Mitocondrial Ca2 + retenção capacidade do ensaio e Ca2 +-provocou inchaço mitocondrial do ensaio

Resumo

Este protocolo destina-se a descrever um método para examinar a capacidade de retenção do Ca^{2 +} e Ca^{2 +}- desencadeada mitocondrial inchaço das mitocôndrias isoladas de SH-SY5Y células passo a passo.

Resumo

A produção de ATP por fosforilação oxidativa é a principal função das mitocôndrias. Mitocôndrias em eucariontes superiores também participam citosólico Ca^{2 +} buffer, e a produção de ATP em mitocondrial pode ser mediada por intramitocondrial grátis Ca^{2 +} concentração. Capacidade de retenção do CA^{2 +} pode ser considerada como a capacidade das mitocôndrias de reter cálcio na matriz mitocondrial. Ca^{2 +} pistas intracelulares acumuladas para a permeabilidade da membrana mitocondrial interna, denominado a abertura do poro de transição de permeabilidade mitocondrial (mPTP), menos de 1,5 kDa de peso que leva para o escapamento de moléculas com um molecular. CA^{2 +}-desencadeada mitocôndrias inchaço é usado para indicar a abertura do mPTP. Aqui, descrevemos dois ensaios para examinar a capacidade de retenção do Ca^{2 +} e Ca^{2 +}-provocou inchaço mitocondrial em mitocôndrias isoladas. Depois de certas quantidades de Ca^{2 +} são adicionados, todos os passos podem ser concluídos em um dia e gravados por um leitor de microplacas. Assim, estes dois ensaios simples e eficazes podem ser adoptados para avaliar a Ca^{2 +}-relacionado funções mitocondriais.

Introdução

As mitocôndrias são os principais órgãos celulares para produzir cerca de 95% do ATP usado nas células de mamíferos por fosforilação oxidativa. É relatado que o sequestrado micromolar concentração de Ca^{2 +} pela mitocôndria, a presença de ADP e fosfato inorgânico pode ser usado para fosforilar ADP a síntese de ATP¹. Quando a concentração de citosólico Ca^{2 +} vai acima de um limite, a mitocôndria pode absorção Ca^{2 +} rapidamente e efluxo isso lentamente. Assim, as mitocôndrias funcionamento podem influxo o aumento citosólico Ca^{2 +}. Irrelevante para a participação na fosforilação oxidativa, o mitocondrial Ca^{2 +} também participar os sinais de cálcio citosólico e ativar o mecanismo de apoptose mitocondrial induzindo a abertura do mPTP no interno mitocondrial membrana². Foi amplamente reconhecido que elevação anormal de intracelular Ca^{2 +} pode induzir edema maciça mitocondrial abrindo o mPTP³. Assim, o presente protocolo tem por objetivo avaliar a função mitocondrial através da quantificação da capacidade mitocondrial Ca^{2 +} de retenção e Ca^{2 +}-trigged inchaço mitocondrial.

CA^{2 +} capacidade de retenção é a medição da capacidade das mitocôndrias de cálcio citosólico de captação. As mitocôndrias podem buffer o cálcio citosólico livre e regulam processos celulares de cálcio-dependente pela absorção de cálcio na forma de precipitados inativos. Capacidade prejudicada Ca^{2 +} retenção ocorre em fenômenos de estresse associados com limitação de energia e de^4,de doenças neurodegenerativas até⁵. Mitocôndrias isoladas ou células digitonin-permeabilizado podem ser usadas para identificar a capacidade de Ca^{2 +} de retenção, e a elevada capacidade de acumular Ca^{2 +} por mitocôndrias isoladas com o glutamato additonal e malato não é efectuada pelo procedimento de isolamento mitocondrial⁶. Uma quantia titulada de digitonin deve ser usada para permeabilize as membranas de plasma de diferentes tipos de células. O sal de hexapotassium de Ca^{2 +}-ligação corante fluorescente verde, uma Ca^{2 +}-impermeant-célula visível luz-excitável indicador sensível, tem sido amplamente utilizado⁷. CA^{2 +}-ligação verde tintura fluorescente é um indicador de baixa afinidade e usado para mostrar que intracelular livre Ca^{2 +} concentrações continuarem a subir durante a prolongada de estímulos (5 min)⁸. Este método era menos sensível do que a técnica de filtro radioativo mas foi bastante simplificado. O adicional Ca^{2 +} eleva a fluorescência verde do cálcio e da Ca^{2 +} adopção pelas mitocôndrias retorna a fluorescência de base. Adições sequenciais de Ca^{2 +} foram feitas até as mitocôndrias não conseguiram captação extramitochondrial Ca^{2 + 9}. Um leitor de microplacas de fluorescência pode ser usado para relatar continuamente a fluorescência verde de cálcio.

