Mitochondriale Ca2 + Retention Kapazität Assay und Ca2 +-mitochondriale Schwellung Assay ausgelöst

Zusammenfassung

Dieses Protokoll zielt darauf ab, beschreiben eine Methode zur Prüfung der Ca^{2 +} Rückhaltevermögen und Ca^{2 +}- ausgelöst mitochondriale Schwellung des isolierten Mitochondrien von SH-SY5Y Zellen Schritt für Schritt.

Zusammenfassung

Die Produktion von ATP durch Oxidative Phosphorylierung ist die primäre Funktion der Mitochondrien. Mitochondrien in den höheren Eukaryotes auch an cytosolischen Ca^{2 +} Pufferung und die ATP-Produktion in Mitochondrien kann durch intramitochondrial frei Ca^{2 +} Konzentration vermittelt werden. Ca^{2 +} Rückhaltevermögen kann als die Fähigkeit der Mitochondrien, Kalzium in der mitochondrialen Matrix zu behalten. Kumulierte intrazellulären Ca^{2 +} führt zu der Durchlässigkeit der inneren mitochondrialen Membran bezeichnet die Öffnung des mitochondrialen Permeabilität Übergang Pore (mPTP), was dazu führt, das Austreten von Molekülen mit einer molekularen Gewicht weniger als 1,5 kDa. Ca^{2 +}-Mitochondrien Schwellung verwendet wird, um die mPTP Öffnung zeigen ausgelöst. Hier beschreiben wir zwei Tests untersuchen die Ca^{2 +} Rückhaltevermögen und Ca^{2 +}-mitochondriale Schwellung in isolierten Mitochondrien ausgelöst. Nach bestimmten Mengen von Ca^{2 +} werden hinzugefügt, können alle Schritte innerhalb eines Tages abgeschlossen und von einer Mikrotestplatte Leser aufgenommen. Somit können diese zwei einfachen und effektiven Assays ergriffen werden, um die Ca^{2 +}bewerten-mitochondriale Funktionen.

Einleitung

Mitochondrien sind die zellulären Hauptorgane, fast 95 % der verwendeten in den Säugetier-Zellen durch Oxidative Phosphorylierung ATP zu produzieren. Es wird berichtet, dass die abgesonderten mikromolaren Konzentration von Ca^{2 +} von Mitochondrien, die Anwesenheit von ADP und anorganischem Phosphat ADP zu ATP-Synthese¹phosphorylieren verwendet werden können. Wenn die Konzentration der cytosolischen Ca^{2 +} einen Schwellenwert überschreitet, Mitochondrien können Aufnahme Ca^{2 +} schnell und Ausfluss es langsam. So können die funktionierenden Mitochondrien Zustrom der erhöhten cytosolischen Ca^{2 +}. Irrelevant für die Teilnahme an der Oxidative Phosphorylierung, die mitochondriale Ca^{2 +} auch an der cytosolischen kalziumsignale teilnehmen und aktivieren den mitochondrialen Apoptose-Mechanismus durch Induktion die Eröffnung der mPTP in der inneren mitochondrialen Membran-². Es wurde allgemein anerkannt, dass abnorme Erhöhung der intrazellulären Ca^{2 +} mitochondriale massive Schwellung hervorrufen kann, durch die Eröffnung der mPTP-³. So, dieses Protokoll zielt darauf ab, die Funktion der Mitochondrien zu bewerten, indem Sie die Quantifizierung der mitochondrialen Ca^{2 +} Rückhaltevermögen und Ca^{2 +}-trigged mitochondriale Schwellung.

