Il canale di Excretory c. elegans come un modello per intracellulare Lumen morfogenesi e biogenesi di membrana polarizzata In Vivo in una singola cella: etichettatura di GFP-fusioni, schermata di interazione di RNAi e Imaging

Riepilogo

Il canale escretore di c. elegans è un modello unico di singola cellula per l'analisi visiva in vivo della biogenesi della membrana de novo polarizzato. Questo protocollo descrive una combinazione di standard genetico/RNAi e approcci, adattabili per l'identificazione e la caratterizzazione di molecole dirigere tubulogenesis unicellulari e biogenesi lumen e membrana apicale di imaging.

Abstract

I quattro canali escretori c. elegans sono tubi stretti estese attraverso la lunghezza dell'animale da una singola cellula, con quasi altrettanto lontano estesa endotubes intracellulare che costruiscono e stabilizzare il lume con una membrana e submembraneous citoscheletro di carattere apicale. La cella escretore si espande la sua lunghezza circa 2.000 volte per generare questi canali, rendendo questo modello unico per la valutazione in vivo della biogenesi di membrana de novo polarizzato, morfogenesi lumen intracellulare e unicellulari tubulogenesis. Il protocollo presentato qui illustra come combinare standard di etichettatura, guadagno e perdita di-funzione genetica o interferenza del RNA (RNAi)-e approcci al microscopio per utilizzare questo modello per sezionare visivamente e funzionalmente analizzare questi processi a livello molecolare. Come esempio di un approccio d'etichettatura, il protocollo delinea la generazione di animali transgenici con proteine di fusione fluorescenti per analisi live di tubulogenesis. Come esempio di un approccio genetico, accentua i punti chiave di un visual schermo di interazione basato su RNAi progettato per modificare un fenotipo di guadagno di funzione canale cistico. I metodi specifici descritti sono come: etichetta e visualizzare i canali di esprimere proteine fluorescenti; costruire una libreria di RNAi mirata e strategize RNAi di screening per l'analisi molecolare della morfogenesi canal; valutare visivamente le modifiche di fenotipi di canale; Punteggio loro dissecando microscopia di fluorescenza; caratterizzare le componenti sottocellulari canal a risoluzione superiore mediante microscopia confocale; e quantificare i parametri visual. L'approccio è utile per l'investigatore che è interessato a sfruttare il canale escretore di c. elegans per identificare e caratterizzare geni coinvolti nei processi filogeneticamente conservati del lumen intracellulare e unicellulari morfogenesi del tubo.

Introduzione

Tutti gli organi interni sono composti da tubi, cruciale per loro molte funzioni diverse, come ad esempio il trasporto e scambio di gas, liquidi e sostanze nutritive e l'escrezione dei rifiuti metabolici. Loro carattere polarizzato, con membrane apicali e lumenal distinte, è adattato a queste specifiche funzioni, e difetti nella biogenesi dei loro sistemi endo - e della membrana plasmatica sono una causa frequente di malattia umana^1,2. La maggior parte dei tubi del sistema vascolare e degli organi interni è pluricellulare e forma un lume intercellularmente; Tuttavia, tubi unicellulari, che formano il lume intracellulare, possono, ad esempio, rappresentare tanto quanto 30 – 50% dei letti capillari umano². Le membrane polarizzate di multi - e tubi unicellulari sono simili nella composizione, anche loro microdomini possono differire in base alla funzione specifica del tubo (ad es., canaliculi canale escretore contro i microvilli intestinali in Caenorhabditis elegans; Vedi che accompagna il libro su c. elegans intestinale tubulogenesis)³. I principi della biogenesi della membrana polarizzata e tubulogenesis sono conservati tra i metazoi, e un simile macchinario molecolare li dirige^1,2,4.

Il sistema escretore di c. elegans è costituito da cinque celle: poro escretore delle cellule (CE), delle cellule del condotto (DC), cellulare (PC) e due cellule della ghiandola. Ablazione del CE, DC o PC provoca l'accumulo di liquidi nella cavità del corpo e animali muoiono un precoce stadio larvale di⁵. Curiosamente, questi tre tubi unicellulari creano loro lumi in tre modi diversi: dalla cella di vuotatura (CE); avvolgimento di cellulare accoppiato con formazione di giunzione di autocellular (PC); e avvolgendo cellulare accoppiato con autofusion (DC); diversi meccanismi della morfogenesi lumen che sono tutti filogeneticamente conservate^6,7. La CE, situata sul lato sinistro laterale del bulbo pharyngeal posteriore, manda due estensioni laterali da cui si diramano i quattro canali estendere anteriormente e posteriormente (su entrambi i lati destro e sinistro) per la punta del naso del verme e coda , rispettivamente (Figura 1)^5,6,8. La CE si estende da circa 1 µm a 2 x 1.000 µm, rendendo la cellula più grande nell'animale. A livello subcellulare, il canale escretore è un semplice tubo, generato da una membrana basale diretto verso il pseudocoelom e incanalato da una membrana di lumenal (endotube). La membrana di lumenal canal si connette alla membrana lumenal condotto alla sua giunzione solo intercellulare; i canali sono altrimenti junctionless lungo la loro lunghezza (Figura 1). La membrana di lumenal canale escretore e sua submembraneous citoscheletro sono apicali, definito dalla loro composizione molecolare che ricorda la composizione della membrana apicale e citoscheletro submembraneous di tubi pluricellulari, come l'intestino, e di altri epiteli (ad es., piatto). Organelli citoplasmici, tra cui endosomal vescicolare e altri (ad es., Golgi) livello delle endomembrane è distribuiti lungo la lunghezza del canale. Inoltre, più vescicole canalicular - collegato alla membrana lumenal, e/o interconnessi o isolato - sono filettate attraverso il canale citoplasma^7,8,9,10 . Questa connessione dinamica del plasma-membrana/canalicular ulteriormente espande il sistema a membrana del canale e contribuisce a entrambi di morfogenesi e osmoregolazione del lume¹⁰. Il canale escretore pertanto costituito quasi interamente endo - e membrane plasmatiche, fornendo un eccellente modello per l'analisi della biogenesi della membrana polarizzata e la regolazione della endo-all'interfaccia della membrana plasmatica. La drammatica espansione della membrana apicale durante la morfogenesi di canal - in questo sistema di cella singola coincida con estensione lumen – permette anche di analizzare i problemi architettonici derivanti dalla necessità di stabilizzare e centrare una membrana di lumenal intracellulare . Questo protocollo si concentra sull'analisi della morfogenesi strutturale di canale tubo e di lumen e le dinamiche di membrana intracellulare necessarie per questo processo, piuttosto che sui segnali che indirizzano i movimenti delle cellule che generano la posizione della CE nella sistema escretore e costruire i suoi intricati collegamenti ad altri elementi cellulari (rivisto in⁶).

