tejido bien 6 formato de placa de cultura para un mayor enfoque de rendimiento que aún permite la evaluación microscópica de la morfogénesis de la canal en animales vivos en las placas de.
9. Siguiente mañana, etapa de L4 pick 3 ERM-1 [++]; VHA - 1P:: GFP gusanos en cada pocillo de las placas de RNAi.
   1. Para evitar la contaminación con bacterias OP50 (ver referencia ¹⁹) que interfieren con ARNi primero sembrar las lombrices en un plato NGM sin bacterias y dejar que los animales arrastrarse durante unos 10 minutos. Utilizar únicamente animales sanos no de hambre.
10. Incubar las placas a 22 ° C para 3 d permitir que los animales producir progenie.
11. Examinar fenotipos de canal en la progenie F1 con el microscopio de fluorescencia disección.

3. En Vivo Proyección de imagen del Canal Excretory C. elegans por microscopía de fluorescencia de disección y puntuación de los fenotipos Tubulogenesis

1. preparar una hoja de puntuación de fenotipo (ejemplo que se muestra en la tabla 4 y figura 5 ).
2. Coloque la placa de agar con gusanos directamente debajo de la dissectin de fluorescenciag microscopio, abra la tapa de la placa para la evaluación, utiliza menor aumento a foco.
   Nota: Este protocolo describe el uso de un endoscopio con 1, 5 X y 10 X objetivos y un rango de zoom de 3,5 a 45 (Tabla de materiales).
3. Evaluar animales por centrándose en cada bien por separado, a partir de 1 pozo y abajo la placa de.
   Nota: Siempre comience con la evaluación de los controles. Por ejemplo, un mock (vector vacío) control (ARNi HT115 bacterias (ver referencia ^{17 , 21}) sin o con una inserción de genes sin relación) negativo y caso positivo controla, por ejemplo, en Esta pantalla de interacción, erm-1 RNAi (suprime el fenotipo de ERM-1 [++]) y sma-1 / spectrin RNAi (mejora el fenotipo de canal de ERM-1 [++]).
4. Primer lugar, examinar general fenotipos visibles bajo luz brillante (por ejemplo: dejar/letal, Clr/claro, Emb, embrionario letal, Ste estéril, Unc/coordinación, Dpy/rechoncho, etc.), cuantificar el fenotipo contando el número total de animales y de animales con el fenotipo, grabar los números (ver tabla 4).
   Nota: Para caídas de genes que causan los defectos que puedan afectar la evaluación de fenotipos de canal (p. ej., OE, Ste), consideran repetir el experimento con condicional, post embrionario RNAi (ver acompañando a papel de procedimientos ³ ).
5. En segundo lugar, examinar fenotipos canal excretor bajo luz fluorescente, marcar fenotipos cuantificables (por ejemplo, longitud de canal, ancho de lumen, quistes), grabar los números y describir fenotipos en una hoja de puntuación (ver tabla 4, < fuerte clase = "xfig" > Figura 5).
   Nota: Aumento mayor con un rango de zoom es necesaria para evaluar fenotipos canal sutil más. Moverse hacia adelante y hacia atrás entre alta y baja magnificación para evaluar cuidadosamente el canal ’ s longitud y anchura y otro fenotipo de morfogénesis de canal. Para la cuantificación o semi-cuantificación de fenotipos simple, contar 100 animales (e.g., L4s en esta pantalla específica de RNAi; fenotipos: canal longitud de 1/4, 1/2, 3/4 y la completa extensión de los canales posteriores y diámetro de lumen de los canales posteriores, pequeño quistes (< 1/3 del ancho del animal), los quistes grandes (> 1/3 del ancho del animal); Ver tabla 4).
6. Adquisición de imágenes de los fenotipos predominantes de por lo menos 3 diferentes animales por un microscopio montado cámara digital dispositivo de carga acoplada (CCD) y el correspondiente software de proyección de imagen (véase Tabla de materiales)
   1. para la adquisición de imágenes, primero encender la cámara, encender ordenador acoplado, haga doble clic en el icono del software de captura de imagen, un área de la placa de gusano manualmente bajo ampliación baja de enfoque y abrir el obturador de la cámara.
   2. Haga clic en el “ vista previa en vivo ” icono del software de captura de imagen en la pantalla del ordenador para visualizar los gusanos en la pantalla del ordenador, ajuste el enfoque manualmente a claramente visualizar los gusanos en la pantalla, a continuación, haga clic en el “ rápido ” icono, luego Haga clic en el “ guardar ” icono.
      Nota: Los animales se mueven más rápido bajo luz fluorescente, por lo tanto, mantenga una mano en ratón de la computadora listo mientras se mueve la placa en el área de interés con la otra mano. Haga clic inmediatamente en el “ rápido ” icono para adquirir la imagen. Normalmente es posible adquirir una buena imagen con varios intentos.
   3. Guardar las imágenes adquiridas con un nombre de archivo apropiado (incluir nombre de la cepa, ARNi clon y fecha).
      Nota: Más rápido movimiento gusanos de tipo salvaje con canales delgados y largos son más difíciles a la imagen de mutantes. Mutantes con canales enquistadas u otros fenotipos son propensos a moverse lentamente, facilitando la proyección de imagen. Plásmidos de marcador como Rol pueden ser útiles para la proyección de imagen por animales “ in situ ” en lugar de moverse hacia adelante y también puede proporcionar una mejor visión en el fenotipo con el animal en sí mismo.