Ca^{2 +} Rückhaltevermögen ist das Maß für die Fähigkeit der Mitochondrien zur Aufnahme zytosolischen Kalzium. Mitochondrien können Puffer freie zytosolischen Kalzium und Kalzium-abhängigen zellulären Prozesse zu regulieren, indem Calciumaufnahme in Form von inaktiven Ausscheidungen. Beeinträchtigt Ca^{2 +} Rückhaltevermögen tritt in Stress-Erscheinungen, die mit Energie-Begrenzung und auch Neurodegenerative Krankheiten^4,5. Isolierte Mitochondrien oder Digitonin-permeabilized Zellen eingesetzt werden, um die Ca^{2 +} Rückhaltevermögen zu identifizieren, und die erhöhte Fähigkeit zu akkumulieren Ca^{2 +} durch isolierte Mitochondrien mit dem Additonal Glutamat und Malat erfolgt nicht durch die Mitochondriale Isolierung Verfahren⁶. Eine betitelten Menge an Digitonin sollte verwendet werden, um die Plasmamembranen von verschiedenen Zelltypen permeabilize. Das Hexapotassium Salz der Ca^{2 +}-Bindung grünen fluoreszierenden Farbstoff, Ca^{2 +}-sensible Zelle-impermeant Licht-erregbare Sichtanzeige, wurde weit verbreiteten⁷. Ca^{2 +}-Bindung grün fluoreszierenden Farbstoff ist ein Low-Affinität-Indikator und verwendet, um anzuzeigen, dass intrazelluläre freie Ca^{2 +} Konzentrationen im steigen weiter (5 min) Stimulationen⁸verlängert. Diese Methode war weniger empfindlich als die radioaktive Filtertechnik aber wesentlich vereinfacht. Das zusätzliche Ca^{2 +} Kalzium grüne Fluoreszenz erhebt und die Ca^{2 +} Aufnahme von Mitochondrien kehrt die Fluoreszenz Baseline. Fortlaufende Ergänzungen von Ca^{2 +} wurden vorgenommen, bis die Mitochondrien zur Aufnahme Extramitochondrial Ca^{2 + 9}nicht. Ein Fluoreszenz Mikrotestplatte Leser lässt sich regelmäßig Kalzium grüne Fluoreszenz Berichten.

Nach Ca^{2 +} Akkumulation Mitochondrien depolarisiert, Ca^{2 +} in das Medium abgegeben und begann anzuschwellen. Ca^{2 +}-Mitochondrien Schwellung verwendet wird, um die mPTP Öffnung zeigen ausgelöst. Elektronenmikroskopie und die Abnahme der leichten Extinktion bei 540 nm kann verwendet werden, um die Ca^{2 +}Messen-mitochondriale Schwellung^10,11ausgelöst. Mitochondrien Volumen kann direkt durch nach vorne Winkel Lichtstreuung¹², ermittelt werden, wo sinkt in die Extinktion passive Schwellung der mitochondrialen Matrix widerspiegeln.

Hier zeigen wir die Methodik zur Prüfung der mitochondrialen Ca^{2 +} Rückhaltevermögen und Ca^{2 +}-mitochondriale Schwellung in isolierten Mitochondrien aus SH-SY5Y Zellen ausgelöst.

Protokoll

1. Isolation von Mitochondrien

Hinweis: Alle Lösungen und Geräte sollten auf 0 - 4 ° C vorgekühlt und auf Eis gehalten werden.