Un ulteriore vantaggio del sistema di c. elegans unicellulare canal per l'analisi della membrana polarizzata e biogenesi lumen intracellulare è la sua capacità di separare, nel tempo inerente allo sviluppo, la generazione delle diverse componenti della sue membrane e giunzioni. La CE è nato al momento della chiusura ventrale e si deposita ventro-laterale della faringe durante metà embriogenesi^5,6,8, durante il quale si verificano tempo canale laterale estensione e ramificazione. Questo è seguito dall'estensione antero-posteriore canale durante l'embriogenesi tardiva, un processo che continua nella fase L1-larvale (Figura 1). In una larva appena schiusi, la punta posteriore del canale raggiunge circa la metà del worm, completamente estendere a coda alla fine della fase L1, dopo di che il canale si allunga con il verme⁸. Crescita attiva canale ad una velocità superiore a quella della crescita dell'animale così si conclude la prima fase larvale, tuttavia, ulteriore crescita avviene in parallelo con la crescita dell'intero animale durante gli stadi larvali aggiuntive (L2 – 4). Questa impostazione offre l'opportunità di analizzare diversi passaggi della biogenesi di membrana de novo polarizzata indipendente di divisione delle cellule polarizzata o migrazione. Inoltre, permette la separazione di questo processo dall'assemblaggio di raccordi (che si verificano nell'embrione prima dell'inizio di lumen); loro esigenza esatta nella polarizzazione di membrana è ancora una questione aperta nel campo di polarità. Infine, si separa in modo univoco apicale dall'espansione di membrana basale, il processo di quest'ultimo precede l'ex nei canali escretori¹⁰. Il modello di canale escretore elegans del c. è quindi un complemento particolarmente istruttivo al modello intestinale che condivide un certo numero di questi vantaggi per l'analisi della biogenesi della membrana polarizzata, ma viene eseguito in un ambiente multicellulare (Vedi il libro d'accompagnamento sul tubulogenesis intestinale³).

Anche se selvaggio-tipo canali sono tubuli ultrasottili in questo minuscolo verme, loro lumi possono essere visualized direttamente dall'ottica di Nomarski in questo animale trasparente. Infatti, morfologie mutante canale cistico possono essere caratterizzate in animali senza etichetta usando l'ingrandimento basso microscopia, che è stato utilizzato con grande efficacia in avanti schermi genetici per identificare i geni coinvolti nella tubulogenesis¹¹di dissezione. Visualizzazione migliore della morfologia dei canali e distinzione delle loro membrane polarizzate, componenti citoscheletriche, diversi organelli intracellulari e altre strutture subcellulari, tuttavia, richiede etichettatura e maggiore potenza fluorescenti microscopia confocale e dissezione. Anche se la struttura fine dei canali pone una serie di difficoltà per l'etichettatura e la microscopia, membrane e componenti sottocellulari possono essere distinto tramite le molecole specifiche univoche per ogni vano, e gli animali possono essere montati in modo sicuro per microscopia se alcune precauzioni per evitare di introdurre artefatti (Vedi protocollo e discussione). Etichettatura può essere fatto mediante immunoistochimica nei campioni fissati, o generando vermi transgenici che esprimono le proteine di fusione fluorescenti sotto il controllo dei loro propri o escretori canal specifici promotori per l'imaging in vivo . Questo protocollo descrive la seconda tecnica di etichettatura (Vedi il documento di accompagnamento il tubulogenesis intestinale per anticorpo che macchia³).

