线粒体 Ca2 +保留容量检测和 Ca2 +触发的线粒体肿胀试验

摘要

本协议的目的是描述一种检查 ca^{2 +}保留容量和 ca^{2 +}触发的 SH-SY5Y 细胞线粒体肿胀的方法逐步。

摘要

氧化磷酸化生产 ATP 是线粒体的主要功能。高真核生物中的线粒体也参与胞浆 Ca^{2 +}缓冲, 线粒体中的 ATP 生产可以通过 intramitochondrial 自由 Ca^{2 +}浓度进行介导。Ca^{2 +}保留容量可以被视为线粒体在线粒体基质中保留钙的能力。累积胞内 Ca^{2 +}导致内线粒体膜通透性, 称为线粒体通透性过渡孔 (mPTP) 的开口, 导致分子量小于 1.5 kDa 的分子泄漏。Ca^{2 +}触发的线粒体肿胀用于指示 mPTP 开口。在这里, 我们描述了两种检测, 以检查 ca^{2 +}保留容量和 ca^{2 +}触发线粒体肿胀在孤立的线粒体。添加了一定数量的 Ca^{2 +}后, 所有步骤都可以在一天内完成, 并由微板块读取器记录。因此, 这两种简单而有效的检测方法可以用来评估与 Ca^{2 +}相关的线粒体功能。

引言

线粒体是主要的细胞器官, 以产生近95% 的 ATP 在哺乳动物细胞中使用氧化磷酸化。据报道, 通过线粒体、adp 和无机磷酸盐的存在, micromolar 的 Ca^{2 +}的螯合浓度可以用来 phosphorylate adp 合成 ATP¹。当胞浆 Ca^{2 +}的浓度超过阈值时, 线粒体可以快速吸收 Ca^{2 +}并缓慢地将其流出。因此, 功能线粒体可以流入增加胞浆 Ca^{2 +}。与参与氧化磷酸化无关, 线粒体 Ca^{2 +}也参与胞浆钙信号和激活线粒体凋亡机制, 诱导开放的 mPTP 在内线粒体膜²。人们普遍认识到, 胞内 Ca 的异常海拔^{2 +}可以通过打开 mPTP³来诱发线粒体大面积肿胀。因此, 本协议旨在通过量化线粒体 Ca^{2 +}保留容量和 Ca^{2 +}-触发线粒体肿胀来评估线粒体功能。

Ca^{2 +}保留容量是衡量线粒体吸收胞浆钙的能力。线粒体可以缓冲胞浆游离钙和调节钙依赖的细胞过程中的钙吸收形式的非活性沉淀。受损的 Ca^{2 +}保留容量发生在与能源限制有关的压力现象中, 甚至神经退行性疾病^4,5。分离的线粒体或 digitonin-透细胞可用于识别 Ca^{2 +}保留容量, 并且由具有额外谷氨酸和苹果酸的孤立线粒体积累 Ca^{2 +}的提升能力不受线粒体隔离过程⁶。滴定量的 digitonin 应用于 permeabilize 不同细胞类型的血浆膜。ca 的 hexapotassium 盐^{2 +}-结合绿色荧光染料, 一个 Ca^{2 +}敏感细胞-impermeant 可见光兴奋指示器, 已被广泛使用的⁷。Ca^{2 +}-结合绿色荧光染料是一种低亲和力指示器, 用于表明胞内游离 Ca^{2 +}浓度在长时间 (5 分钟) 刺激⁸中继续上升。该方法比放射性过滤技术灵敏度低, 但大大简化。额外的 Ca^{2 +}提升了钙绿色荧光, 线粒体的 Ca^{2 +}吸收将荧光返回到基线。连续添加了 ca^{2 +} , 直到线粒体未能摄取 extramitochondrial Ca^{2 + 9}。荧光微板块读取器可用于连续报告钙绿色荧光。

在 ca^{2 +}累积之后, 线粒体偏振光, 将 Ca^{2 +}释放到介质中, 并开始膨胀。Ca^{2 +}触发的线粒体肿胀用于指示 mPTP 开口。电子显微镜和光吸收率降低 540 nm 可用于测量 Ca^{2 +}触发的线粒体肿胀^10,11。线粒体体积可以直接确定的前角光散射¹², 其中吸收减少反映线粒体基质的被动肿胀。