1. Samen etwa 3 x 10⁶ SH-SY5Y Zellen pro 10 cm Zelle Kulturschale. Zellkulturen in hoch-Glukose Dulbecco modifizierten Eagle Medium mit 10 % fötalen Rinderserum, Penicillin (100 U/mL)-Streptomycin (100 µg/mL). Bei 37 ° C in einem Inkubator mit 5 % CO₂ über Nacht behalten.
   Hinweis: mindestens 1-2 x 10⁷ SH-SY5Y Zellen für jedes Assay Isolierung erforderlich sind.
2. Entfernen Sie das Medium und waschen Sie die Zellen mit etwa 1 mL Eis kaltem PBS in einer Kulturschale 10 cm Zelle 3 Mal zu.
3. Fügen Sie neue 1 mL Eis kaltem PBS in 10 cm Zelle Kulturschale und kratzen Sie die adhärenten Zellen in eine neue 1,5 mL Tube. Zentrifuge bei 800 X g für 10 min bei 4 ° C.
4. Während der Zentrifugation bereiten Sie 5 mL mitochondriale Isolierung Puffer (250 mM Saccharose, 10 mM KCl, 10 mM HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-Piperazin-Ethanesulfonic Säure), 1,5 mM MgCl₂, 1 mM EDTA) ergänzt mit 50 μL der Protease-Inhibitoren Lager Lösung (100 X Konzentration; 1 EDTA-freie Tablette aufgelöst in 500 µL DdH₂O).
5. Entfernen des Überstands und Aufschwemmen der Pellet mit 1 mL der mitochondrialen Isolierung Puffer. Inkubieren der 1,5 mL Tube für 30 min auf Eis.
6. Lösen Sie die suspendierten Zellen mit einer Glas-Homogenisator (15-25 Schläge) rauf und runter manuell auf Eis.
   Hinweis: Stellen Sie sicher, dass es gibt keine Luftblasen, wenn Zellen homogenisiert werden. Zählen die intakte Zellen und entblößten Kerne von Mikroskop optisch und bestätigen, dass > 90 % Zelle Bruch aufgetreten.
7. Übertragen Sie das Homogenat in einem 1,5 mL-Tube und Zentrifuge bei 1.000 x g für 5 min bei 4 ° C, die Ablagerungen (Kerne und verbleibenden intakten Zellen) zu entfernen.
8. Übertragen den überstand in ein neues 1,5 mL-Tube und Zentrifuge bei 1.000 x g für 5 min 4 ° C.
9. Den überstand zu übertragen, zu einem neuen Schlauch und Zentrifuge bei 14.000 x g für 15 min 4 ° C.
10. Entfernen des Überstands und das Pellet mit Mitochondrien mit 1 mL der mitochondrialen Isolierung Puffer Aufschwemmen.
11. Zentrifugieren Sie die Lösung für 15 min bei 14.000 x g 4 ° C um die Mitochondrien auszufällen.
12. Das daraus resultierende Mitochondrien Pellet muss ständig auf Eis und Nukleinsäuretablette in 50-100 μl KCl Medien (125 mM KCl, 2 mM K₂HPO₄, 1 mM MgCl₂, 20 mM HEPES, 5 mM Glutamat, 5 mM Malate, und 2 μM Rotenon, pH 7,4) entsprechend dem Pellet-Volumen vor jedem Arsch ay.
13. Verwenden Sie 5 μL der mitochondrialen Lösung zur Messung der mitochondrialen Proteinkonzentration von standard BCA-Test, Messung der OD562 mit einer Platte Leser¹³.

2. Bestimmung der mitochondrialen Ca^{2 +} Rückhaltevermögen

1. Bereiten Sie die KCl-Medien und fügen Sie die Ca^{2 +}-Bindung grünen fluoreszierenden Farbstoff, eine Endkonzentration von 0,5 μM vor dem Experiment.
2. 1 mL der isolierten Mitochondrien (0,4 mg/mL) in KCl Medien mit 0,5 μM Ca^{2 +}Transfer-grünen fluoreszierenden Farbstoff in jedem 6-Well-Platte auch verbindlich.
3. Inkubieren Sie die Mitochondrien und die Ca^{2 +}-Bindung grünen fluoreszierenden Farbstoff in der 6-Well-Platte bei Raumtemperatur geschützt vom Umgebungslicht für 1 min. hinzufügen 4 μL Aliquote eines 20 mm CaCl₂ -Lösung (20 mM CaCl₂, 127 mM KCl, 1 mM MgCl₂ 20 mM HEPES, Glutamat 5 mM, 5 mM-Malat, pH 7,4) zu jedem 6-Well-Platte verzichten nun mit Hilfe den automatischen Einstellung 200 Nmol Ca^{2 +}/mg mitochondrialen Proteins einzuführen.
4. Verwenden Sie ein Fluoreszenz-Spektrometer, um die Fluoreszenz-Änderungen zu überwachen alle 3 s 2 min mit einer Wellenlänge von Erregung von 506 nm und einer Emissionswellenlänge von 531 nm. Die Platte ist ausgestattet mit schütteln bei 600 u/min für 3 s zwischen den Lesungen von Software (Abbildung 1) gesteuert.
5. Fügen Sie eine zusätzliche 4 μL aliquoten 20 mM CaCl₂ -Lösung in jede Vertiefung und überwachen den Fluoreszenz Änderungen alle 3 s für 2 min. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis die Fluoreszenz mit der Zeit zunimmt.
   Hinweis: Mitochondrien sind mit der zusätzlichen Ca^{2 +} gekennzeichnet durch die erhöhte Aufnahme Fluoreszenz gefordert. Wenn die mPTP geöffnet wird, steigt die Fluoreszenz mit der Zeit.
6. Interpretieren Sie den Gesamtbetrag von Ca^{2 +} hinzugefügt, bis die mPTP als Ca^{2 +} Rückhaltevermögen öffnet.