La capacità di combinare in vivo studi perdita o guadagno di funzione con in vivo imaging analisi a singola cella di livello in tutto lo sviluppo rende il canale escretore di c. elegans un modello particolarmente forte per il molecolare e analisi cellulare del tubulogenesis unicellulari. Marcia avanti o retromarcia schermi genetici possono essere eseguiti a partire con un animale transgenico wild-type o con etichettato per identificare il canale morfogenesi fenotipi (per esempio, cisti) e loro difetti del gene sottostante. In alternativa, tali schermi possono iniziare con un fenotipo mutante (ad esempio, un canale cistico) e identificare soppressori o esaltatori di questo fenotipo per identificare i geni che interagiscono funzionalmente con il gene che causa il fenotipo mutante. Il difetto genetico che causa il fenotipo mutante può indurre una perdita (ad es., tramite omissione del gene) o un aumento (ad es., tramite una mutazione d'attivazione o tramite l'introduzione di copie del gene in eccesso) della funzione oggetto dell'inchiesta. Trasmettere la mutagenesi o RNAi sistematica schermi senza preconcetti sulla funzione del gene e permettano l'identificazione imparziale di geni coinvolti nella funzione di interesse. Data la disponibilità di RNAi genoma librerie di alimentazione, quasi ogni gene può essere facilmente abbattuto da RNAi in c. elegans, tale che ogni singolo gene di interesse o qualsiasi gruppo di geni (ad es., nelle schermate mirati) anche può essere rapidamente sondato per il loro effetto in un approccio di genetica inversa. Per dimostrare una possibile combinazione di approcci, descriviamo qui una schermata di interazione RNAi mirata, a partire con un mutante di guadagno di funzione cistica canale escretore, etichettati con la proteina fluorescente citoplasmico canale verde (GFP). Il fenotipo mutante è stato generato da una sovraespressione di erm-1, un altamente conservata di c. elegans ortholog della famiglia del linker membrana-actina ezrina-radixina-moesina (ERM), che è stato implicato nella morfogenesi del lume e della membrana organizzazione in molte specie¹². C. elegans ERM-1 si localizza lumenal membrane degli organi interni, come ad esempio il canale escretore e intestino ed è necessario per la formazione di lumen in sia¹³. Sovraespressione di ERM-1 recluta actina in eccesso e vescicole alla membrana lumenal del canale, aumentando il flusso nel lumen e generando un breve canale cistico e una membrana di lumenal aggraffata con actina ispessita sottopelo⁹. Il protocollo descrive come generare ceppi transgenici con escretivo-canal-espresso etichettato proteine di fusione (o altre proteine); come eseguire mirati schermi RNAi a partire con tali ceppi, per identificare i modificatori di un fenotipo di canale; e come analizzare visivamente i risultati di tali schermi di dissezione e confocale microscopia a fluorescenza tra cui semplici modi per quantificare tubulogenesis informativo fenotipi. Alternativa i dettagli del RNAi, regolato per i geni di tubulogenesis spesso letale e tecniche di etichettatura si trovano nel libro d'accompagnamento sulla tubulogenesis intestinale³. Tutti i metodi possono essere utilizzati in varie combinazioni per l'indagine sulle altre domande sul canale tubulogenesis.

Protocollo

1. etichettatura del canale di Excretory di c. elegans di proteine di fusione fluorescenti ¹⁴

Nota: vedere il documento su tubulogenesis intestinale ³ per l'etichettatura di in situ dell'anticorpo che macchia le procedure adattabile al canale escretore. Vedere la tabella 1 per esempi di molecole dimostrati utile per la visualizzazione di c. elegans canale escretore endo - e membrane plasmatiche, tabella 2 per un esempio di espressione di guida al canale escretore, promotori e Tabella 3 per risorse per collezioni più complete di marcatori e promotori, inclusi riferimenti discutendo la selezione di diversi fluorofori.

