著者
お問い合わせ

サインイン

このコンテンツを視聴するには、JoVE 購読が必要です。 サインイン又は無料トライアルを申し込む。

この記事について

  • 要約
  • 要約
  • 概要
  • プロトコル
  • 結果
  • ディスカッション
  • 開示事項
  • 謝辞
  • 資料
  • 参考文献
  • 転載および許可

要約

線虫 c. エレガンスの排泄管はde novo偏光膜生合成の視覚的生体内解析のためのユニークな単一細胞モデルです。このプロトコルでは、標準的な遺伝学的/RNAi とアプローチ、同定と解析分子単細胞 tubulogenesis と頂端膜と内腔を演出するための適応をイメージングの組み合わせについて説明します。

要約

4 つのc. の elegans排泄管が狭い管とほぼ同等にまで拡張の細胞内 endotubes を構築し、膜と submembraneous ルーメンの安定化の 1 つのセルから動物の長さまで延長根尖部の文字の骨格。排泄の細胞拡大その長さ約 2,000 倍・ デ ・ ノボ偏光膜器官、細胞内腔の形態形成の生体内評価のためユニークなこのモデルを作るこれらの運河を生成して単細胞tubulogenesis。ここで提示されたプロトコルは、標準のラベル付け、利得と損失-の機能遺伝子や RNA 干渉 (RNAi) を結合する方法を示しています-とこのモデルを使用して視覚的に解剖し、機能分子レベルでこれらのプロセスを分析するミクロ アプローチ。ラベルをつける方法の例としては、プロトコルは、tubulogenesis のライブ解析用蛍光融合タンパク質を持つトランスジェニック動物の世代をについて説明します。遺伝的アプローチの例としてそれは利得関数の嚢胞性の管の表現型を変更するのには設計されています visual RNAi ベース対話画面の重要なポイントを強調表示します。説明する方法がどのようにする: ラベルし、蛍光蛋白質を表現することによって運河を可視化対象となる RNAi ライブラリを構築し、RNAi スクリーニング運河の形態形成の分子分析のための戦略を練る運河の表現の変更を視覚的に評価します。蛍光顕微鏡の解剖によってそれらを獲得します。共焦点顕微鏡から高い解像度で細胞レベル下の運河のコンポーネントを特徴します。視覚パラメーターを定量化します。アプローチは調査官と遺伝子細胞内腔の系統保存のプロセスに関与する、単細胞を定量化のc. の elegans排泄管の活用に興味のある人の役に立つ管形成。

概要

すべての臓器は、チューブ、輸送、ガス、液体、栄養素の交流と老廃物の排泄などの彼らの多くの異なる機能のために重要ので構成されます。異なる腔と頂端膜の偏光文字はこれらの特定の機能に適応、遠藤・膜システムの器官の欠陥人間の病気1,2が頻繁に発生。管血管・臓器の大半は多細胞と、内腔を形成する intercellularly;ただし、単細胞のチューブ内腔を細胞内に形成することができます、人間の毛管ベッド2の 30-50% と同じくらい表すなど。マルチと単細胞チューブの偏光膜のミクロ相分離構造は管の特定の機能 (例えば、線虫の腸絨毛と排泄管細管に基づいて異なる場合がありますが構成で類似しています。線虫;c. の elegans腸 tubulogenesis の紙を伴う参照)3。偏光膜生合成と tubulogenesis の原則は、後生動物の間で維持され、類似分子機械は1,2,4を導きます。

線虫 c. エレガンスの排泄システムは、5 つのセルで構成されています: 排泄細胞 (EC)、管細胞 (DC)、細孔セル (PC) と 2 つの腺細胞。EC、DC、または PC のアブレーションは、体腔と初期の幼虫のステージ5で、動物が死亡の体液貯留を引き起こします。興味を持って、これらの 3 つの単細胞の管は 3 つの異なる方法でそのルーメンを作成: 細胞 (EC) を空洞化。セルの折り返し結合 autocellular 接合の形成 (PC);セルの折り返しによって autofusion (DC); と相まって、すべての系統保存6,7は、内腔の形態の異なるメカニズム。後部咽頭電球の左の側面に位置する EC を送信 2 つ横の拡張 4 つの運河が前方を拡張する進出するからと後方 (両方の左右側) にワームの鼻と尻尾の先端に、それぞれ (図 1)5,6,8。EC は、それに動物の最大のセル 2 x 1,000 μ m に約 1 μ m から延びて.細胞内レベル排泄管基底膜、pseudocoelom に向けて、内腔の膜 (endotube) によるトンネルから生成された、シンプルなチューブです。そののみ細胞間のジャンクション; 管腔膜に接続する管腔膜運河は、それ以外の場合 (図 1) の長さに沿って junctionless。アピカル膜の組成と、腸管などの多細胞管の submembraneous 骨格のような分子構成によって定義された、排泄管腔膜とその submembraneous 骨格が頂、その他 (例えば、フラット) 上皮細胞の。細胞質細胞器官、エンドソーム小胞およびその他 (例えばゴルジ) 運河の長さに沿って分布している膜を含みます。さらに、複数の小管小胞の内腔の膜に接続または相互接続、または分離 - 運河細胞質7,8,9,10 通したか.この動的プラズマ膜/小管接続はさらに運河の膜システムを展開し、形態形成と浸透圧10をルーメンと両方に貢献します。排泄の運河従ってほぼ完全に遠藤と原形質膜、偏光膜生合成の解析と遠藤-膜インターフェイスへの調節のエクセレント モデルを提供することで構成されます。内腔拡張-と一致する単一細胞システム - 運河の形態形成における頂端膜の劇的な拡張も安定化し、細胞内腔側膜を中心に必要性によって生じる建築の問題を分析することができます。.このプロトコルは、EC の位置を生成する細胞の運動を直接信号ではなく管チューブとルーメンの構造形態の創生とこのプロセスに必要な細胞内膜動態の解析に焦点を当てて、排泄システム (文献6) 他の細胞成分との複雑な接続を構築します。