4. Proyección de imagen del Canal Excretory C. elegans en alta resolución por microscopia Confocal de exploración láser

1. montaje animales vivos
   1. Coloque una pequeña cantidad de grasa o vaselina en la punta de un hisopo de algodón o en la punta de la Índice dedo y se extendió la grasa para generar un círculo ultrafino con un diámetro de ~ 6 – 8 mm en el centro de un portaobjetos de vidrio limpio.
   2. 6 lugar μL 5% solución de lidocaína (anestésico) en el círculo de una micropipeta.
      Nota: Es posible una solución lidocaína disolviendo polvo de lidocaína en el agua. Diluir al 5% con M9 buffer ¹⁹ (Tabla de materiales). Es fundamental para el análisis del canal excretor para evitar las soluciones inmovilización comunes (tales como la azida de sodio) que causan los quistes a la ruptura y que inducir fenotipos canal.
   3. Escoger varios animales de una placa de ARNi y colocarlos en la solución de lidocaína por immerging gusano pick ¹⁹ en la solución de.
      Nota: Preferiblemente escoge animales de escenario específico que facilitarán el montaje incluso por espesor uniforme. Animales pueden preseleccionarse en el microscopio de fluorescencia disección.
   4. Colocar un cubreobjetos de 22 x 22 mm, sobre el portaobjetos de cristal, dejarla asentarse suavemente en el círculo de grasa.
      Nota: No aplique ninguna presión física sobre el cubreobjetos que pueden dañar la morfología de la canal, especialmente en mutantes o gusanos de ARNi tratado con canal y posiblemente otros fenotipos. Por lo tanto es importante evitar un círculo grueso de grasa; Idealmente los animales suavemente se intercalan entre vidrio portaobjetos y cubreobjetos.
   5. Escribe el nombre de la muestra en el lado esmerilado de lo portaobjetos de vidrio. Tomar inmediatamente el portaobjetos al microscopio confocal para el análisis del fenotipo de canal y adquirir imágenes.
      Nota: Retrasos pueden resultar en daños de los quistes del canal o cambiar de morfología de canal luz.
2. Adquirir imágenes confocales
   1. colocar el portaobjetos en la etapa de muestra del microscopio confocal, centran los gusanos a bajo aumento (10 X).
   2. Vista y seleccione los animales bajo 60 X y objetivos de 100 X, examinar el canal excretor ’ celular s y subcelulares fenotipos, por ejemplo, lumen forma y diámetro, tamaño y forma de quistes; o de los componentes subcelulares etiquetados para su análisis, por ejemplo,, membrana apical/lumenal, membrana basal, citoplasma, endosomal versus vesículas con canalículos, otros organelos (véase discusión, figura 2 y figura 4).
   3. Imágenes de la adquisición del fenotipo específico de interés.
      Nota: Este protocolo describe el uso de un láser de barrido confocal microscopio (Tabla de materiales). Para resolver los componentes subcelulares en el delgado C. elegans tienen canales excretores, objetivos de ampliación superiores (60 X a 100 X). Un microscopio confocal de disco giratorio se puede utilizar para adquirir imágenes de lapso de tiempo pero ofrece menos confocality (ver discusión).
      1. Para adquirir imágenes confocales, encender el ordenador, haga doble clic en el software del microscopio confocal y seleccione el laser haciendo clic en el icono de un láser específico.