1. Costruzione di tessuto specifico marcatore fluorescente plasmidi con enzima di restrizione basata clonazione ¹⁵
   Nota: vedere la discussione per tecniche alternative di costruzione proteine di fusione fluorescenti.
   1. Identificare la sequenza del promotore (per fusioni trascrizionali) o dell'intero gene di interesse con relativo promotore (per fusioni traslazionale) in WormBase ⁴⁴.
      Nota: per i promotori, circa 1 – 3 kilobasi (kb) sono sufficiente per la maggior parte dei geni di c. elegans. Proteine di fusione traslazionale possono essere costruiti anche inserendo un gene di interesse sotto un promotore specifico canale escretore (Vedi tabella 2).
   2. Design forward e reverse primer per l'amplificazione del promotore (per fusioni trascrizionali) e/o un gene completo con promotore (per fusioni traslazionale). Aggiungere il linker di enzima di restrizione al 5 ’ e 3 ’ le estremità dei primer.
      Nota: Scegliere gli enzimi di restrizione che sono presenti nel vettore plasmidico (ad esempio, pPD95.79) ¹⁶. Per le fusioni traslazionale, la 3 ’ linker deve essere progettato in modo che dopo digestione degli enzimi di restrizione e legatura con il vettore, il telaio dell'inserto codone sarà continuo con i codoni del fluoroforo, ad es., GFP. Uno potrebbe essere necessario aggiungere 1 o 2 basi più al tipico degli enzimi di limitazione linker ¹⁴; fare attenzione a non per creare un codone di stop.
   3. Eseguire polimerasi reazione a catena (PCR) per amplificare il promotore o full-length gene usando vermi vivi o selvaggio-tipo DNA genomico o cDNA come modello ¹⁵.
      Nota: Quando si utilizza vermi come modello, in primo luogo lisare vermi lysis buffer (buffer di PCR più proteinasi K) ¹⁷. Fase mista worm può essere utilizzato come modello. Vermi affamati possono essere utilizzati per evitare la contaminazione con DNA batterico.
   4. Eseguire agarosio (1%) elettroforesi su prodotti di PCR per identificare la dimensione corretta del prodotto amplificato.
      Nota: Se la taglia è corretta, procedere con il passo successivo. Se vengono generati più bande, migliorare le condizioni di amplificazione per produrre singola banda. Se questo non funziona, tagliare la banda corretta dal gel e purificare il DNA di metodi standard ¹⁵ e poi procedere con il passo successivo.
   5. Raccolta di limitazione di eseguire il prodotto PCR e il plasmide vettore che contiene il fluoroforo (ad esempio, pPD95.79) in provette separate dai metodi standard ¹⁵.
   6. Separare il DNAs digerito con elettroforesi su gel ed eluire il prodotto PCR e bande di DNA in provette separate di vettore.
   7. Purificare il DNAs da fette del gel con metodi standard ¹⁵. Misurare la concentrazione di DNA mediante lo spettrofotometro.
   8. Legare il prodotto PCR e del DNA di vettore con i metodi standard e trasformare il DNA ricombinante in cellule competenti di metodi standard ¹⁵.
   9. Diffondere 10 μL, 50 μL e 100 μL di cellule trasformate nei tre piatti brodo di Luria (LB) completati con ampicillina di 50 μg/mL.
      Nota: Si sono diffuse diverse quantità di cellule su diversi piatti per uno spettro delle efficienze di trasformazione. Per esempio, placcatura troppo densamente potrebbe non consentire l'isolamento di colonie se la trasformazione è efficiente.
   10. Incubare le piastre a 37 ° C durante la notte. Mattina successiva, estrarre le piastre dall'incubatrice.
       Nota: Se le colonie sono molto piccole, incubare per molte più ore.
   11. Preparazione del plasmide DNAs dalle singole colonie di metodi standard ¹⁵. Mescolare il DNA del modello e primer e inviare per il sequenziamento (in genere eseguita in un centro di assistenza di nucleo).
   12. Leggere le sequenze e verificare l'integrità del costrutto fusione.
       Nota: critico: confermare il telaio codone corretta tra il gene inserito e il gene marcatore fluorescente per fusioni di traduzione. Idealmente, sequenza del gene intero per confermare che nessuna mutazione è stata introdotta durante le procedure di legatura e di PCR.
   13. Generare altro DNA del plasmide (tramite passaggio 1.1.11) iniettabile per passaggio 1.2.
2. Generazione di animali transgenici di microiniezione di DNA per la trasformazione di germline ¹⁸
   Nota: vedere la discussione per tecniche alternative per l'introduzione di transgeni. Descritte le procedure possono essere utilizzate per generare animali transgenici che trasportano una proteina di fusione di fluorescenza o qualsiasi altra proteina di interesse. Per esempio, una proteina esogena può essere appena introdotto (ad es., un ortholog eterologa) o una proteina endogena può essere reintrodotto (ad es., nel suo corrispondente mutante di germline per il soccorso) o sovraespresso per generare un fenotipo (per esempio, iniezione di erm-1 è stato utilizzato per generare il fenotipo di sovraespressione canale cistico che funge da destinazione per modifica dallo schermo di interazione del RNAi descritto di seguito).
   1. Mix costrutto di DNA (1 – 50 ng/μL) con il plasmide marcatore del DNA (in genere 100 ng/μL), per esempio il marcatore dominante rol-6 (su1006) (Vedi 1.2.3 per opzioni di indicatore).
      Nota: critico: concentrazione di DNA iniettato deve essere determinata empiricamente per evitare l'introduzione di fenotipi artefactual (cisti, difetti di estensione, letalità) quando esprimono geni nei canali escretori che sono particolarmente sensibile all'espressione dei transgeni. Si possono, ad esempio, fare diverse miscele di plasmidi alle concentrazioni di 1 ng / µ l, 10 ng / µ l, 50 ng/μL e 100 ng/μL con 100 ng/μL rol-6(su1006) ad un intervallo di concentrazioni di prova per la generazione di un ceppo praticabile con la espressione desiderata o fenotipo (concentrazioni elevate rischiano di essere non specifico tossici per la morfogenesi del canale e può essere letale).
   2. Filtrare la miscela di DNA attraverso un filtro di 0,22 μm (micrometri) poro formato spin-x centrifuga tubo.
      Nota: Non lasciare il coperchio del tubo aperto per evitare la polvere che può bloccare gli aghi di microinjection.
   3. Microinject plasmidi ricombinanti nella gonade di vermi wild-type o mutanti con i metodi standard per la trasformazione di germline (Vedi riferimento ¹⁸ per particolari della procedura).
      Nota: Standard marcatore plasmidi sono, per esempio: rol-6(su1006), dpy-20, unc-119, pha-1. Transgeni dominante come rol-6(su1006) vengono introdotti in vermi wild-type, mentre salvataggio transgeni vengono introdotti nel loro rispettivi mutanti. Marcatore plasmidi sono co-iniettate per una facile manutenzione delle linee transgeniche poiché extracromosomico transgeni sono casualmente persi durante la divisione cellulare (Vedi 1.2.8). Durante l'iniezione di geni che codificano per le fusioni fluoroforo, si può anche utilizzare il fluoroforo, GFP, stesso come marcatore. ROL-6 induce vermi a rotolare intorno a se stessi che spesso è vantaggioso per la valutazione dei fenotipi di morfogenesi.
   4. Trasferimento iniettato worm su Escherichia coli seminato piastre Nematode crescita medio (NGM) (ad esempio, 5 vermi/piastra) (per standard c. elegans, vedere riferimento ¹⁹ procedure di cultura e di manutenzione e Tabella materiali).
   5. Incubare le piastre e lasciato progenie svilupparsi a 20 ° C per circa 3 d.
   6. Esaminare la progenie F1 sotto il microscopio per dissezione per Rol (rotolamento) worm (o qualsiasi altri iniezione specifici marker, per esempio, GFP) e scegliere rulli tpiatti individuali o.
   7. Piastre con rolling F2 animali di selezionare e confermare la presenza di fluorescenza sotto un microscopio a fluorescenza per dissezione (di solito tutti gli animali a rulli sono positivo di GFP).
      Nota: F2 rulli indicano la generazione di successo di una linea transgenica. Singole linee possono essere diversi, ad esempio, per quanto riguarda la velocità di trasmissione del transgene. È quindi utile mantenere e conservare numerose linee.
   8. Mantenere le linee transgeniche arricchendo di nuove piastre per marcatore-positivi animali.
      Nota: Il DNA iniettato è incorporato nella linea germinale come matrice extracromosomico. Velocità di trasmissione per le matrici extracromosomico sono variabile ma generalmente intorno ~ 50%. Per non perdere il ceppo, pertanto è fondamentale per arricchire manualmente linee con marcatori dominanti (ad esempio, linee non protetti da selezione negativa).
   9. Congelare linee transgeniche mediante tecniche di congelamento standard per l'archiviazione a lungo termine a-80 ° C ¹⁹.
      Nota: Transgeni sulle matrici extracromosomico possono essere integrato anche nella linea germinale di irradiazione UV in un ulteriore passaggio per resa omogenea linee ¹⁸. Ad esempio, erm-1 era integrato nella linea germinale di irradiazione UV per ottenere il ceppo di ERM-1 [+ +] fgIs2[erm-1p::erm-1;rol-6p::rol-6(su1006)] dove ogni animale trasporta il transgene, un requisito per il suo utilizzo in basati su RNAi schermata di interazione descritta di seguito. Questo ceppo è stato inoltre etichettato dal canale escretore citoplasmico GFP tramite incrocio in un ceppo contenente un vha - 1P:: transgene GFP (generato dalle stesse procedure indicate sopra; Vedi riferimento ²⁰ per basic genetica procedure quali croci) e viene definito come ERM-1 [+ +]; VHA - 1P:: ceppo GFP sotto.