偏光膜と内腔の細胞内器官の分析のためc. の elegans単一セル管システムのそれ以上の利点は発達の時間を通じて、その膜のさまざまなコンポーネントの生成を分離する能力接合します。EC は腹側の閉鎖の時間に生まれ、半ば胚5,6,8延長横方向の運河と分岐が発生する期間中に、咽頭の頬骨横方向に落ち着きます。これが前後運河拡張後期胚形成、L1 - 幼虫 (図 1) に続くプロセス中に続きます。孵化幼虫で後部運河先端にワームのほぼ真ん中、ワーム8と共に延長完全に伸びる尾 L1 ステージの終わり時間後運河。従って動物の成長を上回る速度でアクティブな運河成長終了最初の幼虫の段階で、しかし、さらに成長は、追加幼虫段階 (L2-4) で全体の動物の成長と並行して行われます。この設定は、偏光の細胞分裂または移行の独立したde novo偏光膜器官の異なるステップを分析する機会を提供します。さらに、それは (ルーメン開始前に胚発生) する接合のアセンブリからこのプロセスの分離を許可します。膜の分極を彼らの正確な要件はまだ極性において未解決の問題です。最後に、それは一意に基底膜の拡張、後者の過程は排泄管10の元の前から頂分離します。線虫 c. エレガンスの排泄管モデルが偏光膜生合成の分析のためのこれらの利点の多数を共有するが、多細胞の設定 (参照の実行腸管モデルに特に有益な補完それに伴う紙腸 tubulogenesis3)。

そのルーメンが vi をすることができますこの小さなワームの極薄の細管が野生型運河、この透明な動物にノマルスキー光学系による直接 sualized。実際には、変異の嚢胞性の管の形態解剖顕微鏡前方遺伝スクリーンで大きな効果を tubulogenesis11に関与する遺伝子を識別するために使用されている低倍率を使用してラベルのない動物で特徴付けられます。運河の形態とその偏光膜、骨格成分、異なる細胞内小器官、他の細胞レベル下の構造の違いの改善された可視化ラベリングが必要ですし、高い電力蛍光解離および共焦点の顕微鏡検査。運河の微細構造は、ラベリングと顕微鏡のための困難の数ポーズ、各コンパートメントに固有の特定の分子を介して膜と細胞レベル下のコンポーネントを区別できるし、動物が安全に場合は、マウント顕微鏡用特定のアーティファクト (プロトコルおよび議論を参照) を導入することを避けるために予防措置を。ラベリングを行う固定標本の免疫組織化学によってまたは彼らの自身の制御の下で蛍光融合蛋白質を表現する遺伝子組換えのワームを生成することによってまたは生体内イメージングの排泄管特異的発現プロモーター。このプロトコルを記述する後者のラベリング手法 (抗体染色3腸 tubulogenesis の付属の紙を参照)。

生体内でイメージ投射単一細胞解析と体内の損失または利得-の機能研究を結合する能力はc. の elegansの排泄管分子に特に強力なモデル開発作る全体レベルと単細胞の tubulogenesis の細胞の解析。運河の形態表現型 (例えば、嚢胞) を識別するために野生型またはラベル付けの遺伝子組換え動物から始まる前方または逆引き遺伝子スクリーニングを行うことが、その基になる遺伝子欠陥。また、このような画面 (例えば、嚢胞性の管) の突然変異形質を開始し、抑制やエンハンサーこの表現型の突然変異体の表現型の原因遺伝子をもつ遺伝子機能的相互作用を識別する識別。突然変異体の表現型を引き起こす遺伝的欠陥は、(例えば遺伝子の欠失を経由) の損失または利得を引き起こすことができる (例えば、を介して活性化突然変異か余分な遺伝子のコピーの導入を通した) 調査関数の。前方変異または体系的な RNAi 画面は遺伝子機能に先入観なしであり、公平な関心の機能に関与する遺伝子同定を許可します。ゲノムワイド RNAi ライブラリを供給の可用性、与えられたほとんどすべての遺伝子を簡単に倒す方法線虫、RNAi による興味の単一の遺伝子または遺伝子 (例えば、対象となる画面) のグループも急速に検出できるように逆遺伝学アプローチの影響。アプローチの可能な組み合わせを示すためには、ここで述べる対象 RNAi 操作画面では、機能獲得の嚢胞性の排泄管の突然変異から始まる細胞質管緑色蛍光タンパク質 (GFP) が付いた。突然変異体の表現型は、 erm 1、非常に節約された線虫の過剰発現によって生成された膜アクチン リンカー家族・ エズリン ラデキシン モエシン (ERM) は、膜と内腔の形態形成に関与しているのオーソログ多くの種12組織。C. の elegans ERM 1 排泄管や腸などの内臓の内腔の膜に局在する、両方の13の管腔形成に必要です。ERM 1 過剰発現は、余分なアクチンおよび管の内腔側膜内腔量の増加、短い嚢胞性の管と肥厚したアクチン下塗り9圧着内腔の膜を生成する小胞を募集します。プロトコルは、融合蛋白質 (または他の蛋白質) というラベルの付いた排泄運河発現トランスジェニック系統を生成する方法をについて説明しますこのようなひずみは、運河の表現型; の修飾子を識別するで始まるターゲットの RNAi 画面を実行する方法有益な tubulogenesis の表現型を定量化するための簡単な方法を含め、蛍光解離性と共焦点顕微鏡によるこのような画面の結果を視覚的に分析する方法。腸 tubulogenesis3に付属の紙の代わりにラベリング技術および RNAi、しばしば致命的な tubulogenesis 遺伝子の調整の詳細を見つけることができます。すべてのメソッドは、運河 tubulogenesis の他の質問の調査のためのさまざまな組み合わせで使用できます。

プロトコル

1 蛍光融合タンパク質 14 c. の elegans 排泄運河をラベリング

注: 腸内 tubulogenesis に付属のペーパーを参照してください 3。 その場で 抗体染色法を排泄管に適応によって分類するため。C. の elegans 排泄運河遠藤 - と原形質膜、プロモーターの排泄管式を運転の例について 表 2 を可視化できる便利な分子の例については 表 1 を参照してくださいと 表 3 マーカーとプロモーターのより包括的なコレクションのためのリソースなど異なった fluorophores の選択を議論の参照