3. Ermittlung der Ca ^{2 +}-induzierten mitochondrialen Schwellung

1. Bereiten Sie die KCl-Medien vor dem Experiment.
   1. Übertragen Sie 1 mL isolierte Mitochondrien (0,4 mg/mL) in KCl Medien gut in jedes 6-Well-Platte.
2. Fügen Sie 10 μl 20 mm CaCl₂ wässrige Lösung (500 Nmol/mg mitochondrialen Proteins) in mitochondrialen Proteins mitochondriale Schwellung auslösen.
3. Aufzeichnen den Rückgang der Extinktion bei 540 nm alle 3 s auf einer Mikrotestplatte Reader Software für 10 min (Abbildung 2) gesteuert. Die Fluoreszenz-Änderungen werden durch den Zuzug von gelösten Stoffen durch die innere mitochondriale Membran verursacht.
   Hinweis: Die verminderte Absorption bei 540 nm entspricht den geschwollenen Mitochondrien. Wenn der Leser keine Abnahme der Absorption beachten, kann eine längere Intervall lesen oder Lesezeit übernommen werden.

Ergebnisse

Ca^{2 +} Rückhaltevermögen Vertreter folgendes Ergebnis:
Die Ergebnisse wurden als Fluoreszenz-Werte. Mit der zusätzlichen Impulsen von Ca^{2 +} (200 Nmols/mg mitochondrialen Proteins), die Fluoreszenz durch doppelte über dem Ausgangswert mit der Eröffnung von mPTP erhöht. 5 μM Bongkrekate (BKA), ein Inhibitor von Ca^{2 +}-induzierte mPTP Öffnung oder 1 μM Atractyloside (ATR), Aktivator von Ca^{2 +}-induzierte mPTP Öffnung, wurden in d...

Diskussion

Wir beschrieben hier, ein einfaches und effektives Protokoll für die mitochondriale Ca^{2 +} Retention Kapazität Assay und Ca^{2 +}-mitochondriale Schwellung Assay ausgelöst.

Stellen Sie für die mitochondriale Isolierung sicher, dass alle Materialien und Rohre auf Eis, besonders wenn die Zellen zu homogenisieren. 0,25 % Trypsin-EDTA kann auch verwendet werden, um Zellen aus der Schale für 5 min bei 37 ° c zu lösen Nach 15-25 Schlägen ist es notwendig, die intakte Zellme...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
SH-SY5Y cell line	ATCC (The Global Bioresource Center)	ATCC Number: CRL-2266
Calcium green-5N	Life Technologies	c-3737	Ca2+-binding green fluorescent dye
complete protease inhibitors	Roche Molecular Biochemicals	4693116001
glass homogenizer	Kimble Chase	9885303002
glutamate	Sigma-Aldrich	RES5063G-A7
malate	Sigma-Aldrich	46940-U
rotenone	Sigma-Aldrich	R8875
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
MgCl2	Sigma-Aldrich	00457
K2HPO4	Sigma-Aldrich	V900050
KCl	Sigma-Aldrich	P9541
CaCl2	Sigma-Aldrich	V900266
Varioskan flash instruments	Thermo Scientific	IC100E
Bongkrekate	Biovision	1820-100
atractyloside	Sigma-Aldrich	C4992
high-glucose Dulbecco’s modified Eagle medium	Hyclone	SH30022	4.5 g/L glucose, L-glutamine, without sodium pyruvate
fetal bovine serum	Hyclone	SV30087
penicillin	Sigma-Aldrich	P3032
streptomycin	Invitrogen	11860-038
BCA assay kit	Thermo Scientific	NCI3225CH
PBS	Hyclone	SH30256.01
10 cm cell culture dish	NEST	704001