2. Costruzione di una biblioteca di RNAi mirati e Design di uno schermo di interazione di RNAi per modificare un fenotipo Canal

Nota: uno schermo di interazione genetica basata su RNAi mirati è descritto che utilizza un fenotipo di canale cistico iperespressione di ricerca dei geni di morfogenesi canale escretore interagenti. Il ceppo di ERM-1 [+ +] (Vedi punto 1.2.9) serve come esempio ⁹. Questo approccio presenta solo uno dei molti possibili approcci per l'analisi genetica della morfogenesi lumen canale escretore (Vedi Introduzione e discussione per altri approcci genetici). Vedi il documento di accompagnamento il tubulogenesis intestinale ³ e riferimenti ^{17 , 21 , 22} per sfondo su RNAi, dettagli di RNAi procedure, modulazione della forza di RNAi (regolato per i geni di tubulogenesis spesso letale) e discussione di problemi tecnici connessi a RNAi. Vedere riferimento ¹⁹ per cultura di vite senza fine standard, manutenzione e tabella materiali.

1. Molecole interagenti Cerca ERM-1 (o un altro gene di interesse) in banche dati e articoli pubblicati.
   Nota: Potenziali interattori di ERM-1 dovrebbe includere tutte le molecole che sono stati sperimentalmente dimostrate funzionalmente, geneticamente o fisicamente interagire con proteine ERM in tutte le specie e/o stimate a farlo da qualsiasi in silico, throughput elevato o biologia dei sistemi approccio (vedere tabella 3 per esempi di banche dati e risorse).
2. Generare un elenco di tutti i geni e trovare c. elegans omologhi dove richiesto.
   Nota: Considerare espandendo l'elenco dei geni identificati per classi di gene, che prende in considerazione la funzione del gene di interesse e si allarga la rete per l'identificazione di interattori (ad es., per il linker di membrana-actina ERM-1, selezionare tutte le actine e molecole in relazione con l'actina).
3. Identificare il corrispondente RNAi batterica cloni in librerie di RNAi batteriche a genoma commercialmente disponibili per tutti i geni di alimentazione (ad es., Ahringer genomica di c. elegans RNAi alimentazione biblioteca ²¹; Tabella materiali)
4. Generare un foglio di calcolo per tutti i geni e loro corrispondenti RNAi targhetta e il numero di ben.
5. Pick e striscia ~ 50 RNAi cloni su piastre LB/ampicillina/tetraciclina (scelta dell'antibiotico è determinato dalla costruzione della libreria) al giorno e proseguire fino a mirati è generata RNAi libreria.
   Nota: A seconda della dimensione di biblioteca e proiettata del flusso di lavoro, omettere la generazione di una libreria completa e procedere direttamente con analisi dei lotti. Piastre possono essere memorizzati a 4 ° C, per non più di circa 2 settimane (se necessario, ri-striscia sulle nuove piastre dopo che). Al contrario, uno può generare grandi biblioteche congelati in replicati 96 pozzetti o 384 pozzetti formati per stoccaggio a lungo termine a -80 ° C.
6. Incubare le piastre a 37 ° C durante la notte. Mattina successiva, togliete le piastre dall'incubatore e negozio a 4 ° C.
7. Pick RNAi batteri da una piastra con uno stuzzicadenti sterile, mescolare i batteri con 600 μL LB/ampicillina (50 ng/μL) brodo nella microprovetta 1,5 mL, incubare le provette a 37 ° C, agitare bene per 6 h.
   Nota: Inoculare batteri RNAi nel brodo strofinando il pick (punta di uno stuzzicadenti o micropipetta) lungo il lato della provetta.
8. Seme 70 μL coltivate batteri in ogni pozzetto di RNAi a 6 pozzetti in set duplicate o triplicate. Incubare le piastre di RNAi a 22 ° C durante la notte.
   Nota: RNAi piastre vengono generati dalle procedure standard (Tabella materiali e riferimenti ^{3 , 17 , 21}) e qui utilizzati in un tessuto 6 pozzetti formato di piastra di coltura per un approccio di throughput superiore che permette ancora per la valutazione microscopica della morfogenesi canal animali vivi sulle piastre.
9. Avanti mattina, scegliere 3 L4 fase ERM-1 [+ +]; VHA - 1P:: GFP worms su ciascun pozzetto delle piastre RNAi.
   1. Per evitare la contaminazione con batteri OP50 (Vedi riferimento ¹⁹) che interferiscono con RNAi in primo luogo i vermi in un piatto NGM senza batteri di semi e lasciare gli animali a strisciare per circa 10 min. Utilizzare solo gli animali sani non morti di fame.
10. Incubare le piastre a 22 ° C per 3 d permettere agli animali di produrre progenie.
11. Examine fenotipi di canale nella progenie F1 sotto il microscopio di fluorescenza per dissezione.