。
  1. 制限の酵素によって組織特異的蛍光マーカー プラスミッドの構造ベースのクローン作成 15
    注: 代替技術を構築するため の議論 を参照してください蛍光融合タンパク質。
    1. (転写融合) のプロモーターまたは WormBase 44 (並進融合) のためのプロモーターと関心の全遺伝子のシーケンスを識別します
      。 注: のプロモーター、約 1 – 3 プラスミド (kb) は、ほとんどの c. の elegans 遺伝子だけで十分です。並進の融合蛋白質は、排泄管特異的プロモーターの下で興味の遺伝子を配置することで構築できます (表 2 を参照).
    2. (並進融合) のプロモーター (転写融合) のプロモーターによる遺伝子の増幅の前方および逆のプライマーを設計します。5 制限の酵素リンカーを追加 ’、3 ’ プライマーの端です
      。 注: は、ベクトル (例えば pPD95.79) プラスミド 16 に存在する制限酵素を選択します。並進の融合、3 の ’ リンカーは制限の酵素の消化力、ベクターを使用して結紮後挿入コドン フレームが蛍光体 など GFP のコドンと連続になりますように設計する必要があります。1 つは典型的な制限酵素リンカー 14; に 1 または 2 の基地を追加する必要があります。終止コドンを作成しないように注意してください
      3. 。
    3. 実行ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) プロモーターまたはテンプレート 15 ライブ ワームまたは野生型 DNA または cDNA を用いたフルレングスの遺伝子を増幅するため
      。 注: テンプレートとしてワームを使用する場合、換散バッファー (PCR バッファー プラス プロティナーゼ K) 17 でワームを最初溶解します。混合段階ワームは、テンプレートとして使用することができます。細菌の DNA の混入を避けるために飢えたワームを使用できます
      4. 。 増幅産物の正しいサイズを識別するために PCR 産物の電気泳動のゲルの
    4. の実行 agarose (1%) です
      。 メモ: バンドのサイズが正しい場合は、次の手順に進みます。複数のバンドを生成している場合は、単一のバンドを生成する増幅条件を改善します。これが動作しない場合ゲルから正しいバンドをカット、標準的な方法 15 DNA を浄化し、次の手順に進みます
      5. 。
    5. PCR の製品の標準的な方法 15 の個別のチューブの蛍光体 (例えば pPD95.79) を含むベクトル プラスミド実行制限のダイジェストします
      6. 。
    6. 消化の Dna をゲル電気泳動分離し、溶出が PCR の製品の個別のチューブ内の DNA バンドをベクトルします
      7. 。
    7. は、標準的な方法 15 ゲルのスライスから Dna を浄化します。分光光度計によって DNA の濃度を測定します
      8. 。
    8. PCR の製品を縛ると標準的な方法で DNA をベクターし、有能なセルの標準的な方法 15 組換え Dna に変換します
      9. 。
    9. 広がる 10 μ、50 μ L、100 μ L の 50 μ g/mL アンピシリンと補われる 3 つの個々 のルリア スープ (LB) プレートに変換されたセル
      。 注: 変換効率のスペクトルの異なるプレートの上に細胞の量が異なるを広めます。例えば、メッキがあまりにも密集が許さないコロニーの分離変換が効率的な場合
      10. 。
    10. は、37 ° C でプレートを一晩インキュベートします。次の朝、インキュベーターからプレートを取り出す
      。 注: 植民地が非常に小さい場合孵化させなさいいくつかのより多くの時間
      11. 。
    11. 準備プラスミド Dna 標準方法 15 シングル コロニーから。テンプレート DNA とプライマーを混合し、シーケンス (通常コア サービス センターで実行されます) のために送信します
      12. 。
    12. シーケンスを読むし、融合の構造の整合性を検証します
      。 注: 重要: 挿入された遺伝子と蛍光マーカー遺伝子翻訳の融合のための正しいコドン フレームを確認します。理想的には、シーケンス全体の遺伝子 PCR および結紮処置中に導入された変異がないことを確認します
      13. 。
    13. ステップ 1.2 注射に、(ステップ 1.1.11 を使用して) より多くのプラスミッド DNA を生成します
      14. 。
  2. 世代 生殖変換のための DNA の微量注射によるトランスジェニック動物の 18