Após o acúmulo de Ca^{2 +} , mitocôndrias despolarizada, liberado Ca^{2 +} para o meio e começaram a inchar. CA^{2 +}-desencadeada mitocôndrias inchaço é usado para indicar a abertura do mPTP. Microscopia eletrônica e a diminuição da luz absorbância em 540 nm pode ser usado para medir o Ca^{2 +}-desencadeada mitocondrial inchaço^10,11. Volume de mitocôndrias pode ser diretamente determinada pelo ângulo frente espalhamento de luz¹², onde diminui em absorvância reflete passivo inchaço da matriz mitocondrial.

Aqui, podemos ilustrar a metodologia para examinar a capacidade mitocondrial Ca^{2 +} de retenção e Ca^{2 +}-provocou inchaço mitocondrial em mitocôndrias isoladas de SH-SY5Y de células.

Protocolo

1. isolamento de mitocôndrias

Nota: Todas as soluções e equipamentos devem ser pré-resfriado a 0 - 4 ° C e mantidos no gelo.

1. Semente cerca de 3 x 10⁶ SH-SY5Y células por placa de cultura de células de 10 cm. Células de cultura em alta-glicose Dulbecco modificada do meio de águia com 10% de soro bovino fetal, penicilina (100 U/mL)-estreptomicina (100 µ g/mL). Manter a 37 ° C numa incubadora contendo 5% CO₂ durante a noite.
   Nota: pelo menos 1-2 x 10⁷ SH-SY5Y de células são necessárias para cada ensaio de isolamento.
2. Retire o meio e lave as células com cerca de 1 mL de PBS frio de gelo em um prato de cultura de célula de 10cm 3 vezes.
3. Adicionar novo 1 mL de PBS frio gelo em placa de cultura de células de 10 cm e raspar as células aderentes em um novo tubo de 1,5 mL. Centrifugar 800 x g por 10 min a 4 ° C.
4. Durante a centrifugação, prepare-se 5 mL de tampão de isolamento mitocondrial (250 mM sacarose, 10 mM HEPES (ácido de 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazina etanesulfónico), 10 mM KCl, 1,5 mM de MgCl₂, 1 mM EDTA) suplementado com 50 μL de estoque de inibidores de protease solução (concentração de x 100; 1 comprimido de EDTA livre dissolvido em 500 µ l do ddH₂O).
5. Remover o sobrenadante e ressuspender o precipitado com 1 mL de tampão de isolamento mitocondrial. Incube o tubo de 1,5 mL no gelo por 30 min.
6. Lise as células suspensas com um homogeneizador de vidro (traços de 15-25) acima e para baixo manualmente no gelo.
   Nota: Certifique-se de que não há nenhuma bolha quando as células são homogeneizadas. Contar as células intactas e núcleos exposto pode por microscópio visualmente e confirmar que > 90% célula ruptura já ocorreu.
7. Transferi o homogeneizado em um tubo de 1,5 mL e centrifugar a 1.000 x g por 5 min a 4 ° C para remover os detritos (núcleos e células intactas remanescentes).
8. Transferir o sobrenadante para um novo tubo de 1,5 mL e centrifugar a 1.000 x g por 5 min 4 ° C.
9. Transferir o sobrenadante para um novo tubo e centrifugar 14.000 x g por 15 min 4 ° C.
10. Remover o sobrenadante e ressuspender o precipitado que contém mitocôndrias com 1 mL de tampão de isolamento mitocondrial.
11. Centrifugue a solução por 15 min a 14.000 x g 4 ° C para precipitar as mitocôndrias.
12. A pelota de mitocôndrias resultante deve ser mantida no gelo e resuspended em 50-100 μL KCl media (125 mM KCl, 2 mM K₂HPO₄, 1 mM MgCl₂, 20mm HEPES, glutamato de 5mm, malato de 5mm e 2 a rotenona μM, pH 7,4 de acordo com o volume de sedimento antes de qualquer rabo) Ay.
13. Use 5 μL de solução mitocondrial para medir a concentração de proteína mitocondrial por padrão ensaio BCA, OD562 de medição usando um leitor de placa¹³.