3. In Vivo Imaging del c. elegans Excretory canale di microscopia di fluorescenza di dissezione e segnando di fenotipi di Tubulogenesis

1. preparare un foglio di Punteggio di fenotipo (esempio riportato nella tabella 4 e Figura 5 ).
2. Mettere la piastra di agar con vermi direttamente sotto il dissectin di fluorescenzamicroscopio di g, aprire il coperchio della piastra per la valutazione, utilizzare ingrandimento inferiore a fuoco.
   Nota: Questo protocollo viene descritto l'utilizzo di un ambito con 1.5 X e 10 X obiettivi e una gamma di zoom da 3,5 a 45 (Tabella materiali).
3. Valutare gli animali di messa a fuoco su ogni bene separatamente, partendo da ben 1 e verso il basso la piastra.
   Nota: Iniziare sempre con la valutazione dei controlli. Per esempio, un mock (vettore vuoto) controllo (RNAi HT115 batteri (vedi riferimenti ^{17 , 21}) senza o con un inserto di gene correlato) negativo e positivo del caso controlla, ad esempio, in Questo schermo di interazione, erm-1 RNAi (sopprime il fenotipo di ERM-1 [+ +]) e sma-1 / spectrin RNAi (migliora il fenotipo di canal ERM-1 [+ +]).
4. In primo luogo, esaminare generali fenotipi visibili sotto una luce intensa (per esempio: Let/letale, Clr/clear, Emb/embrionali letali, Ste/sterile, Unc/scoordinata, Dpy/losca, ecc.), quantificare il fenotipo contando il numero totale di animali e numero degli animali con il fenotipo, registrare i numeri (Vedi tabella 4).
   Nota: Per atterramenti di geni che causano i difetti che possono influire sulla valutazione dei fenotipi di canale (ad es., Emb, Ste), prendere in considerazione ripetendo l'esperimento con la condizionale, post embrionali RNAi (Vedi che accompagna il libro per procedure ³ ).
5. In secondo luogo, esaminare fenotipi di canale escretore sotto una luce fluorescente, segnare quantificabili fenotipi (ad es., la lunghezza del canale, larghezza del lume, cisti), registrare i numeri e descrivere fenotipi su un foglio di Punteggio (Vedi tabella 4, < forte classe = "xfig" > figura 5).
   Nota: Per valutare altri fenotipi sottile canale è necessaria maggiore ingrandimento con gamma di zoom. Spostare avanti e indietro tra basso e alto ingrandimento a valutare con attenzione il canale ’ s lunghezza e larghezza e qualsiasi altro fenotipo di morfogenesi di canal. Per quantificazione o semi-quantificazione dei fenotipi semplici, contare 100 animali (ad es., L4s in questa schermata di RNAi mirata; fenotipi: canal lunghezza di 1/4, 1/2, 3/4 e piena estensione dei canali posteriori e diametro del lume dei canali posteriori, piccolo le cisti (< 1/3 della larghezza degli animali), cisti di grandi dimensioni (> 1/3 della larghezza degli animali); Vedi tabella 4).
6. Acquisire immagini dei fenotipi predominanti da almeno 3 animali diversi da un microscopio montato fotocamera digitale charge coupled device (CCD) e software di imaging corrispondente (Vedi Tabella materiali)
   1. per acquisire immagini, prima attivare la fotocamera, accendere il computer collegato, fare doppio clic sull'icona del software di acquisizione immagine, un'area della piastra verme manualmente sotto ingrandimento basso a fuoco e aprire l'otturatore della fotocamera.
   2. Fare clic sul “ anteprima dal vivo ” icona del software di acquisizione di immagini sullo schermo del computer per visualizzare i vermi sullo schermo del computer, regolare il fuoco manualmente a chiaramente visualizzare i vermi sullo schermo, quindi fare clic sul “ a scatto ” icona, quindi fare clic sul “ Salva ” icona.
      Nota: Pertanto gli animali si muovono più velocemente sotto la luce fluorescente, mantenere una mano sul mouse del calcolatore pronto mentre spostando la piastra nell'area di interesse con l'altra mano. Quindi prontamente la “ a scatto ” icona per acquisire l'immagine. È solitamente possibile acquisire una buona immagine con diversi tentativi.
   3. Salvare le immagini acquisite con un nome di file corretto (includere il nome della razza, nome di clone di RNAi e data).
      Nota: Vermi di selvaggio-tipo mobile più veloce con i canali sottili e lunghe sono più difficili da immagine di mutanti. Mutanti con canali cistici e/o altri fenotipi rischiano di muoversi lentamente, facilitando così la formazione immagine. Plasmidi marcatore come Rol possono essere utile per l'imaging di tenere gli animali “ in loco ” piuttosto che lo spostamento in avanti e può anche fornire una migliore visione sul fenotipo con l'animale rotolamento intorno se.