    注: 遺伝子を導入するための代替技術の議論を参照してください。輪郭を描かれたプロシージャは、蛍光融合タンパク質または興味の他の蛋白質を運ぶトランスジェニック動物を生成する使用できます。例えば、外因性タンパク質が新たに導入された (例えば、異種のオーソログ) することができます。 または内因性のタンパク質を (例えば、救助の対応する生殖細胞系列変異体) に再導入または過剰に発現して (例えば、射出表現型を生成することができます。erm 1 のによって使用された変更のためのターゲットとして機能する過剰発現嚢胞性の管の表現型を生成する RNAi 相互作用の画面が以下に説明)。
    1. ミックス構築 DNA (1 – 50 ng/μ L) マーカー プラスミッド DNA (通常 100 ng/μ L)、例えば支配的なマーカーの rol-6 (su1006) と (1.2.3 マーカーのオプションを参照してください).
      注: 重要な: 注入された DNA の濃度は、経験的とき artefactual 表現型 (嚢胞、拡張欠陥、致死) の導入を避けるために決定する必要がある特に排泄管での遺伝子発現遺伝子発現に敏感。1 つは例えばと実行可能なひずみの生成を濃度の範囲をテストする 1 ng/μ L、10 ng/μ L、50 ng/μ L、100 ng/μ L の rol-6(su1006) の 100 ng/μ L の濃度でプラスミドのいくつかの混合物をすることも、目的の式または表現型 (高濃度非具体的運河の形態形成のため有毒であることが多い、致命的な場合があります).
    2. 0.22 μ m (マイクロ メートル) 細孔サイズ スピン x 遠心チューブ フィルターを介して DNA 混合物をフィルタ リングします
      。 注: を放置しないでください、チューブの蓋マイクロインジェクション針をブロックすることができますほこりを避けるためにオープンします
      3. 。
    3. は、生殖細胞への変換のための標準的な方法で野生型と変異体のワームの生殖腺に組換えのプラスミッドを microinject (詳細については手順参照 18 を参照してください).
      注: 標準的なマーカーのプラスミドは、例えば: rol-6(su1006)、使う 20、unc 119、pha 1。救出 transgenes は彼らのそれぞれの変異体に導入されるに対し、rol-6(su1006) のような支配的な遺伝子が野生型のワームに導入されます。マーカー プラスミッド、遺伝子組換えのラインのメンテナンスが容易な co 注入した染色体外遺伝子は細胞分裂の中にランダムに失われますので (1.2.8 を参照)。蛍光融合の遺伝子を注入すると、いずれかを使用できます GFP、fluorophore マーカーとしての地位。rol 6 誘導の形態形質の評価のために有利であることが多い自分の周りロールバックするワームです
      4. 。
    4. 大腸菌 に注入伝虫シード線虫成長媒体 (NGM) 板 (例えば、5 ワーム/プレート) (参照してください参照 19 標準的な c. の elegans 文化とメンテナンスの手順と材料のテーブル).
    5. プレートをインキュベートし、約 20 ° C で開発の子孫 d.
    6. は、Rol (ローリング) ワーム (または、その他特定の噴射のマーカー、例えば GFP) の解剖顕微鏡の下で F1 子孫を調べるし、ローラ t を選択o 個々 のプレートします
      7. 。
    7. F2 動物を圧延板を選択し、解離蛍光顕微鏡下で蛍光性の存在を確認 (通常はローラのすべての動物、GFP 陽性).
      注: F2 ローラーはトランスジェニック ラインの成功の世代を示しています。個々 の行が異なる、ことがあります 例えば、transgene 伝送速度に関して。したがってを維持し、いくつかの行を保存すると便利です
      8. 。
    8. マーカー陽性動物のための新しい板を富ませることによって形質転換線を維持します
      。 注: 挿入された DNA は、染色体外配列として生殖細胞に組み込まれます。染色体外配列の伝送速度は、一般的に周り 〜 50% が変数です。緊張を失わない、それは手動で (例えば、負の淘汰によってセキュリティ保護されていない線) 支配的なマーカーでラインを豊かにする重要なためです
      9. 。
    9. は-80 ° C 19 で長期的な保存のための標準の凍結技術で形質転換線を凍結します
      。 注: 染色体外配列に Transgenes もに統合できます生殖均質な線 18 を生成するための追加の手順で UV 照射による。たとえば、erm 1 は ERM 1 + [+] ひずみ UV 照射による生殖細胞に統合された fgIs2[erm-1p::erm-1;rol-6p::rol-6(su1006)] 場所すべての動物を運ぶ遺伝子、RNAi ベースでの使用のための要件下記操作画面。この株はさらに vha 1 p を含むひずみの交差点を介して細胞質の排泄管 GFP による標識された:: GFP 遺伝子 (上記で説明したのと同じ手順によって生成される; 基本的な遺伝的参照 20 を参照してください十字架などのプロシージャ) ERM 1 + [+]; といいますとvha 1 p:: GFP ひずみ以下
      10. 。