      2. Haga clic en el “ análisis ” icono para visualizar el gusano centrado en la pantalla del ordenador, ajustar la intensidad del láser a través de la software y haga clic otra vez en “ análisis ” icono para detener la exploración, haga clic en “ capturar ” icono para capturar una imagen, haga clic en “ guardar ” icono.
      3. Guardar imágenes con nombre de archivo apropiado e incluyen nombre de clon de ARNi, cepa y fecha.
         Nota: Imágenes pueden ser adquiridas como solo y varias secciones (por ejemplo, 10 – 15 secciones a lo largo del eje z). Seccionamiento permite la visualización 3D. Adquisición de proyección de imágenes y guardar por separado si es necesario (dependiendo del microscopio). Para una resolución óptima, utilice configuración de láser con baja ganancia, no abrir el agujero de alfiler demasiado y agregar varios promedio por imagen (ver referencias ^{23 , 24} para la discusión general de proyección de imagen confocal). Tenga cuidado al adquirir imágenes con un brillo por debajo del nivel de saturación para permitir la modificación por software de imágenes si es necesario (preferiblemente imágenes de uso sin modificar).
      4. Adquisición de imágenes de doble o multiplicar canales etiquetados (por ejemplo, verde, rojo y azul) de la misma manera, haciendo clic en varios iconos de láser, pero utilizar exploración secuencial para evitar el repintado entre canales (fundamentales para estudios de colocalización).
         Nota: Uno puede necesitar tener en cuenta el tiempo requerido para el escaneo secuencial (que también resulta en un correspondiente aumento en foto blanqueo) y modificar la configuración de escáner. No analizar los animales de una diapositiva durante más de 30 minutos máximo para evitar efectos no específicos en la morfología del canal. Montaje nueva diapositiva si se requiere el análisis más.
      5. Adquirir correspondiente óptica de interferencia diferencial (DIC) / imágenes de Nomarski, particularmente si la cuantificación de canal diámetro longitud y luz en relación con el gusano ’ s cuerpo longitud y diámetro. Superposición de fluorescencia y Nomarski imágenes haciendo clic en “ recubrimiento ” icono para demostrar puntos de referencia ( figura 1 y Figura 4A – D).
   4. Para la cuantificación, medir la intensidad de fluorescencia de un marcado componente de interés de ImageJ software ²⁵ ( figura 5).

Resultados

Este protocolo describe cómo utilizar los canales excretores de C. elegans molecularmente y visualmente analizar tubulogenesis unicelulares y morfogénesis lumen intracelular en una sola celda. Durante su extensión desde el medio de la embriogénesis hasta la edad adulta, los cuatro canales excretores continúan expandiendo su basolateral y membranas apical/lumenal junto con su sistema de endomembrane con canalículos y endosomal, proporcionando un modelo único para el anális...

Discusión

Versatilidad genética de C. elegans , transparencia, plan de cuerpo simple y linaje de la célula de referencia hacen un excelente modelo para el análisis de la morfogénesis. Este protocolo describe cómo combinar manipulación genética estándar e imagen estudios para tomar ventaja de los 2 micrones delgado canales excretores C. elegans para estudiar la membrana polarizada y biogénesis de lumen intracelular en un tubo de la célula.