4. Imaging del c. elegans Excretory canale ad alta risoluzione di microscopia confocale a scansione Laser

1. montaggio animali vivi
   1. collocare una piccola quantità di grasso o vaselina sulla punta di un bastoncino di cotone o sulla punta della dito indice e spalmare il grasso per generare un cerchio ultrasottile con un diametro di ~ 6 – 8 mm al centro di un vetrino pulito.
   2. Posto 6 μL 5% soluzione di lidocaina (anestetico) nel cerchio di una micropipetta.
      Nota: Una soluzione di riserva di lidocaina può essere fatta sciogliendo polvere di lidocaina in acqua. Diluire al 5% con M9 buffer ¹⁹ (Tabella materiali). È fondamentale per l'analisi del canale escretore per evitare le soluzioni di immobilizzazione comuni (ad esempio sodio azide) che causano le cisti alla rottura e che inducono canal fenotipi.
   3. Scegliere diversi animali da una piastra di RNAi e metterli nella soluzione di lidocaina da immergere il worm pick ¹⁹ nella soluzione.
      Nota: Scegliere preferibilmente animali di fase-specifici che faciliteranno il montaggio anche di spessore uniforme. Gli animali possono essere preselezionati il microscopio di fluorescenza per dissezione.
   4. Porre un coprivetrino 22 x 22 mm sulla lastra di vetro; lasciarlo materassi delicatamente il cerchio grasso.
      Nota: Non applicare alcuna pressione fisica il coprivetrino che potrebbe danneggiare la morfologia del canale, soprattutto in mutanti o vermi di RNAi trattati con canal e possibilmente altri fenotipi. È importante quindi per evitare un cerchio di grasso denso; idealmente gli animali sono delicatamente inseriti tra il vetrino e il coprioggetto.
   5. Scrivere il nome del campione sul lato glassato di vetrino. Portare immediatamente il vetrino al microscopio confocale per l'analisi del fenotipo di canale e di acquisire immagini.
      Nota: Ritardi possono provocare il danneggiamento delle cisti canal o cambiare nella morfologia lumen canal.
2. L'acquisizione immagini confocal
   1. porre il vetrino sul palco campione del microscopio confocale, concentrarsi i vermi a basso ingrandimento (X 10).
   2. Vista e selezionare animali sotto 60 X e/o 100 X obiettivi, esaminare il canale escretore ’ cellulare s e fenotipi subcellulari, ad es., lume forma e diametro, dimensione e forma delle cisti; o i componenti subcellulari etichettati per analisi, ad esempio, membrana basale, endosomal contro canalicular vescicole, citoplasma, membrana apicale/lumenal, altri organelli (Vedi discussione, Figura 2 e Figura 4).
   3. Acquisire immagini del fenotipo specifico di interesse.
      Nota: Questo protocollo descrive l'uso di un microscopio confocale (Tabella materiali) di scansione laser. Per risolvere il componenti sottocellulari nella sottile c. elegans canali escretori, gli obiettivi a maggiore ingrandimento (60 X 100 X) sono necessari. Un microscopio confocale disco rotante può essere utilizzato per acquisire immagini di lasso di tempo, ma fornisce meno confocality (Vedi discussione).
      1. Per acquisire immagini confocal, accendere il computer, fare doppio clic sul software microscopio confocale e seleziona il laser facendo clic su un'icona di laser specifico.
      2. Clic la “ scansione ” icona per visualizzare il worm focalizzato sullo schermo del computer, regolare intensità del laser attraverso la software e fare di nuovo clic su “ scan ” icona per interrompere la scansione, quindi fare clic su “ catturare ” icona per acquisire un'immagine, quindi fare clic su “ salvare ” icona.
      3. Salvare le immagini con nome di file corretto e includere nome di clone di RNAi, ceppo nome e data.
         Nota: Le immagini possono essere acquisite come singolo e più sezioni (ad esempio, 10 – 15 sezioni lungo l'asse z). Sezionamento consente la visualizzazione 3D. Acquisire immagini di proiezione e salvare separatamente se necessario (a seconda del microscopio). Per risoluzione ottimale, utilizzare impostazioni di laser con basso guadagno, non aprire pinhole troppo e aggiungere una media diversi per ogni immagine (vedi riferimenti ^{23 ,}, ²⁴ per la discussione generale dell'imaging confocale). Prendersi cura di acquisire immagini a una luminosità sotto il livello di saturazione per consentire modifiche di software di imaging, se richiesto (preferibilmente immagini di uso non modificato).
      4. Acquisire immagini della doppio - o moltiplicare i canali etichettati (ad esempio verde, rosso e blu) allo stesso modo, facendo clic sulle icone laser multipli, ma utilizzare la scansione sequenziale per evitare trapasso tra i canali (fondamentale per gli studi di co-localizzazione).
         Nota: Uno potrebbe essere necessario prendere in considerazione il tempo necessario per la scansione sequenziale (che anche risultati in un corrispondente aumento nella foto lo sbiancamento) e modificare le impostazioni dello scanner. Non eseguire la scansione animali da una diapositiva per più di 30 minuti massimo per evitare effetti aspecifici sulla morfologia del canale. Montare la nuova diapositiva se più lungo di scansione è necessaria.
      5. Acquisire corrispondente ottica differenziale di interferenza (DIC) / immagini di Nomarski, particolarmente se quantificare canal diametro lunghezza e lume in relazione il worm ’ s corpo lunghezza e diametro. Sovrapposizione di fluorescenza e Nomarski immagini cliccando su “ sovrapposizione ” icona per illustrare i punti di riferimento ( Figura 1 e Figura 4A – D).
   4. Per la quantificazione, misurare l'intensità di fluorescenza di un componente con etichettato di interesse di ImageJ software ²⁵ ( Figura 5).