2。対象とした RNAi ライブラリと運河の表現型を変更するのには RNAi の操作画面のデザインの構築

注: 対象となる RNAi ベース遺伝的相互作用画面説明に過剰発現嚢胞性の管の表現型を使用します。相互作用排泄管の形態形成遺伝子の探索。ERM 1 + [+] ひずみは、例 9 として機能 (1.2.9 の手順を参照してください)。このアプローチは排泄管内腔の形態形成の遺伝学的解析のための多くの可能なアプローチの 1 つだけをプレゼント (他の遺伝的アプローチの 導入 および 議論 を参照)。腸 tubulogenesis 3 と参照 17 , 21 , 22 の RNAi、RNAi の詳細については付属の紙を見る手順、(しばしば致命的な tubulogenesis 遺伝子調整) RNAi 強度変調と技術的な問題の議論は、RNAi に接続されています。標準的なワーム文化とメンテナンスおよび 材料のテーブル のための参照 19 を参照してください

。
  1. ERM 1 (または興味の他の遺伝子) の検索データベースで公開された記事相互作用する分子
    。 注: 潜在的な ERM 1 インターアクターがどんな種の ERM 蛋白質と相互作用機能、遺伝的にまたは物理的にことが示された実験的および/または任意 インシリコ、高スループットによってそうために予測されたすべての分子が含まれてまたはシステム生物学のアプローチ (データベースおよびリソースの例については 表 3 を参照してください).
  2. はすべての遺伝子の一覧を生成し、線虫 ホモログを見つける必要
    。 注: 興味の遺伝子の機能を考慮し、インターアクターを識別するためネットを広げる遺伝子のクラスに識別された遺伝子のリストの展開を検討してください (例えば、膜アクチン リンカー ERM-1、すべてアクチンを選択し、アクチン関連分子).
  3. 識別対応する RNAi バクテリアのすべての遺伝子のために市販のゲノム細菌 RNAi ライブラリ内のクローンを供給 (例えば、Ahringer ゲノム 線虫 RNAi ライブラリ 21 を供給;材料表)
  4. すべての遺伝子および対応する RNAi プレートおよび井戸のためのスプレッドシートを作成します
    5. 。
  5. ピックアップ LB/アンピシリン/テトラサイクリン プレート (抗菌薬の選択は図書館の建設によって決まります) 1 日あたりの ~ 50 の RNAi のクローンを連勝し、続行まで対象とした RNAi ライブラリが生成されます
    。 注: 投影されたワークフローのライブラリのサイズ、に応じて完全なライブラリを生成を省略し、直接バッチ分析を続行します。プレートは、もはや (必要な場合、再新しいプレートの上にその後連勝) 約 2 週間以上のための 4 ° C で保存できます。逆に、1 つは-80 で長期保管のため複製 96 または 384 ウェル フォーマットの大きい冷凍ライブラリを生成できます ° C
  6. は、37 ° C でプレートを一晩インキュベートします。次の朝、削除板インキュベーターと店から 4 ° C
  7. 選択 RNAi 細菌によって生殖不能のつまようじ板から 1.5 mL マイクロ チューブの LB/アンピシリン (50 ng/μ L) スープ 600 μ L と細菌をミックス、37 ° C でチューブを孵化させなさい、6 h に振る
    注: は、チューブの側面に沿ってピックアップ (つまようじまたはピペットの先端) をこすることによってスープに RNAi 細菌を接種する
    8. 。
  8. シード 70 μ L は、帳票の写しセットで 6 ウェル RNAi プレートの各ウェルに細菌を培養しました。22 ° C で RNAi プレートを一晩インキュベートします
    。 注: RNAi 板は標準的な手順 (テーブルの材料 と参照 3 , 17 , 21) によって生成され、ここで 6 も組織で使用でき、プレート上の生きている動物の運河の形態形成の微視的評価高いスループットのアプローチ文化プレート形式
    9. 。
  9. 次の朝、ピック 3 L4 段階 ERM 1 + [+];vha 1 p:: GFP の RNAi プレートの各ウェルにワームします。
    1. (参照 19 参照) 最初 RNAi を妨げる OP50 細菌汚染を避けるため細菌なし NGM プレート上にワームをシードし、約 10 分間クロール動物。健康な動物の非餓死をのみ使用します
      2. 。
  10. 子孫を生産する動物を許可する 3 d の 22 ° C でプレートをインキュベートします
    11. 。
  11. 解離性蛍光顕微鏡下で F1 子孫で調べる運河表現します
    12. 。

3。生体内で蛍光を解剖顕微鏡および Tubulogenesis の表現型の得点による 線虫 の排泄管のイメージング

  1. 準備表現型スコアリング シート (表 4 に示す例と 図 5).
  2. 蛍光 dissectin の直下にワームと寒天プレートを配置します。g 顕微鏡、評価、プレートのオープン蓋使用集中する低倍率
    。 注: このプロトコルは 1.5 倍と 10 倍目標と 3.5 から 45 (材料表) のズーム範囲を使用するスコープの使用を説明します
    3. 。
  3. も別にそれぞれに焦点を当て、よく 1 から始まる動物を評価し、プレートを動作します
    。 注意: は、常にコントロールの評価から始まります。例えば、モック (空のベクター) コントロール (HT115 RNAi 細菌 (を参照してください参照 17 , 21) なし、または無関係遺伝子挿入) を負し、正の適切な制御、例えば でこの相互作用の画面、erm 1 (ERM 1 + [+] 表現型は抑制される) RNAi と sma 1/スペクトリン (ERM 1 + [+] 運河の表現を高める) RNAi
    4. 。
  4. に、まず一般的な表現型の明るい光の下で目に見える (たとえば: Clr/クリアしましょう/致死、Emb/胚致死、Ste/滅菌、Unc/まとまりのない、使う/みすぼらしい、等)、動物および数の合計数をカウントすることによって表現型を定量化表現型を持つ動物、レコード番号 (表 4 参照).
    注: 運河の表現型 (例えば、組込みシステム、Ste) の評価に影響を与える可能性があります欠陥を原因となる遺伝子のノックダウンを検討する条件で実験を繰り返し、投稿胚性 RNAi (手順 3 の紙を添付参照してください).
  5. 第二に、蛍光灯の光の下での排泄管の表現型を調べる、定量化可能な表現型 (例えば 運河の長さ、嚢胞腔の幅) をスコア、番号を記録、スコアリング シートの表現型を記述する (表 4 を参照してください <。強いクラス ="xfig"> 図 5).
    注: 高倍率ズームの範囲より多くの微妙な運河の表現型を評価する必要です。低と高倍率運河を慎重に評価する間、前後移動 ’ s の長さおよび幅と任意の他の運河の形態の表現型。定量化または単純な表現型の半定量化、カウント 100 動物 (例えば、この対象となる RNAi スクリーニングに L4s; 表現型: 運河の 1/4、1/2、3/4 長さと完全な後部運河の拡張と後部運河の内腔径小嚢胞 (< 動物に幅の 1/3)、大きな嚢胞 (> 動物に幅の 1/3);表 4 を参照してください).
  6. 顕微鏡によって少なくとも 3 の異なる動物から支配的な表現型の取得イメージ マウント デジタル電荷結合素子 (CCD) カメラと対応する画像処理ソフトウェア (材料表 参照)
      画像、
    1. カメラの電源、オンに接続されているコンピューター、イメージ キャプチャ ソフトウェア アイコンをダブルクリックして、低倍率の下で手動でワーム プレートの領域に焦点を当てるとカメラのシャッターを開く最初
      2. 。 クリックして
    2. 、“ ライブ プレビュー ” イメージ キャプチャ ソフトウェア コンピューターの画面上のワームを視覚化するためのコンピューターの画面上のアイコンは、明らかに画面で、ワームを視覚化しをクリックして手動でフォーカスを調整、“ スナップ ” アイコン、し、クリックして、“ 保存 ” アイコン
      。 動物は、蛍光灯の光の下で高速移動したがって注意: 1 つの手コンピューターのマウスを準備ができている一方で関心のある領域にプレートを移動しながら。速やかにクリックして、“ スナップ ” アイコン画像が取得できます。それは通常いくつかの試行で良好な画像を得ることが可能です
      3. 。
    3. は、適切なファイル名で取得した画像を保存 (緊張の名前、RNAi クローン名、日付を含む).
      注: 細くて長い運河と高速移動の野生型ワームは突然変異体のよりも画像より困難です。嚢胞性の管および/または他の表現型の突然変異体は、イメージングを進め、ゆっくりと動く可能性があります。Rol などマーカー プラスミッドは動物を保つことによってイメージングのために便利することができます “ スポット ” はなく、転送、移動、動物自体の周りにローリングと表現型に改良されたビューもあります
      4. 。