Etiquetado
Los ca...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cloning
Plasmid pPD95.75	Addgene	Cat. No. 37464
PCR Kit	Qiagen	Cat. No. 27106
Ligation kit	New England Biolabs	Cat. No. E2611L
DNA marker	Thermo Scientific	Cat. No. SM1331
Agarose DNA grade	Fisher Scientific	Cat. No. BP164-100
Competent cells	New England Biolabs	Cat. No. C2987H
Tris	Fisher Scientific	Cat. No. BP154-1
EDTA	Sigma	Cat. No. ED-1KG
Acetic acid	Fisher Scientific	Cat. No. A38S-500
Ethidium bromide	Fisher Scientific	Cat. No. BP1302-10
Equipments
PCR machine	MJ Research	Cat. No. PTG-200
Centrifuge	Eppendorf	Cat. No. 5415C
Water Bath	Precision Scientific	Cat. No. 666A3
Gel running instrument	Fisher Scientific	Cat. No. 09-528-165
Gel running power supply	Fisher Scientific	Cat. No. 45-000-465
Molecular Imager Gel Doc XR System	Bio-Rad	Cat. No. 1708195EDU
Nanodrop Spectrophotometer	Thermo Scientific	Cat. No. ND1000
C. elegans related1			1see reference27 for standard C. elegans culture and maintenance procedures.
LB Medium and plates2			2see reference24 for protocols.
Tryptone	Acros Organics	Cat. no. 611845000
Yeast Extract	BD Biosciences	Cat. no. 212750
NaCl	Sigma	Cat. no. S7653
Bacto Agar	BD Biosciences	Cat. no. 214040
Ampicillin	Sigma	Cat. no. A0116
Tetracycline	Fisher Scientific	Cat. no. BP912
M9 Medium2					2see reference24 for protocols.
NaCl	Sigma	Cat. no. S7653
KH2PO4	Sigma	Cat. no. P0662
Na2HPO4	Sigma	Cat. no. S7907
MgSO4	Sigma	Cat. no. M2773
NGM plates 2			2see reference24 for protocols.
NaCl	Sigma	Cat. no. S7653
Peptone	BD Biosciences	Cat. no. 211677
Tryptone	Acros Organics	Cat. no. 611845000
Bacto Agar	BD Biosciences	Cat. no. 214040
MgSO4	Sigma	Cat. no. M2773
CaCl2	Sigma	Cat. no. C3881
Cholesterol	Sigma	Cat. no. C8667
K2HPO4	Sigma	Cat. no. P3786
KH2PO4	Sigma	Cat. no. P0662
RNAi plates3			3see reference60 for protocols.
NaCl	Sigma	Cat. no. S7653
Peptone	BD Biosciences	Cat. no. 211677
Tryptone	Acros Organics	Cat. no. 611845000
Bacto Agar	BD Biosciences	Cat. no. 214040
MgSO4	Sigma	Cat. no. M2773
CaCl2	Sigma	Cat. no. C3881
Cholesterol	Sigma	Cat. no. C8667
K2HPO4	Sigma	Cat. no. P3786
KH2PO4	Sigma	Cat. no. P0662
IPTG	US Biological	Cat. no. I8500
Carbenicillin	Fisher Scientific	Cat. no. BP2648
NaOH	Fisher Scientific	Cat. no. SS266-1
Sodium hypochlorite	Fisher Scientific	Cat. no. 50371500
Bacteria
OP50 bacteria	CGC
HT115 bacteria	CGC
Genome-wide RNAi libraries
Ahringer genome-wide RNAi feeding library (ref29,49)	Source BioScience
C. elegans ORF-RNAi feeding library (ref50)	Source BioScience
Imaging related
Lidocaine	MP Biomedicals,LLG	Cat. no. 193917
Materials
Vacuum Grease Silicone	Beckman	Cat. no. 335148
Microscope slides	Fisher Scientific	Cat. no. 4448
Microscope coverslips (22×22-1）	Fisher Scientific	Cat. no. 12-542-B
Tissue culture plate, 6 well	Corning Inc.	Cat. no. 08-772-33
Equipment
SMZ-U dissecting microscope (Nikon)
SZX12 dissecting microscope (Olympus), equipped with a high-power stereo fluorescence attachment (Kramer Scientific), CCD camera with Q capture software and X-Cite fluorescent lamp (Photonic Solutions).
TCS SL Laser-scanning confocal microscope (Leica Microsystem)
C2 laser-scanning confocal mounted on an ECLIPSE Ti-E inverted microscope (Nikon)