2. determinação da mitocondrial Ca^{2 +} capacidade de retenção

1. Preparar a mídia de KCl e adicionar o Ca^{2 +}-ligação corante fluorescente verde a uma concentração final de 0,5 μM antes do experimento.
2. Transferir 1 mL de mitocôndrias isoladas (0,4 mg/mL) em mídia de KCl contendo 0,5 μM Ca^{2 +}-ligação corante fluorescente verde em cada placa de 6 bem.
3. Incubar as mitocôndrias e o Ca^{2 +}-ligação corante fluorescente verde na placa 6-poços em temperatura ambiente protegida da luz ambiente para 1 min. Adicione 4 alíquotas μL de uma solução de CaCl₂ (20 mM CaCl₂, 127 mM KCl, 1 mM MgCl₂ de 20 mM 20 mM HEPES, glutamato de 5mm, malato de 5 mM, pH 7,4) para cada placa de 6 bem usando o automático dispensa configuração apresentar 200 nmol Ca^{2 +}/ mg proteína mitocondrial.
4. Usar um espectrômetro de fluorescência para monitorar as alterações de fluorescência cada 3 s por 2 min, com um comprimento de onda de excitação de 506 nm e um comprimento de onda de emissão de 531 nm. A placa é equipada com tremendo a 600 rpm por 3 s entre leituras controlada por software (Figura 1).
5. Adicionar a alíquota adicional 4 μL da solução de CaCl₂ de 20 mM a cada poço e monitorar as mudanças de fluorescência cada 3 s por 2 min. Repita este passo até que a fluorescência aumenta com o tempo.
   Nota: As mitocôndrias são desafiadas com o adicionado Ca^{2 +} indicado por fluorescência o aumento de gravação. Quando o mPTP abre, a fluorescência aumenta com o tempo.
6. Interprete a quantidade total de Ca^{2 +} adicionado até o mPTP abre como a capacidade de Ca^{2 +} de retenção.

3. determinação de Ca ^{2 +}-induzido por inchaço mitocondrial

1. Prepare a mídia de KCl antes do experimento.
   1. Transferi 1 mL de mitocôndrias isoladas (0,4 mg/mL) em mídia de KCl para cada placa de 6 bem.
2. Adicione 10 μL de solução aquosa de CaCl₂ (500 nmol/mg de proteína mitocondrial) de 20 mM em proteína mitocondrial para acionar o inchaço mitocondrial.
3. Gravar a diminuição da absorbância em 540 nm cada 3 s em um leitor de microplacas controlado por software para 10 min (Figura 2). As alterações de fluorescência são causadas por um afluxo de solutos através da membrana mitocondrial interna.
   Nota: A diminuição da absorbância em 540 nm corresponde à mitocôndria inchadas. Se o leitor não observar uma diminuição na absorção, um longo intervalo de leitura ou tempo de leitura pode ser adotado.

Resultados

Resultados de representante de Ca^{2 +} capacidade de retenção:
Os resultados foram expressos em valores de fluorescência. Com os pulsos adicionais de Ca^{2 +} (proteína mitocondrial nmols/mg 200), a fluorescência aumentada o dobro acima da linha de base com a abertura do mPTP. 5 μM Bongkrekate (BKA), um inibidor de Ca^{2 +}-induzida mPTP abertura, ou 1 μM atractyloside (ATR), um ativador de Ca^{2 +}-induzida mPTP abertura, foram adiciona...

Discussão

Aqui, descrevemos um protocolo simples e eficaz para o mitocondrial Ca^{2 +} retenção capacidade do ensaio e Ca^{2 +}-disparado o ensaio de inchamento mitocondrial.

Para o isolamento mitocondrial, certifique-se de que todos os materiais e os tubos são no gelo, especialmente quando homogeneizando as células. 0,25% do trypsin-EDTA também pode ser usado para destacar células do prato por 5 min a 37 ° C. Depois de 15-25 cursos, é necessário observar a membrana celular inta...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
SH-SY5Y cell line	ATCC (The Global Bioresource Center)	ATCC Number: CRL-2266
Calcium green-5N	Life Technologies	c-3737	Ca2+-binding green fluorescent dye
complete protease inhibitors	Roche Molecular Biochemicals	4693116001
glass homogenizer	Kimble Chase	9885303002
glutamate	Sigma-Aldrich	RES5063G-A7
malate	Sigma-Aldrich	46940-U
rotenone	Sigma-Aldrich	R8875
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
MgCl2	Sigma-Aldrich	00457
K2HPO4	Sigma-Aldrich	V900050
KCl	Sigma-Aldrich	P9541
CaCl2	Sigma-Aldrich	V900266
Varioskan flash instruments	Thermo Scientific	IC100E
Bongkrekate	Biovision	1820-100
atractyloside	Sigma-Aldrich	C4992
high-glucose Dulbecco’s modified Eagle medium	Hyclone	SH30022	4.5 g/L glucose, L-glutamine, without sodium pyruvate
fetal bovine serum	Hyclone	SV30087
penicillin	Sigma-Aldrich	P3032
streptomycin	Invitrogen	11860-038
BCA assay kit	Thermo Scientific	NCI3225CH
PBS	Hyclone	SH30256.01
10 cm cell culture dish	NEST	704001