4。レーザー走査型共焦点顕微鏡による高解像度で c. の elegans の排泄管のイメージング

の先端、または綿棒の先端で
  1. の 生きている動物をマウント
    1. グリスまたはワセリンの少量を配置、指をインデックスし、の直径の極薄円を生成するグリースを広める 〜 6 – きれいなガラス スライドの真ん中に 8 mm です
      2. 。
    2. マイクロ ピペットによる円に場所 6 μ L 5% リドカイン液 (麻酔).
      注: リドカインの原液は水でリドカイン粉末を溶解することにより可能です。M9 バッファー 19 (材料表) で 5% に希釈します。破裂する嚢胞が発生して、運河の表現型を誘発する (アジ化ナトリウム) など一般的な固定化ソリューションを避けるために排泄管の分析が重要です
      3. 。
    3. RNAi プレートからいくつかの動物を選択し、ソリューションにワーム選択 19 を immerging でリドカイン液にそれらを配置します
      。 注: できればステージ固有動物均一の太さによっても取付を容易にするを選択します。動物は、解離性の蛍光顕微鏡で事前に選択できます
      4. 。
    4. スライド ガラス上に 22 mm × 22 mm coverslip の場所; せて優しくグリース円に落ち着く
      。 注: は運河形態、特に変異体や運河とおそらく他の表現型 RNAi 扱われるワームに損傷を与える可能性があります、上の任意の物理的な圧力を適用されません。そのため厚いグリース円を避けるために重要です。理想的に、動物には優しくスライド ガラスとカバーガラスの間が挟まれています
      5. 。
    5. は、スライド ガラスの霜で覆われた側のサンプルの名前を書きます。すぐに運河の表現型解析画像を取得する共焦点顕微鏡スライドを取る
      。 メモ: 遅延は管嚢胞の損傷の結果、管腔の形態を変更します
      6. 。
  2. 獲得共焦点画像
    1. 共焦点顕微鏡の試料ステージにスライドを配置、低倍率 (10 倍) でワームに焦点を当てるです
      2. 。 下 60 X および/または 100 X の目標、
    2. ビューと選択動物を調べる排泄管 ’ s 携帯と細胞の表現型、例えば、内腔形状と直径、サイズと形状の嚢胞; またはというラベルの付いた解析、細胞レベル下のコンポーネント 例えば、頂/内腔の膜基底膜、細胞質、毛細小胞とエンドソーム、他の細胞内小器官 (ディスカッション 図 2、および 図 4 を参照).
    3. 興味の特定の表現型の画像を取得します
      。 注: このプロトコルでは、走査型レーザー共焦点顕微鏡 (材料表) の使用について説明します。細い 線虫 の細胞レベル下のコンポーネントを解決するには、排泄運河、高い倍率の目的 (100 X 60 X) が必要です。回転ディスク共焦点顕微鏡時間経過画像を取得する使用できますが、以下の confocality を提供しています (説明 を参照)。
      1. 共焦点画像を取得するコンピューターの電源を共焦点顕微鏡のソフトウェアをダブルクリックして、特定のレーザーのアイコンをクリックして、レーザーを選択します
        2. 。
      2. をクリックして、“ スキャン ” コンピューターの画面に焦点を当てたワームを視覚化するアイコンを通してレーザー強度を調整、ソフトウェア、およびにもう一度クリック “ スキャン ” アイコンをクリックして、スキャンを停止する “ キャプチャ ” アイコンをクリックして、イメージをキャプチャを “ 保存 ” アイコン
        3. 。
      3. は、適切なファイル名で画像を保存、RNAi クローン名、緊張の名前と日付
        。 注: 画像は、単一および複数のセクションとして得ることができる (例えば、10 – z 軸に沿って 15 セクション)。断面には、3次元可視化することができます。投影像を取得し、(顕微鏡) に応じて必要な場合、個別に保存します。最適な解像度は、低利得とレーザー設定を使用して、ピンホールをあまりにも多く、オープンしていない画像ごといくつか平均を追加 (を参照してください参照 23 , 24 共焦点イメージングの一般的な議論のため)。(できればそのまま使用画像) を必要な場合は、画像処理ソフトでの変更許可に飽和レベル以下の明るさで画像を取得する注意してください
        4. 。
      4. ダブルの画像を取得または複数のレーザーのアイコンをクリックして同じ方法でラベル付けされた運河 (例えば 緑、赤と青) を乗算が写り (共局在の研究重要) チャンネル間を避けるためにシーケンシャル スキャンを使用します
        。 注: 1 つは (これも対応する結果の増減写真漂白) 順次スキャンに必要な時間を考慮し、スキャナーの設定を変更する必要があります。30 分以上運河形態に非特異的効果を避けるために最大 1 つのスライドから動物をスキャンしません。長いスキャンが必要な場合は、新しいスライドをマウントします
        5. 。
      5. 取得対応する微分干渉光学系 (DIC)/ノマルスキー画像、特に場合は、定量化運河ワームに関連して長さと内腔の直径 ’ s 体の長さと直径です。クリックしてオーバーレイ蛍光とノマルスキー画像 “ オーバーレイ ” ランドマークを示すアイコン ( 図 1 および 図 4 a – D).
    4. 定量化, ImageJ ソフトウェア 25 ( 図 5) で関心のラベル付きコンポーネントの蛍光強度を測定します
      5. 。

結果

このプロトコルでは、単細胞の tubulogenesis と単一セルの細胞内腔の形態を視覚的に分子解析線虫排泄運河を使用する方法について説明します。成人中期胚発生の時から内線中に排泄運河の 4 つの基底、小管とエンドソーム内システム、ユニークなモデルを提供すると共に頂/内腔の膜を拡大し続けるde novoの生体内解析の偏光膜器官 (...