在这里, 我们说明了检查线粒体 Ca^{2 +}保留容量和 Ca^{2 +}触发线粒体肿胀从 SH-SY5Y 细胞分离的线粒体的方法。

研究方案

1. 线粒体的分离

注: 所有解决方案和设备应预换热器 0-4 摄氏度, 并保持在冰上。

1. 种子约 3 x 10⁶ SH-SY5Y 细胞每10厘米细胞培养皿。高糖 Dulbecco 修饰鹰培养基中培养细胞, 10% 胎牛血清, 青霉素 (100 U/毫升)-链霉素 (100 µg/毫升)。在包含 5% CO₂的孵化器中保持37摄氏度。
   注意: 每个隔离检测都需要至少 1-2 x 10⁷ SH-SY5Y 单元格。
2. 取出培养基, 在10厘米细胞培养皿中用大约1毫升的冰冷 PBS 冲洗细胞3次。
3. 在10厘米细胞培养皿中加入新的1毫升冰冷 PBS, 将黏附细胞刮成新的1.5 毫升管。离心机在 800 x g 10 分钟在4摄氏度。
4. 在离心过程中, 准备5毫升线粒体隔离缓冲 (250 毫米蔗糖, 10 毫米 HEPES (4-(2-羟乙基)-1-哌嗪磺酸), 10 毫米氯化钾, 1.5 毫米氯化镁₂, 1 毫米 EDTA) 补充 50 ul 蛋白酶抑制剂库存溶液 (100x 浓度; 1 无 EDTA 片剂溶于500µL 的 ddH₂O)。
5. 取出上清液, 并用重悬1毫升线粒体隔离缓冲颗粒。在冰上孵化1.5 毫升管30分钟。
6. 溶解在冰上手动向上和向下的玻璃均质机 (15-25 冲程) 悬浮细胞。
   注意: 确保细胞均匀时没有气泡。用显微镜观察完整的细胞和裸露的细胞核, 并确认 > 90% 细胞破损发生。
7. 将匀浆转化为1.5 毫升管, 离心机在 1000 x g 处, 5 分钟到4摄氏度, 去除碎片 (细胞核和剩余完好的细胞)。
8. 将上清液转移到新的1.5 毫升管和离心机在 1000 x g 5 分钟4°c。
9. 将上清液转移到新管和离心机在 1.4万 x g 15 分钟4°c。
10. 并用重悬1毫升线粒体隔离缓冲液去除含有线粒体的颗粒。
11. 离心溶液为15分钟在 1.4万 x g 4 °c 沉淀线粒体。
12. 所产生的线粒体颗粒必须保持在冰和悬浮 50-100 ul 氯化钾介质 (125 毫米氯化钾, 2 毫米 K₂HPO₄, 1 毫米氯化镁₂, 20 毫米 HEPES, 5 毫米谷氨酸, 5 毫米苹果酸, 2 微米鱼藤酮, pH 7.4) 根据颗粒体积前任何驴哎。
13. 使用5的线粒体溶液 ul 测定线粒体蛋白浓度通过标准的评估测试, 测量 OD562 使用一个板读取器¹³。