Risultati

Questo protocollo viene descritto come utilizzare i canali escretori di c. elegans analizzare visivamente e molecolarmente tubulogenesis unicellulari e morfogenesi intracellulare lume in una singola cella. Durante la loro estensione dal momento dell'embriogenesi metà fino all'età adulta, i quattro canali escretori continuano a espandere la loro basolaterale e membrane apicali/lumenal insieme al loro sistema di endomembrane canalicular ed endosomal, fornendo un modello unico per...

Discussione

Versatilità genetica c. elegans , trasparenza, piano corpo semplice e stirpe delle cellule invarianti tutti ne fanno un eccellente modello per l'analisi della morfogenesi. Questo protocollo viene descritto come combinare standard manipolazioni genetiche e imaging studi per poter sfruttare il 2 micron sottile c. elegans canali escretori per studiare membrana polarizzata e biogenesi intracellulare lumen in un tubo di singola cellula.

Etichettatura
I canali ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cloning
Plasmid pPD95.75	Addgene	Cat. No. 37464
PCR Kit	Qiagen	Cat. No. 27106
Ligation kit	New England Biolabs	Cat. No. E2611L
DNA marker	Thermo Scientific	Cat. No. SM1331
Agarose DNA grade	Fisher Scientific	Cat. No. BP164-100
Competent cells	New England Biolabs	Cat. No. C2987H
Tris	Fisher Scientific	Cat. No. BP154-1
EDTA	Sigma	Cat. No. ED-1KG
Acetic acid	Fisher Scientific	Cat. No. A38S-500
Ethidium bromide	Fisher Scientific	Cat. No. BP1302-10
Equipments
PCR machine	MJ Research	Cat. No. PTG-200
Centrifuge	Eppendorf	Cat. No. 5415C
Water Bath	Precision Scientific	Cat. No. 666A3
Gel running instrument	Fisher Scientific	Cat. No. 09-528-165
Gel running power supply	Fisher Scientific	Cat. No. 45-000-465
Molecular Imager Gel Doc XR System	Bio-Rad	Cat. No. 1708195EDU
Nanodrop Spectrophotometer	Thermo Scientific	Cat. No. ND1000
C. elegans related1			1see reference27 for standard C. elegans culture and maintenance procedures.
LB Medium and plates2			2see reference24 for protocols.
Tryptone	Acros Organics	Cat. no. 611845000
Yeast Extract	BD Biosciences	Cat. no. 212750
NaCl	Sigma	Cat. no. S7653
Bacto Agar	BD Biosciences	Cat. no. 214040
Ampicillin	Sigma	Cat. no. A0116
Tetracycline	Fisher Scientific	Cat. no. BP912
M9 Medium2					2see reference24 for protocols.
NaCl	Sigma	Cat. no. S7653
KH2PO4	Sigma	Cat. no. P0662
Na2HPO4	Sigma	Cat. no. S7907
MgSO4	Sigma	Cat. no. M2773
NGM plates 2			2see reference24 for protocols.
NaCl	Sigma	Cat. no. S7653
Peptone	BD Biosciences	Cat. no. 211677
Tryptone	Acros Organics	Cat. no. 611845000
Bacto Agar	BD Biosciences	Cat. no. 214040
MgSO4	Sigma	Cat. no. M2773
CaCl2	Sigma	Cat. no. C3881
Cholesterol	Sigma	Cat. no. C8667
K2HPO4	Sigma	Cat. no. P3786
KH2PO4	Sigma	Cat. no. P0662
RNAi plates3			3see reference60 for protocols.
NaCl	Sigma	Cat. no. S7653
Peptone	BD Biosciences	Cat. no. 211677
Tryptone	Acros Organics	Cat. no. 611845000
Bacto Agar	BD Biosciences	Cat. no. 214040
MgSO4	Sigma	Cat. no. M2773
CaCl2	Sigma	Cat. no. C3881
Cholesterol	Sigma	Cat. no. C8667
K2HPO4	Sigma	Cat. no. P3786
KH2PO4	Sigma	Cat. no. P0662
IPTG	US Biological	Cat. no. I8500
Carbenicillin	Fisher Scientific	Cat. no. BP2648
NaOH	Fisher Scientific	Cat. no. SS266-1
Sodium hypochlorite	Fisher Scientific	Cat. no. 50371500
Bacteria
OP50 bacteria	CGC
HT115 bacteria	CGC
Genome-wide RNAi libraries
Ahringer genome-wide RNAi feeding library (ref29,49)	Source BioScience
C. elegans ORF-RNAi feeding library (ref50)	Source BioScience
Imaging related
Lidocaine	MP Biomedicals,LLG	Cat. no. 193917
Materials
Vacuum Grease Silicone	Beckman	Cat. no. 335148
Microscope slides	Fisher Scientific	Cat. no. 4448
Microscope coverslips (22×22-1）	Fisher Scientific	Cat. no. 12-542-B
Tissue culture plate, 6 well	Corning Inc.	Cat. no. 08-772-33
Equipment
SMZ-U dissecting microscope (Nikon)
SZX12 dissecting microscope (Olympus), equipped with a high-power stereo fluorescence attachment (Kramer Scientific), CCD camera with Q capture software and X-Cite fluorescent lamp (Photonic Solutions).
TCS SL Laser-scanning confocal microscope (Leica Microsystem)
C2 laser-scanning confocal mounted on an ECLIPSE Ti-E inverted microscope (Nikon)