ディスカッション

線虫の遺伝的多様性、透明性、シンプルなボディ計画、不変の細胞系譜が形態形成の解析のための優れたモデルを作る。このプロトコル記述する標準的な遺伝的操作とイメージングを組み合わせる方法を 2 ミクロンの活用研究薄い偏光膜と単一細胞管の内腔の細胞内器官を検討する線虫排泄運河。

ラベリング
ライブ解析 (ここを参照)、許可?...

開示事項

著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

謝辞

我々 は感謝 m. ビュークナー (カンザス大学、カンザス、米国)、k. Nehrke (ロチェスター大学医療センター、ロチェスター、ニューヨーク、米国)、および健康の国民の協会、事務所の研究基盤出資線虫遺伝学センタープログラム (P40 OD010440)。この作品は、英領バージン諸島に SAA 223809、MGH は 224570 NIH の GM078653 の助成金によって支えられました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Cloning
Plasmid pPD95.75AddgeneCat. No. 37464
PCR KitQiagenCat. No. 27106
Ligation kitNew England BiolabsCat. No. E2611L
DNA markerThermo ScientificCat. No. SM1331
Agarose DNA gradeFisher ScientificCat. No. BP164-100
Competent cellsNew England BiolabsCat. No. C2987H
TrisFisher ScientificCat. No. BP154-1
EDTASigmaCat. No. ED-1KG
Acetic acidFisher ScientificCat. No. A38S-500
Ethidium bromideFisher ScientificCat. No. BP1302-10
Equipments
PCR machine MJ ResearchCat. No. PTG-200 
CentrifugeEppendorf Cat. No. 5415C
Water BathPrecision Scientific Cat. No. 666A3 
Gel running instrumentFisher ScientificCat. No. 09-528-165
Gel running power supplyFisher ScientificCat. No. 45-000-465
Molecular Imager Gel Doc XR SystemBio-RadCat. No. 1708195EDU
Nanodrop SpectrophotometerThermo ScientificCat. No. ND1000
C. elegans related11see reference27 for standard C. elegans culture and maintenance procedures.
LB Medium and plates22see reference24 for protocols.
Tryptone Acros OrganicsCat. no. 611845000
Yeast ExtractBD BiosciencesCat. no. 212750
NaClSigmaCat. no. S7653
Bacto Agar BD BiosciencesCat. no. 214040
AmpicillinSigmaCat. no. A0116
TetracyclineFisher ScientificCat. no. BP912
M9 Medium22see reference24 for protocols.
NaClSigmaCat. no. S7653
KH2PO4SigmaCat. no. P0662
Na2HPO4SigmaCat. no. S7907
MgSO4SigmaCat. no. M2773
NGM plates 22see reference24 for protocols.
NaClSigmaCat. no. S7653
Peptone BD BiosciencesCat. no. 211677
Tryptone Acros OrganicsCat. no. 611845000
Bacto Agar BD BiosciencesCat. no. 214040
MgSO4SigmaCat. no. M2773
CaCl2SigmaCat. no. C3881
Cholesterol SigmaCat. no. C8667
K2HPO4 SigmaCat. no. P3786
KH2PO4SigmaCat. no. P0662
RNAi plates33see reference60 for protocols.
NaClSigmaCat. no. S7653
Peptone BD BiosciencesCat. no. 211677
Tryptone Acros OrganicsCat. no. 611845000
Bacto Agar BD BiosciencesCat. no. 214040
MgSO4SigmaCat. no. M2773
CaCl2SigmaCat. no. C3881
Cholesterol SigmaCat. no. C8667
K2HPO4 SigmaCat. no. P3786
KH2PO4SigmaCat. no. P0662
IPTG US BiologicalCat. no. I8500
CarbenicillinFisher ScientificCat. no. BP2648
NaOHFisher ScientificCat. no. SS266-1
Sodium hypochloriteFisher ScientificCat. no. 50371500
Bacteria
OP50 bacteriaCGC
HT115 bacteriaCGC
Genome-wide RNAi libraries
Ahringer genome-wide RNAi feeding library (ref29,49)Source BioScience
C. elegans ORF-RNAi feeding library (ref50)Source BioScience
Imaging related
LidocaineMP Biomedicals,LLGCat. no. 193917
Materials
Vacuum Grease SiliconeBeckmanCat. no. 335148
Microscope slides Fisher ScientificCat. no. 4448
Microscope coverslips (22×22-1）Fisher ScientificCat. no. 12-542-B
Tissue culture plate, 6 well Corning Inc.Cat. no. 08-772-33
Equipment
SMZ-U dissecting microscope (Nikon)
SZX12 dissecting microscope (Olympus), equipped with a high-power stereo fluorescence attachment (Kramer Scientific), CCD camera with Q capture software and X-Cite fluorescent lamp (Photonic Solutions).
TCS SL Laser-scanning confocal microscope (Leica Microsystem)
C2 laser-scanning confocal mounted on an ECLIPSE Ti-E inverted microscope (Nikon)