2. 线粒体 Ca^{2 +}保留容量的测定

1. 准备氯化钾介质, 并在实验前将 Ca^{2 +}结合绿色荧光染料添加到最终浓度为0.5 微米。
2. 在含0.5 微米 Ca^{2 +}的氯化钾介质中转移1毫升的分离线粒体 (0.4 毫克/毫升), 将绿色荧光染料结合到每个6井板中。
3. 孵化线粒体和 Ca^{2 +}-结合绿色荧光染料在6井板室温保护, 从环境光1分钟. 添加 4 ul 整除数20毫米 CaCl 2 解决方案 (20 毫米 CaCl 2, 127 毫米氯化钾, 1 毫米氯化镁 2 , 20 毫米 HEPES, 5 毫米谷氨酸, 5 毫米苹果酸, pH 7.4) 到每个6井板井使用自动分配设置引入 200 nmol Ca^{2 +}/镁线粒体蛋白。
4. 使用荧光光谱仪监测每3秒的荧光变化为2分钟, 激发波长为 506 nm, 发射波长为 531 nm。在软件控制的读数 (图 1) 之间, 板上的震动为 600 rpm 3 秒。
5. 添加一个额外的 4 ul 整除20毫米 CaCl₂解决方案, 每个井和监测荧光变化每3秒为2分钟. 重复此步骤, 直到荧光随时间增加。
   注意: 通过增加的记录荧光指示的添加的 Ca^{2 +} , 线粒体面临挑战。当 mPTP 打开时, 荧光随时间增加。
6. 解释添加的 ca^{2 +}的总金额, 直到 mPTP 作为 Ca^{2 +}保留容量打开为止。

3. 钙^{2 +}诱导的线粒体肿胀的测定

1. 在实验前准备氯化钾介质。
   1. 将氯化钾介质中1毫升的分离线粒体 (0.4 毫克/毫升) 转移到每个6井板中。
2. 添加 10 ul 20 毫米 CaCl₂水溶液 (500 nmol/镁线粒体蛋白) 成线粒体蛋白, 引发线粒体肿胀。
3. 记录由软件控制的微板块读取器上每3秒 540 nm 的吸光度降低10分钟 (图2)。荧光的变化是由溶质流入线粒体内膜引起的。
   注: 540 nm 的吸收量减少, 相当于肿胀的线粒体。如果阅读器没有观察到吸收的减少, 可以采用更长的阅读间隔或阅读时间。

结果

Ca^{2 +}保留容量的代表性结果:
结果以荧光值表示。随着 Ca^{2 +} (200 nmols/毫克线粒体蛋白) 的额外脉冲, 荧光量在基线上增加了两个 mPTP 开口。5微米 Bongkrekate (BKA), 一抑制剂的 ca^{2 +}诱导 mPTP 开放, 或1微米苍术苷二 (ATR), 一个激活剂的^ca2 + 诱导 mPTP 开放, 增加了孤立的线粒体。添加的 ca^{2 +}的总量, 直到在基线荧光以上的双增量指示的 ...

讨论

在这里, 我们描述了一个简单有效的线粒体 Ca^{2 +}保留容量检测和 Ca^{2 +}触发的线粒体肿胀试验的协议。

对于线粒体的隔离, 要确保所有的材料和管子都在冰上, 特别是当细胞均匀化时。0.25% 胰蛋白酶-EDTA 也可用于分离皿中的细胞5分钟, 在37摄氏度。15-25 冲程后, 必须观察显微镜下的完整细胞膜, 避免线粒体膜的断裂。然而, 我们获得的分离的线粒体是粗线粒体和纯?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
SH-SY5Y cell line	ATCC (The Global Bioresource Center)	ATCC Number: CRL-2266
Calcium green-5N	Life Technologies	c-3737	Ca2+-binding green fluorescent dye
complete protease inhibitors	Roche Molecular Biochemicals	4693116001
glass homogenizer	Kimble Chase	9885303002
glutamate	Sigma-Aldrich	RES5063G-A7
malate	Sigma-Aldrich	46940-U
rotenone	Sigma-Aldrich	R8875
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
MgCl2	Sigma-Aldrich	00457
K2HPO4	Sigma-Aldrich	V900050
KCl	Sigma-Aldrich	P9541
CaCl2	Sigma-Aldrich	V900266
Varioskan flash instruments	Thermo Scientific	IC100E
Bongkrekate	Biovision	1820-100
atractyloside	Sigma-Aldrich	C4992
high-glucose Dulbecco’s modified Eagle medium	Hyclone	SH30022	4.5 g/L glucose, L-glutamine, without sodium pyruvate
fetal bovine serum	Hyclone	SV30087
penicillin	Sigma-Aldrich	P3032
streptomycin	Invitrogen	11860-038
BCA assay kit	Thermo Scientific	NCI3225CH
PBS	Hyclone	SH30256.01
10 cm cell culture dish	NEST	704001