参考文献

  1. Lubarsky, B., Krasnow, M. A. Tube morphogenesis: making and shaping biological tubes. Cell. 112 (1), (2003).
  2. Sundaram, M. V., Cohen, J. D. Time to make the doughnuts: Building and shaping seamless tubes. Semin. Cell Dev. Biol. S1084-9521, 30130-30136 (2016).
  3. Zhang, N. The C. elegans intestine as a model for intercellular lumen morphogenesis and in vivo polarized membrane biogenesis at the single-cell level. JoVE. , (2017).
  4. Andrew, D. J., Ewald, A. J. Morphogenesis of epithelial tubes: Insights into tube formation, elongation, and elongation. Dev. Biol. 341 (1), 34-55 (2010).
  5. Nelson, F. K., Albert, P. S., Riddle, D. L. Fine structure of the Caenorhabditis elegans secretory-excretory system. J. Ultrastruct. Res. 82 (2), 156-171 (1983).
  6. Sundaram, M. V., Buechner, M. The Caenorhabditis elegans Excretory System: A Model for Tubulogenesis, Cell Fate Specification, and Plasticity. Genetics. 203 (1), 35 (2016).
  7. Altun, Z. F., Hall, D. H. Excretory system. WormAtlas. , (2009).
  8. Buechner, M. Tubes and the single C. elegans excretory cell. Trends Cell Biol. 12 (10), 479-484 (2002).
  9. Khan, L. A. Intracellular lumen extension requires ERM-1-dependent apical membrane expansion and AQP-8-mediated flux. Nat. Cell Biol. 15 (2), 143-156 (2013).
  10. Kolotuev, I., Hyenne, V., Schwab, Y., Rodriguez, D., Labouesse, M. A pathway for unicellular tube extension depending on the lymphatic vessel determinant Prox1 and on osmoregulation. Nat. Cell Biol. 15 (2), 157-168 (2013).
  11. Buechner, M., Hall, D. H., Bhatt, H., Hedgecock, E. M. Cystic canal mutants in Caenorhabditis elegans are defective in the apical membrane domain of the renal (excretory) cell. Dev. Biol. 214 (1), 227-241 (1999).
  12. Fehon, R. G., McClatchey, A. I., Bretscher, A. Organizing the cell cortex: the role of ERM proteins. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11 (4), 276-287 (2010).
  13. Gobel, V., Barrett, P. L., Hall, D. H., Fleming, J. T. Lumen morphogenesis in C. elegans requires the membrane-cytoskeleton linker erm-1. Dev. Cell. 6 (6), 865-873 (2004).
  14. Sambrook, J., Sambrook, J., DW, R. u. s. s. e. l. l. . Molecular cloning: a laboratory manual. , (2006).
  15. Fire, A., Harrison, S. W., Dixon, D. A modular set of lacZ fusion vectors for studying gene expression in Caenorhabditis elegans. Gene. 93 (2), 189-198 (1990).
  16. Kamath, R. S., Ahringer, J. Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans. Methods. 30 (4), 313-321 (2003).
  17. Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans. Gene. 263 (1-2), 103-112 (2001).
  18. Pawley, J. B. . Handbook of Biological Confocal Microscopy. , (2006).
  19. Hibbs, A. R. . Confocal Microscopy for Biologists. , (2004).
  20. Bankhead, P. . Analyzing fluorescence microscopy images with ImageJ. , (2014).
  21. Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans. Genetics. 157 (3), 1217-1226 (2001).
  22. Frøkjaer-Jensen, C. Single-copy insertion of transgenes in Caenorhabditis elegans. Nat. Genet. 40 (11), 1375-1383 (2008).
  23. Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C. elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO J. 10 (12), 3959-3970 (1991).
  24. Barrangou, R. Cas9 Targeting and the CRISPR Revolution. Science. 344 (6185), 707-708 (2014).
  25. Dickinson, D. J., Goldstein, B. CRISPR-Based Methods for Caenorhabditis elegans Genome Engineering. Genetics. 202 (3), 885-901 (2016).
  26. Esposito, D., Garvey, L. A., Chakiath, C. S. Gateway cloning for protein expression. Methods Mol. Biol. 498, 31-54 (2009).
  27. Gibson, D. G. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat. Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  28. Hobert, O. PCR fusion-based approach to create reporter gene constructs for expression analysis in transgenic C. elegans. Biotechniques. 32 (4), 728-730 (2002).
  29. Jorgensen, E. M., Mango, S. E. The art and design of genetic screens: caenorhabditis elegans. Nat. Rev. Genet. 3 (5), 356-369 (2002).
  30. Berry, K. L., Bulow, H. E., Hall, D. H., Hobert, O. A. C. elegans CLIC-like protein required for intracellular tube formation and maintenance. Science. 302 (5653), 2134-2137 (2003).
  31. Mattingly, B. C., Buechner, M. The FGD homologue EXC-5 regulates apical trafficking in C. elegans tubules. Dev. Biol. 359 (1), 59-72 (2011).
  32. Shaye, D. D., Greenwald, I. The disease-associated formin INF2/EXC-6 organizes lumen and cell outgrowth during tubulogenesis by regulating F-actin and microtubule cytoskeletons. Dev. Cell. 32 (6), 743-755 (2015).
  33. Lant, B. CCM-3/STRIPAK promotes seamless tube extension through endocytic recycling. Nat. Commun. 6 (6), 6449 (2015).
  34. Paupard, M. C., Miller, A., Grant, B., Hirsh, D., Hall, D. H. Immuno-EM localization of GFP-tagged yolk proteins in C. elegans using microwave fixation. J. Histochem. Cytochem. 49 (8), 949-956 (2001).
  35. Lukyanov, K. A., Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Verkhusha, V. V. Photoactivatable fluorescent proteins. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6 (11), 885-891 (2005).
  36. Bates, M., Huang, B., Dempsey, G. T., Zhuang, X. Multicolor super-resolution imaging with photo-switchable fluorescent probes. Science. 317 (5845), 1749-1753 (2007).
  37. Sherman, T. The abts and sulp families of anion transporters from Caenorhabditis elegans. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 289 (2), C341-C351 (2005).
  38. . Transgeneome website Available from: https://transgeneome.mpi-cbg.de/transgeneomics/index.html (2017)
  39. . National BioResource Project (NBRP)::C. elegans Available from: https://shigen.nig.ac.jp/c.elegans/ (2017)
  40. Heppert, J. K. Comparative assessment of fluorescent proteins for in vivo imaging in an animal model system. Mol. Biol. Cell. 27 (22), 3385-3394 (2016).
  41. Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
  42. . BLAST Available from: https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi (2017)
  43. Kamath, R. S., Martinezcampos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biol. 2 (1), RESEARCH0002 (2001).
  44. Kamath, R. S. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421 (6920), 231-237 (2003).
  45. Rual, J. F. Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library. Genome research. 14 (10B), 2162-2168 (2004).

転載および許可

このJoVE論文のテキスト又は図を再利用するための許可を申請します

許可を申請

さらに記事を探す

128 tubulogenesis

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

個人情報保護方針

利用規約

一般データ保護規則

お問い合わせ

図書館への推薦

JoVE ニュースレター

研究

教育

著者

図書館員

JoVEについて

Copyright © 2023 MyJoVE Corporation. All rights reserved